李素芳 徐宏仙 莫政 黎世貴 萬(wàn)妮婭

(三亞市中醫(yī)院，海南 三亞 572000)

宮頸癌是中老年女性最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)生與分娩次數(shù)、性行為開始時(shí)間和頻率、家族遺傳等多種因素有關(guān)，其中高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染是最主要的危險(xiǎn)因素〔1〕。研究者發(fā)現(xiàn)，約95%的宮頸癌患者可檢出高危型HPV，其中HPV16、HPV18是最常見(jiàn)的兩個(gè)亞型〔2〕。早期反應(yīng)基因(Iex-1)最先由研究者在小鼠成纖維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)受到多種刺激后，可迅速短暫性表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)效應(yīng)〔3〕。已有研究發(fā)現(xiàn)，多種人體惡性腫瘤中存在Iex-1表達(dá)失調(diào)〔4〕；但關(guān)于宮頸癌細(xì)胞和組織中Iex-1表達(dá)研究較少，且與高危型HPV感染是否相關(guān)尚未闡明。本研究以不同宮頸病變組織標(biāo)本和3種不同HPV感染情況的宮頸癌細(xì)胞系為研究對(duì)象，探討宮頸癌組織和細(xì)胞中Iex-1表達(dá)特點(diǎn)及與高危型HPV感染的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 收集2016年1月至2018年3月三亞市中醫(yī)院病理科留存的宮頸病變組織石蠟包塊61份，其中宮頸良性病變13例，年齡48～72歲，平均(52.87±10.02)歲。宮頸上皮內(nèi)瘤變23例，Ⅰ級(jí)9例、Ⅱ級(jí)8例、Ⅲ級(jí)6例，年齡46～70歲，平均(54.27±9.73)歲。宮頸癌25例，宮頸癌國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)臨床病理分期：Ⅰ期8例、Ⅱ期10例、Ⅲ期5例、Ⅳ期2例；分化程度：高分化9例、中分化8例、低分化8例。上述患者均接受放化療和生物治療；本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2細(xì)胞與試劑 人宮頸癌細(xì)胞株C-33A(HPV-)、SIHA(HPV16+)、HELA(HPV18+)購(gòu)于上海鈺博生物科技有限公司。Iex-1免疫組化試劑盒購(gòu)于南京賽泓瑞生物科技有限公司。細(xì)胞總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于上海澤葉生物科技有限公司。兔抗人Iex-1多克隆抗體、鼠抗人E6單克隆抗體、羊抗兔IgG二抗、兔抗鼠IgG二抗購(gòu)于上?？道噬锟萍加邢薰尽?/p>

1.3免疫組化法檢測(cè)宮頸病變組織中Iex-1表達(dá) 采用免疫組化SP法檢測(cè)，宮頸病變組織石蠟包塊4 μm連續(xù)切片，染色步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明。光學(xué)顯微鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度，進(jìn)行半定量評(píng)分。其中陽(yáng)性細(xì)胞比例<5%計(jì)0分，5%～25%計(jì)1分，>25%且≤50%計(jì)2分，>50%且≤75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分；無(wú)染色不計(jì)分，淡黃計(jì)1分，棕黃計(jì)2分，褐色計(jì)3分。陽(yáng)性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度評(píng)分的乘積為最終得分，陰性(0分)、弱陽(yáng)性(1～4分)、陽(yáng)性(5～8分)、強(qiáng)陽(yáng)性(9～12分)。

1.4實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞株中Iex-1 mRNA表達(dá) Triozl法提取C-33A、SIHA、HELA宮頸癌細(xì)胞株總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，Iex-1、β-actin引物合成由上海澤葉生物科技有限公司完成。引物序列：Iex-1上游5′-GAGCTCCATCACTGTAGTCG-3′，下游：5′-TTAAGAGTTTCCC GTGAGCT-3′；β-actin上游5′-CATTCCCTACAATGACGTCGGTTGTG-3′，下游：5′-ATAGCAACGGGATACGGGATAGCGGT-3′。反應(yīng)體系30 μl，條件：94℃ 10 min，94℃ 5 min，56℃ 50 s，72℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。計(jì)算Iex-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.5Western印跡法檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞株中Iex-1蛋白表達(dá) C-33A、SIHA、HELA宮頸癌細(xì)胞株中加入蛋白裂解液，4℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清，二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白含量，蛋白濃度調(diào)整至4 μg/μl，分別取50 μl行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，分離目標(biāo)蛋白，轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，膜封閉60 min，滴加兔抗人Iex-1多克隆抗體(1∶100)，以兔源性β-actin(1∶1 000)為內(nèi)參，4℃孵育過(guò)夜，洗膜后滴加辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶1 000)，室溫下靜置2 h，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，放入凝膠成像系統(tǒng)中讀取各條帶灰度值。

1.6siRNA制備與分組 由上海澤葉生物科技有限公司公司設(shè)計(jì)并合成HPV16 E6特異性siRNA序列和陰性序列siRNA-nc，分別轉(zhuǎn)染SIHA細(xì)胞，為干擾組和陰性對(duì)照組，并設(shè)立空白對(duì)照組，每組6個(gè)平行對(duì)照。

1.7siRNA干擾后SIHA細(xì)胞中E6和Iex-1 mRNA和蛋白表達(dá)檢測(cè) 轉(zhuǎn)染48 h后，Triozl法提取3組SIHA細(xì)胞中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，E6引物序列：上游5′-GCTGACCTGAATCTCTAAC-3′，下游：5′-ATAATCCCACCGGCTACTA-3′；Iex-1上下游引物、反應(yīng)體系和條件同1.4。轉(zhuǎn)染48 h后，提取3組SIHA細(xì)胞中蛋白質(zhì)，定量后調(diào)整濃度至4 μg/μl，分別取50 μl行SDS-PAGE，分離目標(biāo)蛋白，轉(zhuǎn)膜至PVDF，封閉60 min，滴加鼠抗人E6單克隆抗體(1∶500)、兔抗人Iex-1多克隆抗體(1∶100)，以兔源性β-actin(1∶1 000)為內(nèi)參，4℃孵育過(guò)夜，洗膜后滴加HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG二抗(1∶2 500)、羊抗兔IgG二抗(1∶1 000)，室溫下靜置2 h，ECL顯色，放入凝膠成像系統(tǒng)中讀取各條帶灰度值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1不同宮頸病變組織中Iex-1表達(dá) 宮頸良性病變、宮頸上皮內(nèi)瘤變、宮頸癌組織中Iex-1表達(dá)陽(yáng)性率依次顯著下降(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 不同宮頸病變組織中Iex-1表達(dá)比較〔n(%)〕

2.2Iex-1表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 Iex-1陽(yáng)性率在不同病理類型、FIGO分期的宮頸癌患者中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；分化程度為G1～G2的宮頸癌患者Iex-1陽(yáng)性率明顯高于分化程度為G3的患者(P<0.05)；無(wú)宮旁浸潤(rùn)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者Iex-1陽(yáng)性率明顯高于宮旁浸潤(rùn)、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 Iex-1表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

2.3不同宮頸癌細(xì)胞株中Iex-1 mRNA和蛋白表達(dá) 不同HPV感染狀態(tài)的宮頸癌細(xì)胞株中，C-33A細(xì)胞株Iex-1 mRNA表達(dá)水平明顯高于SIHA、HELA細(xì)胞株(P<0.05)；C-33A細(xì)胞株Iex-1蛋白表達(dá)水平明顯高于SIHA、HELA細(xì)胞株(P<0.05)。SIHA細(xì)胞株和HELA細(xì)胞株Iex-1 mRNA和蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3，圖1。

2.4siRNA干擾后SIHA細(xì)胞中E6和Iex-1 mRNA和蛋白表達(dá) 干擾組SIHA細(xì)胞中E6 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯低于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組(P<0.05)；干擾組SIHA細(xì)胞中Iex-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組(P<0.05)?？瞻讓?duì)照組與陰性對(duì)照組E6 mRNA和蛋白、Iex-1 mRNA和蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2，表4。

表3 不同宮頸癌細(xì)胞株中Iex-1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)

與SIHA相比：1)P<0.05；與HELA相比：2)P<0.05

圖1 Western印跡法檢測(cè)不同宮頸癌細(xì)胞株中Iex-1蛋白表達(dá)

圖2 Western印跡法檢測(cè)SIHA細(xì)胞中E6、Iex-1蛋白表達(dá)

表4 siRNA干擾后SIHA細(xì)胞中E6和Iex-1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)

與空白對(duì)照組相比:1)P<0.05；與陰性對(duì)照組相比:2)P<0.05

3 討 論

我國(guó)每年約20萬(wàn)例新發(fā)宮頸癌患者，約占全球新發(fā)患者總數(shù)的1/3〔5〕。中老年是宮頸癌的高發(fā)期，高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的首要原因，其中16型和18型是最主要的宮頸癌致病HPV亞型〔6〕。在高危型HPV DNA向宿主基因組整合過(guò)程中可引發(fā)HPV主要癌蛋白E6持續(xù)高表達(dá)，通過(guò)多種途徑引發(fā)細(xì)胞周期紊亂，提升基因組不穩(wěn)定性，降低細(xì)胞凋亡率〔7〕。Iex-1廣泛分布于人體各組織器官中，在不同類型腫瘤中發(fā)揮促進(jìn)或抑制癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的雙重作用〔8〕。

本研究提示隨著宮頸病變程度的加重，Iex-1表達(dá)水平明顯下降甚至缺失，可能參與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展。同時(shí)也說(shuō)明在宮頸癌細(xì)胞中Iex-1發(fā)揮抑癌因子作用，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡、抑制增殖，臨床中可作為監(jiān)測(cè)宮頸癌發(fā)展的生物學(xué)標(biāo)志物。盡管高危型HPV是引發(fā)宮頸癌的危險(xiǎn)因素已得到證實(shí)，但HPV致癌過(guò)程中相關(guān)的信號(hào)通路仍未完全闡明。P53、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Erk)、蛋白激酶B(AKT)等多種因子參與了Iex-1及HPV E6信號(hào)通路〔9〕。

相關(guān)研究顯示，HPV E6蛋白與P53相互作用，參與正常細(xì)胞向癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化〔10〕。Iex-1的啟動(dòng)子區(qū)域中含有P53特異性結(jié)合位點(diǎn)，研究者發(fā)現(xiàn)，p53調(diào)節(jié)Iex-1表達(dá)的準(zhǔn)確性和敏感性均較好，進(jìn)而影響癌細(xì)胞增殖和凋亡〔11〕。亦有研究發(fā)現(xiàn)，HPV16 E6蛋白可明顯提升核因子(NF)-κB的活性亞基NF-κB P65表達(dá)水平〔12〕；HPV18 E6蛋白在調(diào)控HELA宮頸癌細(xì)胞核因子NF-κB P65表達(dá)及磷酸化方面發(fā)揮重要作用〔13〕。Iex-1基因的C端能夠與REL/P65特異性結(jié)合，抑制NF-κB靶基因BCL-xl、Clap1表達(dá)〔14〕；Iex-1還能夠抑制IΚBα降解，下調(diào)NF-κB表達(dá)水平〔15〕。上述兩個(gè)調(diào)控途徑均能夠抑制NF-κB的抗凋亡作用。

本研究顯示，HPV陽(yáng)性的宮頸癌SIHA、HELA細(xì)胞株中Iex-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯低于HPV陰性的宮頸癌C-33A細(xì)胞株；使用siRNA特異性沉默SIHA細(xì)胞中E6表達(dá)后，Iex-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯提升，提示宮頸癌組織中Iex-1表達(dá)與是否存在HPV感染有關(guān)，HPV可能經(jīng)某些信號(hào)通路下調(diào)Iex-1表達(dá)，促進(jìn)宮頸癌發(fā)展與轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)論首次提出了抑制Iex-1的促凋亡作用可能為HPV誘發(fā)宮頸癌的新通路，通過(guò)特異性沉默宮頸癌細(xì)胞E6蛋白表達(dá)來(lái)提升Iex-1活性有望成為宮頸癌治療的新途徑。