馬 帥，李金積，趙 明，王 媛，劉樞清，李 超

（1.青島市動物疫病預(yù)防控制中心，山東青島 266100；2.青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266114；3.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

布魯氏菌?。˙rucellosis），簡稱布病，是由布魯氏菌（Brucella）引起的一種人獸共患傳染病，以發(fā)熱和流產(chǎn)為主要特征，流行于170 多個(gè)國家和地區(qū)[1]，對畜牧業(yè)發(fā)展和人畜健康構(gòu)成較大威脅[2]，我國將其列為二類動物疫病。本文重點(diǎn)介紹布病的病原學(xué)、流行病學(xué)，及診斷技術(shù)和疫苗的研究進(jìn)展，旨在為布病的防控政策和凈化措施的制定、新的診斷技術(shù)和疫苗的開發(fā)提供參考。

1 病原學(xué)

布魯氏菌是革蘭氏陰性兼性厭氧菌，屬兼性胞內(nèi)病原體[3]。根據(jù)其生化特性、抗原成分、宿主特異性和對宿主致病性將布魯氏菌分為10個(gè)種，包括羊種布魯氏菌、綿羊種布魯氏菌、牛種布魯氏菌、豬種布魯氏菌、犬種布魯氏菌、沙林鼠種布魯氏菌、田鼠種布魯氏菌、鯨種布魯氏菌、鰭種布魯氏菌以及從人類乳腺中分離到的人布魯氏菌[4-6]。

羊種、綿羊種、牛種、豬種、犬種和鼠種布魯氏菌為經(jīng)典種，共有20個(gè)生物型，即羊種布魯氏菌（3個(gè)生物型），綿羊種布魯氏菌，牛種布魯氏菌（9個(gè)生物型），豬種布魯氏菌（5個(gè)生物型），犬種布魯氏菌、沙林鼠種布魯氏菌各1個(gè)生物型[7]。經(jīng)典種中羊種布魯氏菌對人類的感染性最強(qiáng)[5]。布魯氏菌對外界環(huán)境抵抗力較強(qiáng)，但對熱和一般化學(xué)消毒藥比較敏感。

2 流行病學(xué)

布病主要流行于中東、拉丁美洲、亞洲、非洲和地中海盆地等牛羊養(yǎng)殖集中但經(jīng)濟(jì)技術(shù)相對落后的地區(qū)[8]，每年約有50 萬新發(fā)人間病例，造成的經(jīng)濟(jì)損失約30 億美元[9-10]。2004—2015年，我國家畜布病發(fā)病率居高不下，發(fā)病家畜主要以綿羊和牛為主，發(fā)病數(shù)量較多的省份有內(nèi)蒙古、新疆、陜西、山西、湖北、山東和黑龍江等，其中內(nèi)蒙古最為嚴(yán)重[2]。

近年來，隨著我國家畜飼養(yǎng)量的增加，人間布病發(fā)病數(shù)呈快速上升趨勢[11]。據(jù)國家衛(wèi)健委官網(wǎng)信息，2019年1—10 月我國共報(bào)告布病發(fā)病40 743 例，死亡1 例，國內(nèi)布病發(fā)病總數(shù)已超2018年全年。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、國家衛(wèi)生計(jì)生委印發(fā)了《國家布魯氏菌病防治計(jì)劃（2016—2020年）》，為布病防控確立了目標(biāo)并制定了原則和策略，不斷推進(jìn)全國布病防治、監(jiān)測和凈化，但受疫源分布廣、活畜流動性大、基層防疫體系薄弱、淘汰病畜難度大、防治經(jīng)費(fèi)投入不足等因素影響，我國布病疫情仍然嚴(yán)重，防控形勢十分嚴(yán)峻[9]。

布病的傳染源主要是患病動物和帶菌者（包括野生動物），此外被布魯氏菌污染的土壤、水源、病畜肉以及乳汁都可造成人畜的感染[12-13]。本病的易感動物范圍廣泛，主要包括羊、牛、豬、犬、馬、鹿、駱駝和鼠等，同時(shí)人也易感；傳播途徑主要包括皮膚黏膜、消化道、呼吸道等。本病潛伏期短則一周，長則數(shù)月甚至半年以上[14-15]。感染本病的母畜主要臨床癥狀為妊娠后期發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)、弱胎或死胎[16]；感染公畜臨床表現(xiàn)為睪丸炎、附睪炎和運(yùn)動障礙[5]；人感染布病的潛伏期為2 周左右，初期癥狀與流感類似，主要表現(xiàn)為持續(xù)發(fā)熱、多汗、無力和關(guān)節(jié)疼痛等，后期可能出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎，嚴(yán)重者喪失勞動能力[17-18]。

3 診斷技術(shù)研究進(jìn)展

3.1 細(xì)菌學(xué)診斷技術(shù)

布魯氏菌的分離培養(yǎng)是診斷布病的最基礎(chǔ)方法，也是檢測布病的“金標(biāo)準(zhǔn)”[19]。但由于布魯氏菌對環(huán)境和營養(yǎng)要求較高，還受動物感染階段、樣本中病原體數(shù)量及檢測前抗生素使用等因素影響，常導(dǎo)致細(xì)菌污染，不能及時(shí)做出診斷而使病情加重[20-22]。

布魯氏菌的分離培養(yǎng)操作過程復(fù)雜，需要專業(yè)技術(shù)人員在生物安全三級以上實(shí)驗(yàn)室操作[23]，分離操作過程存在較高的生物安全風(fēng)險(xiǎn)。因此，布魯氏菌的分離培養(yǎng)一般不用于現(xiàn)場疫情的篩查和臨床快速檢測[5，24]，僅用于個(gè)別動物的輔助診斷和流行病學(xué)追蹤調(diào)查等[5，12，25]。

3.2 血清學(xué)診斷技術(shù)

目前布病的血清學(xué)檢測種類較多，但在國際上尚未有標(biāo)準(zhǔn)方法，常用的有常規(guī)血清學(xué)試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和熒光偏振試驗(yàn)（FPA）等。

3.2.1 常規(guī)血清學(xué)診斷技術(shù) 試管凝集試驗(yàn)（SAT）、虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT）和全乳環(huán)狀試驗(yàn)（MRT）是3種常用的血清學(xué)試驗(yàn)。SAT于1897年開始應(yīng)用，目前在發(fā)達(dá)國家已經(jīng)停用，但在我國仍然是使用廣泛的布病檢測方法[23]，該方法對IgM、IgG 敏感性較高，可用于布病的早期診斷，也可用于疫苗免疫抗體的檢測，對急性布病也有較好的檢測效果[20，26]。但該方法操作相對繁雜、耗時(shí)較長，不適用于現(xiàn)場快速檢測[21，27]。李翠等[28]將SAT 改進(jìn)為微量試管凝集試驗(yàn)（MSAT），具有稀釋方法簡便、省時(shí)省力、節(jié)約抗原血清等優(yōu)點(diǎn)。RBPT 是一種經(jīng)典的血清凝集試驗(yàn)，其抗原是將滅活布魯氏菌菌體經(jīng)虎紅染料染色后懸浮于pH 為3.7 左右的乳酸緩沖液中制成。該方法敏感性較高、價(jià)格便宜、操作方便、檢測快速，但特異性和準(zhǔn)確性一般，受試驗(yàn)溫度和凝集時(shí)間影響，不易準(zhǔn)確判定結(jié)果[20，24]，故常用于動物群體布病的普查和人布病的初篩及監(jiān)測，而不作為確診試驗(yàn)[12-13]。MRT 主要通過檢測乳樣中的布魯氏菌抗體來篩查泌乳期牛群的布病，其本質(zhì)是抗原抗體反應(yīng)，當(dāng)奶樣中存在布魯氏菌抗體時(shí)，與染成紅色的布魯氏菌抗原形成抗原抗體復(fù)合物，轉(zhuǎn)移至乳脂層形成紫紅色乳脂環(huán)[5，22]。此方法操作簡便、成本較低，常用于奶牛布病的現(xiàn)場篩查，但其敏感性較差，如檢測牛群的大量乳樣或者奶樣中含有初乳時(shí)，可能導(dǎo)致假陽性反應(yīng)[27]。

3.2.2 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT） CFT 相對于常規(guī)血清學(xué)檢測方法，具有敏感度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，是目前布病血清學(xué)診斷中最準(zhǔn)確的方法之一[12，21]。此外，CFT 是國際貿(mào)易指定試驗(yàn)，也是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）公認(rèn)的確診方法，廣泛應(yīng)用于牛、羊、人布病的診斷，由于豬自身補(bǔ)體能干擾豚鼠補(bǔ)體，因此不適用于豬布魯氏菌的檢測[29]。CFT 的缺點(diǎn)是對試驗(yàn)條件要求較高、操作過程繁瑣、檢測結(jié)果受主觀因素影響較大，因此不適用于基層和現(xiàn)場檢測[5，30]。

3.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） ELISA 方法的特點(diǎn)是簡便快速、特異性強(qiáng)、所需樣品少且過程易標(biāo)準(zhǔn)化等，不僅可以用于大量樣本的篩查，也可作為確診試驗(yàn)[31-32]。ELISA 是國際貿(mào)易指定試驗(yàn)，于2004年被OIE 列為診斷牛種布病的推薦方法[31，33]。但是ELISA 成本較高、對試驗(yàn)條件要求高，需在國家生物二級實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，不適用于基層和現(xiàn)場快速檢測[21，34]。

3.2.4 熒光偏振試驗(yàn)（FPA） FPA 通過將熒光素標(biāo)記的小分子抗原加到待檢血清或其他可能存在抗體的液體中，若存在相應(yīng)抗體，抗體與標(biāo)記抗原結(jié)合后會降低轉(zhuǎn)速，通過儀器測量減速便可確定相應(yīng)抗體的存在[35]。FPA 方法屬于同源性分析，無需將分離物分離，因而簡便快捷，是國際貿(mào)易指定試驗(yàn)。FPA 診斷布病的敏感性和特異性與cELISA 相近[36]，但檢測更快速，可在2 min（血清）或15 s（全血）內(nèi)測定抗體含量。FPA 在某些發(fā)達(dá)國家已經(jīng)大量應(yīng)用，成為檢測動物布病快速、高通量的新技術(shù)，主要用于動物群體布病的檢疫、篩查和凈化[37]。

3.3 分子生物學(xué)診斷技術(shù)

3.3.1 PCR 檢測技術(shù) PCR 技術(shù)因其檢測特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便等優(yōu)勢而在布病的檢測和種型鑒別等方面應(yīng)用日益廣泛[20，38]。目前主要的PCR 方法有常規(guī)PCR、多重PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 等。20 世紀(jì)90年代常規(guī)PCR 開始用于布病的診斷，該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，檢測時(shí)間相對較短，可用于大量樣品的檢測[17，39]。常規(guī)PCR 可以作為人布病的常規(guī)檢測方法，適用于臨床癥狀明顯但血清學(xué)檢測為陰性的患者[40]。多重PCR 在同一反應(yīng)體系內(nèi)，加入2對或2 對以上的引物，可以同時(shí)檢測多種病原，除了具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)外，還有準(zhǔn)確性高、經(jīng)濟(jì)便捷等優(yōu)點(diǎn)[24]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是目前確定樣品DNA 拷貝數(shù)最敏感、最準(zhǔn)確的方法之一，實(shí)現(xiàn)了DNA 或RNA 模板的精確定量，具有高度特異性、敏感性和可重復(fù)性。相比其他PCR 方法，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 操作簡便、不需電泳步驟，縮短了檢測時(shí)間[5，41]。但由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 所需設(shè)備及試劑比較昂貴、對試驗(yàn)人員技能要求較高，不適用于基層推廣[5]。

3.3.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP） LAMP診斷布病，是針對布魯氏菌的特異性基因序列設(shè)計(jì)引物，通過先擴(kuò)增再分析的模式進(jìn)行病原檢測[24]。但LAMP 技術(shù)不需要苛刻的試驗(yàn)條件和專業(yè)的儀器設(shè)備，其結(jié)果判定通過肉眼可直接觀察，整個(gè)檢測過程可在1 h 內(nèi)完成，適合在布病的基層防控工作中使用[42]。

4 疫苗研究進(jìn)展

布魯氏菌疫苗的研究最早開始于20 世紀(jì)，早期曾使用滅活疫苗用于人和動物的布病防控，后被免疫效果更好的弱毒疫苗取代[43]。至今，尚無國際認(rèn)可的針對人類的布病疫苗，很多國家對人類使用疫苗免疫存在異議。目前對于動物布病的防控，主要使用的是弱毒活疫苗。此外，基因缺失疫苗、DNA 疫苗以及重組亞單位疫苗等新型疫苗處在研發(fā)試驗(yàn)階段。

4.1 弱毒活疫苗

因活疫苗可以有效刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，產(chǎn)生持久良好的保護(hù)效果，因此目前大部分成功應(yīng)用的疫苗均為弱毒活疫苗。如牛種布魯氏菌S19 疫苗、粗糙型牛種布魯氏菌RB51 疫苗、羊種布魯氏菌Rev1 疫苗和豬種布魯氏菌S2 疫苗等。

4.1.1 牛種布魯氏菌S19 疫苗 S19 疫苗在我國稱為A19 疫苗，主要用于奶牛的布病預(yù)防[44]。S19 菌種最初是1923年從美國一牛場分離并通過實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)而獲得[45]。目前國際上使用的S19 疫苗是由美國科學(xué)家篩選到的對赤蘚糖醇敏感的菌株，由于菌株ery基因缺失，使毒力進(jìn)一步減弱、安全性更高[46-47]。S19 疫苗的生產(chǎn)和使用需要穿戴必要的防護(hù)裝備，但近年來仍有疫苗生產(chǎn)和接種過程中造成人員感染的事件發(fā)生[8，48]。因此，對S19 疫苗的研究方向主要是對其進(jìn)行基因改造，既保留其免疫原性又能降低其毒力[49]。

4.1.2 粗糙型牛種布魯氏菌RB51 疫苗 RB51疫苗菌株是19 世紀(jì)80年代末由美國科學(xué)家研制的粗糙型突變株[43]。RB51 疫苗對牛的安全性比S19 疫苗高，但對懷孕母牛靜脈注射疫苗仍可引起25%的個(gè)體出現(xiàn)早產(chǎn)現(xiàn)象，且仍能造成人的感染[49]。此外，RB51 菌株具有利福平抗性[50]，而利福平卻是治療布病最有效的藥物之一[51]，因此RB51 疫苗的使用不利于布病的抗生素治療。

4.1.3 羊種布魯氏菌Rev.1 疫苗 Rev.1 疫苗菌株是美國科學(xué)家將羊種布魯氏菌6056 野毒株在鏈霉素抗性培養(yǎng)基上反復(fù)傳代獲得的光滑型變異株，主要用于綿羊及山羊的布病防控[51-52]。Rev.1疫苗相比S19 疫苗提供的免疫保護(hù)更強(qiáng)，抗體持續(xù)時(shí)間更長[53]，但其毒力也比較強(qiáng)[46]。研究表明，采用黏膜免疫方式接種Rev.1 疫苗可以到達(dá)與皮下接種相近的免疫效果[43]。但黏膜免疫方式的開放性，增加了操作人員感染風(fēng)險(xiǎn)[54]。

4.1.4 豬種布魯氏菌S2 疫苗 S2 疫苗菌株是中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所由進(jìn)口母豬流產(chǎn)胎兒中分離的布魯氏菌，經(jīng)傳代培養(yǎng)獲得的光滑型弱毒株[43，55]。S2 疫苗毒力較S19 和Rev.1 疫苗弱，對羊、牛、豬均能產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)，其最大的優(yōu)點(diǎn)是通過口服接種方式不會引起母畜流產(chǎn)[8，56]。S2 疫苗除口服免疫方式外，還可以通過肌肉注射、皮下注射和黏膜免疫等方式接種羊、牛、豬以及牦牛等動物，但注射方式不能用于牛、小尾寒羊和懷孕母畜[46]。

4.2 新型疫苗

隨著分子生物學(xué)及重組DNA 技術(shù)的發(fā)展，研發(fā)新型疫苗成為近年來的研究熱點(diǎn)。

4.2.1 基因缺失疫苗 基因缺失疫苗的安全性高，因其遺傳背景清楚，可以通過病原學(xué)和血清學(xué)方法區(qū)分疫苗免疫和野毒感染[43]。目前鑒定出的布魯氏菌毒力基因已經(jīng)超過180個(gè)，這為基因缺失疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)[57]。研究結(jié)果表明，疫苗產(chǎn)生的保護(hù)力與其毒力正相關(guān)。因此在疫苗研發(fā)過程中，可以綜合考慮疫苗的安全性、毒力及保護(hù)力等因素，對分離野毒株、強(qiáng)毒株進(jìn)行基因缺失或者對現(xiàn)有活疫苗進(jìn)行優(yōu)化[46]。

4.2.2 DNA 疫苗 布魯氏菌屬于胞內(nèi)寄生菌，機(jī)體的細(xì)胞免疫是控制其感染的關(guān)鍵，因此布病DNA 疫苗的候選分子主要為能刺激T 細(xì)胞引起細(xì)胞免疫的分子[58]。DNA 疫苗缺點(diǎn)是免疫效果差且單獨(dú)使用不易誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答[59]，其用于人和動物的具體效果還有待驗(yàn)證，目前尚無DNA 疫苗能完全取代弱毒苗[47]。

4.2.3 重組亞單位疫苗 重組亞單位疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比，具有安全性高、抗原成分單一、常規(guī)血清學(xué)方法可以鑒別等優(yōu)點(diǎn)[17，58]。2010年Kazak等[60]利用L7/L12 制備的亞單位疫苗在臨床上誘導(dǎo)了Th1 型免疫應(yīng)答，但重組亞單位疫苗研發(fā)成本較高、生產(chǎn)工藝復(fù)雜、免疫效果不佳[4]。為增強(qiáng)免疫效果，可將幾個(gè)蛋白或多個(gè)有效的多肽進(jìn)行重組，該方法可以提高其免疫原性、增強(qiáng)其免疫效果[61]。目前布魯氏菌重組亞單位疫苗用于動物免疫的試驗(yàn)不多，研究尚處初級階段[46]。

5 討論

目前，全球范圍內(nèi)布病疫情呈反彈趨勢，隨著畜牧業(yè)的集約化發(fā)展，以及牛羊及其產(chǎn)品的跨區(qū)域頻繁調(diào)運(yùn)，我國布病疫情雖然維持相對穩(wěn)定水平，但每年總體發(fā)病數(shù)量仍然較高。國內(nèi)外針對布病的診斷技術(shù)方法較多，目前主要采取多法并存、相互補(bǔ)充的方式，尚無能夠獨(dú)立確診布病的方法。此外，建立能夠區(qū)分疫苗免疫與自然感染的布病鑒別診斷技術(shù)對于布病的凈化及控制具有較為重要的意義。

布病的防控要堅(jiān)持免疫預(yù)防為主的策略，但現(xiàn)有疫苗各有優(yōu)缺點(diǎn)，難以完全控制疫情發(fā)生，部分疫苗還會干擾后期實(shí)驗(yàn)室診斷。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在對布魯氏菌致病性及免疫原性深入研究的基礎(chǔ)上，期待能夠出現(xiàn)靈敏性高、特異性強(qiáng)、高效便捷且易推廣的診斷技術(shù)。同時(shí)加強(qiáng)各類新型疫苗研發(fā)，研制出安全性高、副作用低、免疫效果好的疫苗，為布病的控制和凈化服務(wù)。