金紅 莫迪 李夢雨 楊嵐 張黎 武艷 季洪良 富宏然

(1牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院檢驗科，黑龍江 牡丹江 157011；2 牡丹江醫(yī)學院第一臨床醫(yī)學院；牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院 3眼科；4科研科； 5牡丹江醫(yī)學院醫(yī)藥研究中心)

根據(jù)組織學特征肺癌可分為非小細胞肺癌和小細胞肺癌。雖然空氣污染、煙草煙霧等多種因素都能增加肺癌的發(fā)病率，但肺癌形成的機制尚不清楚〔1,2〕。轉移是癌癥的致死特征之一，約占人類癌癥死亡的90%〔3〕，肺癌轉移是一個復雜過程，包括細胞遷移、局部浸潤和播散，阻斷其中步驟之一能夠有效地防止繼發(fā)性腫瘤在體內擴散〔4,5〕。受體酪氨酸激酶(RTKs)為細胞增殖、分化和遷移的主要調控因子〔6〕。抑制酪氨酸蛋白激酶受體(Eph)代表最大的RTKs家族，并與ephrins配體相互作用。研究證實RTKs可參與腫瘤生長、轉移和新血管的形成〔7,8〕。本研究用小干擾RNA(siRNA)沉默EphA7，研究其對非小細胞肺癌NCI-H1975細胞遷移和侵襲能力的影響及其作用機制。

1 資料與方法

1.1一般材料 人肺腺癌NCI-H1975細胞株購自中國上海中國科學院生物化學與細胞生物學研究所，10%胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司，轉染試劑盒細胞凋亡試劑購自美國Promega公司，CCK8檢測試劑盒購自中國海門碧云天生物技術研究所，抗EphA7抗體、抗B細胞淋巴瘤(Bcl)-2抗體、抗Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體、抗蛋白酪氨酸磷酸酶(PTEN)抗體、抗磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體、抗蛋白激酶B(AKT)抗體和抗磷酸化(p)-AKT抗體購自美國Abcam。

1.2細胞培養(yǎng)、轉染與分組 NCI-H1975細胞復蘇后，待細胞生長到一定數(shù)量后，0.25% 胰酶消化，用含10%血清的二甲基亞砜(DMSO)培養(yǎng)基重懸細胞。計數(shù)以后調整細胞濃度為5×105個/ml，按每孔0.1 ml接種于96孔板上，37℃、5%CO2條件進行培養(yǎng)。將NCI-H1975細胞分為3組，抑制組和NC組分別轉染EphA7抑制劑和EphA7-NC,空白對照組不轉染，48 h后收集細胞。

1.3噻唑藍(MTT)法檢測細胞增殖 取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞，0.25%胰蛋白酶消化，計數(shù)，將細胞以5×105個/ml接種于96孔培養(yǎng)板中，然后向其中加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁生長并達80%時，每孔加入10 μl MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，吸去孔內培養(yǎng)液，每孔加入100 μl DMSO置于搖床上低速震蕩10 min，然后在490 nm波長下用酶標儀測定每個樣本的吸光度(OD)值，每個樣品重復做3次。

1.4實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測EphA7 mRNA的表達 從每個樣品中提取總RNA(1 μg)利用逆轉錄酶(M-MLV)可生成cDNA。使用SYBR Green PCR檢測系統(tǒng)進行檢測。EphA7引物序列：上游5′-CTAATGTTGGATTGTTGGCAAAAG-3′，下游5′-TTGATCCAGAAGAGGGCTTATTG-3′；內參GAPDH引物序列：上游 5′-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3′，下游5′-TCCACCACCCAGTTGCTGTA-3′。反應條件：95℃15 s，60℃ 30 s和72℃30 s，40個循環(huán)。設置3個復孔，數(shù)據(jù)用Sequence detection software1.3系統(tǒng)處理，用2-ΔΔCt給出EphA7 mRNA的相對值。

1.5用末端轉移酶的dUTP缺口末端標記(TUNEL)染色法檢測細胞凋亡 細胞用4%多聚甲醛在室溫下固定30～60 min，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，用含0.1% Triton X-100的枸櫞酸鈉緩沖液浸透，冰浴孵育2 min，用PBS洗滌2次，加入50 μl原位凋亡檢測試劑盒的TUNEL檢測液，細胞核與4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色，于37℃下避光孵育60 min，用PBS洗滌3次，用抗熒光淬滅封片液封片后在熒光顯微鏡下進行觀察，激發(fā)光波長范圍450～500 nm，發(fā)射波長范圍515～565 nm(綠色熒光)，熒光顯微鏡下計數(shù)細胞總數(shù)和TUNEL陽性細胞數(shù)，并計算細胞凋亡率(凋亡陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù))。

1.6采用 Transwell實驗檢測細胞侵襲與遷移 (1)細胞在37℃孵育24 h后收集各組處理后的細胞，制備細胞懸液，并將濃度為5×105個/ml細胞接種到Transwell小室中，向小室內加入含有10%胎牛血清培養(yǎng)液，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，用棉簽擦去基質膠和上室內沒有被侵襲的細胞，棄掉下室液體，下室已經(jīng)被侵襲的底層細胞用95%乙醇固定，0.2%結晶紫染色1 h，純水輕輕洗小室底部，顯微鏡下每孔取左上、右上、中、左下、右下5個視野拍照(固定位置，排除主觀選擇因素)，對圖片上被染色細胞進行計數(shù)。(2)細胞在37℃孵育24 h后收集各組處理后的細胞，制備細胞懸液，并將濃度為5×105個/ml細胞接種到Transwell小室中，上層室無血清，底部加入含有10%胎牛血清培養(yǎng)液，接著在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，用棉簽將上層沒有被侵襲的細胞清除，棄掉下室液體，下室已經(jīng)被侵襲的底層細胞用95%乙醇固定，0.2%結晶紫染色1 h，用純水輕輕洗小室底部，顯微鏡下每孔取左上、右上、中、左下、右下5個視野拍照(固定位置，排除主觀選擇因素)，對圖片上被染色細胞進行計數(shù)。

1.7使用蛋白印跡法檢測信號通路蛋白表達水平 將藥物處理后的細胞收集加入裂解液，各組提取的總蛋白樣品30～90 μg在10%～15%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，將蛋白質從凝膠轉印到硝酸纖維素膜，加入封閉液(5%脫脂奶粉)，浸泡被轉印膜，室溫反應1 h，來封閉轉印膜上的一些非特異性蛋白質的潛在結合位點，防止發(fā)生非特異性反應；轉移結束后，斷開電源將膜取出，割取待測膜條做免疫印跡；然后用第一抗體在4℃孵育過夜(抗PTEN抗體、抗GAPDH抗體、抗AKT抗體和抗p-AKT抗體)，棄一抗，用0.01 mol/L包含0.5% Tween20的PBS分別洗膜，10 min×3次，振蕩；加入熒光標記的二抗溶液，室溫下反應1 h，保持平緩搖動；棄二抗，用0.01 mol/L PBS洗膜，10 min×4次，振蕩。電化學發(fā)光(ECL)顯色：將膜浸于ECL發(fā)光液中，避光顯色3 min，將膜用濾紙吸干，以β-actin作為內參對照，用Tanon5200全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)進行掃描，分析目標條帶的灰度值。

1.8統(tǒng)計學分析 采用SPSS16.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組EphA7 mRNA及蛋白表達 與空白對照組比較，抑制組EphA7 mRNA和蛋白表達水平明顯減少(P<0.05，P<0.01)，見表1，圖1。

表1 各組EphA7 mRNA及蛋白表達水平

與空白對照組比較：1)P<0.05,2)P<0.01；下表同

圖1 各組EphA7蛋白表達水平

2.2抑制EPHA7表達對各組細胞增殖抑制作用 與空白對照組比較，抑制組細胞活力明顯降低(P<0.01)，細胞凋亡率明顯增加(P<0.01)，見圖2，表2。

圖2 抑制EphA7表達對各組細胞凋亡的影響(×100)

表2 抑制EphA7表達對各組細胞活力及細胞凋亡率的影響

2.3抑制EphA7表達對各組細胞的侵襲和遷移的影響 與空白對照組比較，抑制組的侵襲和遷移的細胞數(shù)明顯較少(均P<0.05)，見表3。

表3 抑制EphA7表達對各組細胞的侵襲和遷移的影響

2.4抑制EphA7表達對各組細胞信號通路蛋白(AKT、p-AKT和PTEN)表達水平的影響 與空白對照組比較，抑制組的PTEN蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)，p-AKT蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，總AKT蛋白差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4、圖3。

表4 抑制EphA7表達對各組細胞信號通路蛋白表達水平的影響

1～3:空白對照組，NC組，抑制組圖3 抑制EphA7表達對各組細胞的信號通路蛋白表達水平的影響

3 討 論

目前，肺癌晚期患者病死率較高，與肺癌晚期惡性腫瘤細胞強大的侵襲和轉移能力有關。研究發(fā)現(xiàn)，Eph受體和ephrin配體調控是腫瘤生長、轉移和不良結局的關鍵〔9～11〕，現(xiàn)已證實EphA7在腎血管系統(tǒng)中高度表達，EphA7的表達在肺癌組織中也被轉錄激活〔12〕，但很少有研究闡明EphA7在腫瘤致病性中的作用，本研究首次證明了沉默EphA7可以抑制NCI-H1975細胞的細胞活力和細胞的遷移與侵襲，并在NCI-H1975細胞中通過上調PTEN抑制AKT信號通路。

在正常情況下，機體內的細胞分裂和增殖受到信號轉導通路的級聯(lián)調控，如果信號轉導通路中的促進生長和抑制生長的平衡作用遭到破壞，就會導致細胞的增殖失控和惡性轉移。目前細胞中的膜受體Eph(ras-MAPK)信號轉導通路、蛋白酪氨酸激酶信號傳導及轉錄激活蛋白(JAK-STAT)信號轉導通路和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/AKT/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號轉導通路在細胞增殖失控與惡性轉移中起重要作用，與惡性腫瘤晚期的侵襲和轉移密切相關。信號通路調控異常與腫瘤發(fā)生如細胞遷移和侵襲等密切相關，是目前腫瘤治療的靶點，對信號通路進行有效的調節(jié)是治療腫瘤的關鍵。AKT/mTOR/STAT3信號通路在調節(jié)癌細胞生長、侵襲和凋亡中起重要作用〔13〕。AKT的活化減少，從而抑制信號通路達到抑制細胞生長和增殖的作用，降低了癌細胞增殖和凋亡抵抗。PI3K/AKT通路是癌癥發(fā)展的一個重要信號通路和代謝途徑。

本研究結果表明，EphA7的沉默下調了非小細胞肺癌細胞中PTEN-AKT信號通路。此外，siEphA7作為腫瘤抑制因子調節(jié)細胞侵襲和遷移。