劉瑤 韓影 許麗雅 趙雅寧 劉宇 劉俊杰 李建民

(華北理工大學(xué)，河北 唐山 063000)

腦缺血已經(jīng)成為嚴(yán)重危害中老年人群生命安全和生活質(zhì)量的嚴(yán)重疾病，由于大腦對(duì)氧的需求量比較大，比其他器官更容易產(chǎn)生再灌注損傷〔1〕，所以研究怎樣減輕缺血再灌注損傷對(duì)治療腦缺血具有十分重要的意義。缺血后處理是指在缺血后再灌注早期對(duì)缺血組織進(jìn)行反復(fù)、短暫性缺血再灌注處理，使組織對(duì)缺血產(chǎn)生耐受性，從而減輕再灌注損傷，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)缺血后處理可以減少梗死面積、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能,是缺血再灌注損傷較有力的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制,在臨床上缺血性心、腦及外周血管疾病的防治具有良好的應(yīng)用前景。近年來自噬在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用及其作用機(jī)制受到國內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。靳奧潔等〔2〕通過對(duì)大鼠腦缺血再灌注模型研究，指出自噬參與腦缺血再灌注損傷的過程。適度自噬可以發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，而過度自噬引起自噬性細(xì)胞死亡。腦缺血后處理作為一種新型的腦保護(hù)機(jī)制，其明顯減輕了腦缺血再灌注損傷，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)缺血后處理對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用可能與蛋白激酶途徑、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑、炎癥等有關(guān)〔3～5〕，但其與自噬之間的聯(lián)系目前尚不清楚，故本文通過檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ 的表達(dá)變化，探討腦缺血后處理的腦保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 成年健康雄性SD大鼠72只，10～12周齡，體重(300±50)g，來自華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK(京)2009-003；清潔級(jí)，自由飲食，室溫飼養(yǎng)。

1.2主要試劑與儀器 兔抗Beclin1多克隆抗體、兔抗LC3多克隆抗體、兔抗β-actin多克隆抗體由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供。免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。Olympus光學(xué)顯微鏡由日本Olympus公司提供。Nikon攝影生物光學(xué)顯微鏡和Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)為日本株式會(huì)社尼康產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1動(dòng)物分組和造模 將72只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字法分為假手術(shù)組(Sham組)、腦缺血再灌注模型組(CIR組)、腦缺血后處理組(CIP組)，每組24只。采用改良的Pulsinelli四血管閉塞法〔6〕建立大鼠全腦缺血模型。術(shù)后24 h后用無創(chuàng)動(dòng)脈夾同時(shí)夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈15 min，大鼠全腦缺血成功判斷標(biāo)準(zhǔn)為：大鼠昏迷、翻正反射消失、雙側(cè)瞳孔放大、眼睛顏色發(fā)白。15 min后大鼠恢復(fù)再灌注，放回籠中單獨(dú)飼養(yǎng)直至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)留取CIR組大鼠標(biāo)本。CIP組大鼠首先同CIR組大鼠一樣采用改良的Pulsinelli四血管閉塞法制作大鼠全腦缺血模型，然后在完全恢復(fù)再灌注前給予短暫的再灌注/缺血處理，時(shí)間各15 s，重復(fù)3次，于恢復(fù)再灌注的相應(yīng)用時(shí)間點(diǎn)處死大鼠留取本實(shí)驗(yàn)大鼠腦組織標(biāo)本。

1.3.2蘇木素-伊紅(HE)染色 在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，開胸，暴露心臟，穿刺主動(dòng)脈后，注射4%的多聚甲醛250～300 ml，斷頭取腦，于4%多聚甲醛固定腦組織中。常規(guī)包埋蠟塊。連續(xù)冠狀切片，片厚約為4 μm，常規(guī)脫蠟至水，經(jīng)HE染色。光學(xué)顯微鏡高倍鏡(×400)下隨機(jī)觀察各時(shí)間點(diǎn)每組均隨機(jī)數(shù)字表法選取的切片，采用Motic6.0 數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像采集分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)每個(gè)視野的存活細(xì)胞，取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.3免疫組織化學(xué)方法 采用SP法。常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫中浸泡，高壓修復(fù)抗原；滴加一抗Beclin-1、LC3-Ⅱ(1∶200)，濕盒中過夜；磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后滴加二抗PV6001，放于37℃溫箱孵育；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液顯色，梯度酒精脫水，透明封片。Beclin-1、LC3-Ⅱ陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)：光學(xué)顯微鏡(40×10倍)下觀察腦組織切片，Olympus攝影顯微鏡計(jì)數(shù)海馬區(qū)不重疊視野的陽性細(xì)胞，取其均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.4Western 印跡 無須進(jìn)行灌注，直接于冰上斷頭取腦，剝離出內(nèi)部雙側(cè)似月牙形狀的海馬，放置于EP管中，標(biāo)記好后放于-80℃冰箱保存。取出海馬組織，用組織裂解液提蛋白，配置標(biāo)準(zhǔn)蛋白，酶標(biāo)儀繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白樣品濃度，制膠，進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，洗膜，加入兔抗Beclin-1多克隆一抗(1∶800稀釋)、兔抗LC3多克隆一抗(1∶800稀釋),4℃冰箱過夜。TBST洗膜,加入山羊抗兔二抗(1∶2 000稀釋)，采用Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行曝光、顯影和分析。將目的蛋白與內(nèi)參β-actin的光密度值進(jìn)行比較，對(duì)蛋白表達(dá)含量進(jìn)行半定量分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組海馬區(qū)HE染色結(jié)果 Sham組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和形態(tài)正常，排列整齊緊密，未見壞死變形的細(xì)胞；與Sham組比較，CIR組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷，各時(shí)間點(diǎn)存活神經(jīng)元數(shù)量較明顯減少(P<0.05)；與CIR組比較，CIP組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷減輕，各時(shí)間點(diǎn)存活神經(jīng)元數(shù)量明顯增多(P<0.05)。見表1,圖1。

表1 各組海馬區(qū)存活神經(jīng)元數(shù)量個(gè)/高倍視野)

與Sham組比較：1)P<0.05；與CIR組比較：2)P<0.05

圖1 鏡下觀察各組海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)(HE，×400)

2.2各組海馬區(qū)免疫組化結(jié)果

2.2.1各組海馬區(qū)LC3-Ⅱ表達(dá)結(jié)果 Sham組大鼠海馬區(qū)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)可見少量LC3-Ⅱ陽性弱表達(dá)；與Sham組比較， CIR組、CIP組大鼠海馬區(qū)各時(shí)間點(diǎn)LC3-Ⅱ表達(dá)顯著增加(P<0.05)，其中6 h開始增加，24 h達(dá)高峰，48 h、72 h下降；與CIR組比較，CIP組大鼠海馬區(qū)各時(shí)間點(diǎn)LC3-Ⅱ表達(dá)顯著增加(P<0.05)；CIP組大鼠海馬區(qū)LC3-Ⅱ表達(dá)24 h達(dá)高峰，組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2，圖2。

表2 各組海馬區(qū)LC3-Ⅱ陽性細(xì)胞表達(dá)個(gè)/高倍視野)

與Sham組比較:1)P<0.05；與CIR組比較:2)P<0.05；與CIP組內(nèi)24 h比較:3)P<0.05，下表同

圖2 各組海馬區(qū)LC3-Ⅱ表達(dá)(DAB，×400)

2.2.2各組海馬區(qū)Beclin-1表達(dá)結(jié)果 Sham組大鼠海馬區(qū)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)可見少量Beclin-1陽性弱表達(dá)；與Sham組比較，CIR組大鼠海馬區(qū)各時(shí)間點(diǎn)Beclin-1表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與CIR組比較，CIP組大鼠海馬區(qū)各時(shí)間點(diǎn)Beclin-1表達(dá)顯著增加(P<0.05)；CIP組大鼠海馬區(qū)Beclin-1表達(dá)24 h達(dá)高峰，組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3，圖3。

表3 各組海馬區(qū)Beclin-1陽性細(xì)胞表達(dá)個(gè)/高倍視野)

圖3 各組海馬區(qū)Beclin-1表達(dá)(DAB，×400)

2.3各組海馬區(qū)Western 印跡結(jié)果

2.3.1各組海馬區(qū)LC3-Ⅱ蛋白表達(dá) Sham組大鼠海馬區(qū)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)見少量LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)；與Sham組比較，CIR組大鼠海馬區(qū)各時(shí)間點(diǎn)LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與CIR組比較，CIP組大鼠海馬區(qū)各時(shí)間點(diǎn)LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量顯著增加，72 h表達(dá)最低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4，圖4。

表4 各組海馬區(qū)LC3-Ⅱ蛋白Western印跡結(jié)果個(gè)/高倍視野)

與Sham組比較：1)P<0.05；與CIR組比較：2)P<0.05；與本組24 h比較：3)P<0.05；與本組72 h比較：4)P<0.05，下表同

圖4 LC3-Ⅱ蛋白Western印跡結(jié)果

2.3.2各組海馬區(qū)Beclin-1蛋白表達(dá) 以Beclin-1光密度值/β-actin光密度值表示Beclin-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。Sham組大鼠海馬區(qū)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)見少量Beclin-1蛋白表達(dá)；與Sham組比較，CIR組大鼠海馬區(qū)各時(shí)間點(diǎn)Beclin-1蛋白表達(dá)量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與CIR組比較，CIP組大鼠海馬區(qū)各時(shí)間點(diǎn)Beclin-1蛋白表達(dá)量顯著增加，24 h表達(dá)最高，72 h表達(dá)最低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5，表5。

圖5 Beclin-1蛋白Western印跡結(jié)果

表5 各組海馬區(qū)Beclin-1蛋白Western印跡結(jié)果個(gè)/高倍視野)

3 討 論

腦缺血是一種多因素的異質(zhì)性疾病，死亡率和致殘率都很高，影響著各個(gè)年齡組、種族和國家的人口，尤其是對(duì)老年人的損害比較嚴(yán)重。缺血后處理通常是指長時(shí)間嚴(yán)重缺血損傷后對(duì)大腦或遠(yuǎn)端肢體的血液供應(yīng)進(jìn)行的一次或一系列短暫的干擾，調(diào)動(dòng)機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)，為腦缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元喪失提供腦保護(hù)〔7〕。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，缺血后處理在減輕心肌損傷的缺血再灌注損傷，肺移植再灌注損傷，腎臟缺血再灌注損傷等發(fā)揮著重要作用〔8～10〕。2006年Zhao等〔11〕發(fā)現(xiàn)缺血后處理在發(fā)生腦卒中后具有促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，保護(hù)腦功能的作用。通過大鼠局灶性腦缺血模型研究證實(shí)，缺血后處理能抑制細(xì)胞凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用〔12〕。缺血后處理通過影響缺血后再灌注和腦血流量，改善腦缺血后神經(jīng)血管單位中內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用，下調(diào)協(xié)同的有害過程，包括興奮毒性、線粒體紊亂、氧化應(yīng)激和炎癥進(jìn)而影響了其下游的細(xì)胞信號(hào)〔13〕。本研究證實(shí)缺血后處理能夠減輕腦缺血再灌注損傷。這與以往的研究一致，導(dǎo)致缺血后處理腦保護(hù)作用的潛在機(jī)制是復(fù)雜的，并且仍然沒有得到很好解釋。

自噬是一種溶酶體介導(dǎo)的降解過程，它清除錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)和過量或受損的細(xì)胞器，在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用。細(xì)胞通過溶酶體途徑降解衰亡的細(xì)胞器及損傷的蛋白即是自噬〔14〕。自噬具有雙重作用，當(dāng)自噬適度激活時(shí)，可加速胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解，一些錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)和受損的細(xì)胞器可以被降解為代謝元素并循環(huán)利用以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，抵抗能量不足，促進(jìn)細(xì)胞存活；當(dāng)自噬過度激活時(shí)，可導(dǎo)致細(xì)胞裂解，引起細(xì)胞死亡。王國峰等〔15〕通過在大鼠腦缺血前注射自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡減少，表明自噬能減輕缺氧缺血損傷，具有神經(jīng)保護(hù)作用。Beclin-1和LC3都是重要的自噬相關(guān)蛋白，被用作自噬體的可靠生物標(biāo)記物，Beclin-1是酵母自噬基因Atg6/Vps30的同源基因，Beclin1表達(dá)的上調(diào)對(duì)自噬過程也是必要的，因其表達(dá)的強(qiáng)度與自噬的活性程度密切相關(guān)，相反，Beclin1的沉默和LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化的減少將有助于阻止自噬體的加工〔16〕。已有研究發(fā)現(xiàn)通過使用自噬抑制劑3-MA和渥太青霉素下調(diào)缺血再灌注后神經(jīng)元中Beclin-1表達(dá)，加重了神經(jīng)元壞死，而應(yīng)用自噬激活劑雷帕霉素可以上調(diào)Beclin-1表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元損傷明顯減少，證明了自噬在缺血再灌注后發(fā)揮重要保護(hù)作用〔16,17〕。幾乎在各種組織細(xì)胞均可以見到自噬現(xiàn)象，自噬可以通過調(diào)節(jié)受損細(xì)胞質(zhì)和線粒體的降解來維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，并確保細(xì)胞在應(yīng)激條件下的生存，自噬在缺血性腦再灌注損傷中受多重因素調(diào)控。在本實(shí)驗(yàn)中，缺血后處理通過上調(diào)缺血再灌注自噬相關(guān)蛋白 Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達(dá)，以減少缺血再灌注損傷神經(jīng)元凋亡，減輕神經(jīng)功能缺損癥狀，從而發(fā)揮其腦保護(hù)作用，且在出缺血后處理24 h時(shí)，自噬相關(guān)蛋白 Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達(dá)明顯增多。缺血再灌注損失導(dǎo)致過多的ROS，而ROS不能被內(nèi)源性防御系統(tǒng)迅速清除，以往的研究發(fā)現(xiàn)自噬的產(chǎn)生與低氧誘導(dǎo)因子-1α、氧自由基的適度產(chǎn)生等有關(guān)〔18,19〕，其主要機(jī)制與增強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)有關(guān)。缺血后處理可誘導(dǎo)低氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)上調(diào)，避免氧自由基的過度產(chǎn)生而導(dǎo)致的自噬性死亡，從而使自噬在24 h保持一個(gè)較高的水平，發(fā)揮了保護(hù)作用。

綜上所述，腦缺血再灌注損傷會(huì)造成明顯的神經(jīng)元損傷，缺血后處理通過激活自噬減少了神經(jīng)元的凋亡，減輕了腦缺血再灌注損傷。總之，隨著研究的進(jìn)一步進(jìn)行，缺血后處理的腦保護(hù)作用已經(jīng)明確，但由于其機(jī)制廣泛而復(fù)雜，還未明確。而近年來自噬在心腦血管疾病中的作用越來越受到人們的關(guān)注，關(guān)于缺血后處理與自噬的關(guān)系值得探索發(fā)現(xiàn)，為臨床腦缺血再灌注損傷的治療提供新思路。