朱勇 王琴 盧軍 黃惠勇 李豐 楊萍

(1湖南省腦科醫(yī)院神經(jīng)外科，湖南 長沙 410007；2湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點實驗室)

目前癲癇-抑郁共病是一種常見的神經(jīng)精神病學(xué)現(xiàn)象，發(fā)生率高達(dá)23.1%〔1〕。癲癇患者出現(xiàn)過早死亡患者中75.2%合并有抑郁等精神障礙，且自殺風(fēng)險明顯升高〔2〕。因此，探索癲癇合并抑郁癥的發(fā)病機(jī)制，做好防治具有重要意義。氟西汀屬于5-羥色胺再攝取抑制劑類抗抑郁藥〔3〕，被廣泛用于焦慮癥、抑郁障礙、強(qiáng)迫癥等精神障礙〔4〕；目前已開始被用于癲癇合并抑郁治療中〔5〕。但有關(guān)起效機(jī)制探討甚少，故本研究采用癲癇合并抑郁模型來研究氟西汀對其行為的影響，探索氟西汀對癲癇合并抑郁大鼠模型海馬區(qū)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、神經(jīng)元核抗原(NeuN)表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 SPF級健康SD雄性大鼠60只，周齡8～10 w，體重180～220 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供，飼養(yǎng)于潔凈級環(huán)境中，飼養(yǎng)室溫度22～25℃，相對濕度50%～70%，換氣8～12次/h，光線每隔12 h交替，實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，自由飲食。隨機(jī)分為對照組、模型組、氟西汀低、中、高劑量組各12只。

1.2主要試劑及儀器 匹羅卡品(ABCR公司，ab141301)，氯化鋰(Sigma公司，1001011078)，鹽酸氟西汀(蘇州禮來制藥有限公司，201608072)。兔抗鼠GFAP(武漢博士德生物有限公司，PB9082)，兔抗鼠NeuN(武漢博士德生物有限公司，BM4354)，二抗(北京中杉金橋生物有限公司，pv-9000)。BX43型雙目生物攝像顯微鏡(日本OLYMPUS)，熒光定量PCR儀(美國BioRad公司)。

1.3造模 ①參照文獻(xiàn)〔6〕進(jìn)行癲癇造模。氯化鋰3 mEq/kg腹腔注射，17.5 h予以阿托品1 mg/kg腹腔注射，30 min后注射匹羅卡品35 mg/kg。10 mg/(kg·次)追加匹羅卡品(注射匹羅卡品后30 min內(nèi)無驚厥發(fā)作)，追加4次未出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠考慮造模失敗，剔除出組。28 d后慢性自發(fā)性癲癇形成，癲癇造模成功。②在成功建立癲癇模型后，根據(jù)文獻(xiàn)誘導(dǎo)慢性不可預(yù)見性應(yīng)激抑郁模型(CMS)〔7〕。CMS方案包括七種不同的應(yīng)激源，連續(xù)14 d應(yīng)激刺激隨機(jī)排列如下(每種應(yīng)激給予3～4次，連續(xù)2 d不能出現(xiàn)相同應(yīng)激)：傾斜鼠籠17 h；禁食、禁水20 h；濕籠21 h；禁水17 h；持續(xù)光照17 h；電擊(30 V電壓)足底5 s；夾尾1 min；行為限制2 h；4℃冰水游泳(水深以大鼠的后足尖剛能觸及桶底為準(zhǔn))5 min。造模結(jié)束后進(jìn)行行為學(xué)測定。

1.4給藥方法 氟西汀低、中、高劑量組于造模結(jié)束后給予氟西汀干預(yù)藥(5、7.5、10 mg/kg，1次/d)腹腔注射，對照、模型組同時給予同等量生理鹽水，1次/d。藥物干預(yù)28 d，治療結(jié)束后進(jìn)行行為學(xué)測定。

1.5觀察指標(biāo)

1.5.1行為學(xué)檢測 ①強(qiáng)迫游泳實驗〔8〕：將大鼠放入高為 50 cm、直徑為 20 cm 的圓柱形水缸中，水深 40 cm左右，隨機(jī)選擇大鼠，每次觀察2只，采用雙盲法檢測。實驗開始后60 s為適應(yīng)時間，適應(yīng)結(jié)束后記錄 5 min內(nèi)大鼠不動時間。 ②曠場實驗〔9〕：將大鼠置于大小為90 cm×90 cm×45 cm(底面等分為25個等邊方格)木制箱子的中心方格內(nèi)，其4只爪子均進(jìn)入一方格則記錄水平運動1次，兩前爪騰空或攀附墻壁則記錄垂直運動1次，觀察大鼠在3 min 內(nèi)水平運動次數(shù)及垂直運動次數(shù)。

1.5.2免疫組化 最后一次行為學(xué)測定后，每組取6只大鼠，將其麻醉處死，取出大鼠腦組織，進(jìn)行冠狀位切片，厚度約5 μm。經(jīng)脫蠟、水化后，依次進(jìn)行抗原修復(fù)、內(nèi)源性過氧化物酶消除、非特異性蛋白封閉、4℃孵育GFAP、NeuN一抗(1∶100)過夜、室溫孵育二抗2 h、酶聯(lián)反應(yīng)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色、蘇木素復(fù)染、脫水透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察組織染色情況，細(xì)胞呈現(xiàn)棕黃色染色者為陽性。染色強(qiáng)度使用IPP6.0軟件分析海馬齒狀回平均光密度。

1.5.3RT-RCR 最后一次行為學(xué)測定后，每組取6只大鼠，將其麻醉處死，在冰上提取出大鼠海馬。用Triziol法提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄酶將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。構(gòu)建聚合酶體系，Taq酶催化，熱循環(huán)：95℃預(yù)熱5 min，40個循環(huán)(94℃ 20 s，退火20 s，72℃ 30 s)。將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的對數(shù)值與閾值循環(huán)數(shù)(Ct)值得出校正曲線；通過2-△△Ct法計算目的基因與內(nèi)參物(β-actin)Ct值的差值，即目的基因的相對表達(dá)水平。GFAP上游引物：5′GACCGCTTTGCTAGCTA 3′，下游引物：5′GGTTTCATCTTGGAGCT 3′；NeuN上游引物：5′CACGGCATGACCCTCTACAC 3′，下游引物：5′ GTCTGTGCTGCTTCATCTGC3′；β-actin上游引物：5′GTCGTACCACTGGCATTGTG 3′，下游引物：5′TCTCAGCTGTGGTGGTGAAG 3′。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠行為學(xué)變化 造模后，與對照組相比，模型組、氟西汀低、中、高劑量組不動時間明顯延長，垂直運動次數(shù)、水平運動次數(shù)明顯下降(P<0.05)；干預(yù)后，模型組不動時間明顯長于對照組，垂直運動次數(shù)、水平運動次數(shù)明顯低于對照組(P<0.01)；與模型組相比，氟西汀低、中、高劑量組不動時間明顯縮短，垂直運動次數(shù)、水平運動次數(shù)明顯增加(P<0.05)；氟西汀高劑量組不動時間縮短，垂直運動次數(shù)、水平運動次數(shù)增加較氟西汀低、中劑量組更明顯(P<0.05)。見表1。

2.2各組大鼠海馬齒狀回GFAP、NeuN表達(dá) GFAP 染色顯示大鼠海馬齒狀回細(xì)胞胞質(zhì)及突起呈棕黃色。對照組胞質(zhì)染色較淡；模型組胞質(zhì)染色呈棕黃色，呈桿狀或錐狀，突起粗短，且數(shù)量增多；氟西汀低、中、高劑量組染色較模型組淺，且數(shù)量減少。見圖1。NeuN染色顯示大鼠海馬齒狀回細(xì)胞質(zhì)及胞核可以觀察到棕黃色或者黃色顆粒。對照組胞質(zhì)及胞核可見大量棕黃色或者黃色顆粒；模型組胞質(zhì)及胞核僅可見少量表達(dá)；氟西汀低、中、高劑量組陽性表達(dá)較模型組有所增加，尤其氟西汀高劑量組表達(dá)更為明顯。見圖2。與對照組相比，模型組GFAP表達(dá)明顯增加、NeuN表達(dá)明顯下降(P<0.05)；與模型組相比，氟西汀低、中、高劑量組GFAP表達(dá)明顯下降、NeuN表達(dá)明顯增加(P<0.05)；氟西汀高劑量組GFAP表達(dá)下降、NeuN表達(dá)增加較氟西汀低、中劑量組更明顯(P<0.05)。見表2。

表1 各組大鼠造模后及干預(yù)后行為學(xué)比較

與對照組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05；與氟西汀高劑量組比較:3)P<0.05，下表同

圖1 各組海馬齒狀回GFAP染色(DAB，×200)

圖2 各組海馬齒狀回NeuN染色(DAB，×200)

表2 各組大鼠海馬齒狀回GFAP、NeuN表達(dá)

2.3各組大鼠海馬齒狀回GFAP、NeuN mRNA表達(dá)水平的比較 模型組GFAP mRNA表達(dá)明顯高于對照組，NeuN mRNA表達(dá)明顯低于對照組(P<0.05)；氟西汀低、中、高組GFAP mRNA表達(dá)均明顯低于模型組，NeuN mRNA表達(dá)明顯高于模型組(P<0.05)，尤其是氟西汀高劑量組，與氟西汀低、中劑量組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠海馬齒狀回GFAP、NeuN mRNA表達(dá)

3 討 論

癲癇合并抑郁的發(fā)生率比普通人群高5～7倍，尤其在長期發(fā)作不能控制難治性癲癇患者中抑郁的發(fā)生率更高〔10〕。近年來隨著神經(jīng)調(diào)控技術(shù)發(fā)展，癲癇的治療療效顯著提高，但并發(fā)精神障礙仍然是導(dǎo)致癲癇患者生活質(zhì)量下降的主要原因之一，其中癲癇后抑郁明顯增加癲癇患者自殺的風(fēng)險〔11〕。故對癲癇合并抑郁患者的抗抑郁治療尤為重要。研究證實對5-羥色胺再攝取抑制劑對癲癇患者較為安全，能明顯降低合并抑郁患者抑郁量表評分〔12〕。故本研究采用鋰-匹羅卡品癲癇造模+慢性不可預(yù)知性應(yīng)激建立癲癇合并抑郁造模，該模型已廣泛用于探索癲癇合并抑郁發(fā)病及治療的動物模型〔13〕。并選用5-羥色胺再攝取抑制劑經(jīng)典藥物氟西汀對癲癇合并抑郁大鼠進(jìn)行干預(yù)。本研究成功地誘發(fā)了癲癇大鼠抑郁樣行為，而氟西汀能明顯改善癲癇合并抑郁大鼠抑郁行為，呈劑量依賴性。

研究證明鋰-匹羅卡品大鼠慢性期病理表現(xiàn)為海馬神經(jīng)元大量脫失，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化增生；神經(jīng)元脫失和膠質(zhì)增生為癲癇復(fù)發(fā)重要原因〔14〕。星形膠質(zhì)細(xì)胞為神經(jīng)元運輸營養(yǎng)物質(zhì)和排除代謝產(chǎn)物，具有支持和引導(dǎo)神經(jīng)元遷移的作用，同時還參與神經(jīng)元的突觸傳遞活動〔15〕。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志物，星形膠質(zhì)細(xì)胞反復(fù)、長時間的異常高功能狀態(tài)與癲癇的發(fā)展密切相關(guān)〔16〕。NeuN是一種可溶性核蛋白，在體外能與DNA 結(jié)合，識別神經(jīng)元特異的核蛋白單克隆抗體的產(chǎn)生，已成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)成熟神經(jīng)元的常用標(biāo)志物〔17〕。在大鼠大部分神經(jīng)元(大腦皮質(zhì)、基底核等)有明顯表達(dá)〔18〕。本研究與既往研究一致〔19〕。氟西汀治療后GFAP表達(dá)下降，NeuN表達(dá)增加，且呈劑量依賴性，說明氟西汀能通過抑制GFAP表達(dá)、增加NeuN表達(dá)改善抑郁行為，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。