夏炳杰 強占榮 李桂鮮 秦振梅 駱雪萍
(桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,廣西 桂林 541199)
有研究報道,有15%~25%的急性胰腺炎可進展為重癥急性胰腺炎(SAP),其死亡率高達20%~50%,特別是對于老年患者,死亡率可進一步升高〔1,2〕。研究顯示,炎癥通路的激活與SAP的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),相關(guān)炎性細胞因子如白細胞介素(IL)-8、γ干擾素及腫瘤壞死因子(TNF)-α等水平與其病情嚴(yán)重程度密切相關(guān),同時可有效的評估預(yù)后〔3〕。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白(NLRP3)炎性小體是免疫炎癥反應(yīng)的重要組成部分,參與了眾多炎癥性疾病如器官缺血再灌注損傷、慢性阻塞性肺疾病及動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生、發(fā)展過程〔4~6〕。研究顯示,NLRP3炎性小體可協(xié)同NF-κB的激活,促進及放大急性胰腺炎的炎癥瀑布效應(yīng),引起大量促炎細胞因子的合成與分泌,而抑制NLRP3炎性小體,可顯著降低炎癥反應(yīng),阻止急性胰腺炎的進展〔7〕。目前,中醫(yī)藥已廣泛運用于急性胰腺炎的臨床治療,如血必凈注射液在調(diào)節(jié)免疫、抑制炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用,可顯著提高急性胰腺炎患者臨床療效〔8〕。本研究探討血必凈注射液對老年SAP患者NLRP3炎性小體表達的影響。
1.1臨床資料 選取2016年1月至2018年12月于桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院就診住院的老年SAP患者100例作為研究對象,其中男58例,女42例,年齡61~80歲,中位年齡70.5歲。致病原因:膽囊及膽管結(jié)石(40例);暴飲暴食及酒精性(31例);高脂血癥(10例);藥物性(7例);自身免疫性(6例)及其他(6例);納入標(biāo)準(zhǔn):患者均符合SAP診斷與治療指南〔9〕;年齡≥60歲。排除標(biāo)準(zhǔn):合并惡性腫瘤、其他部位嚴(yán)重感染的患者;合并嚴(yán)重肝腎功能不全的患者;存在其他自身免疫性疾病和免疫缺陷的患者;對研究藥物過敏的患者。根據(jù)治療方法的不同,將上述患者按隨機數(shù)字表法,分為對照組(50例)和觀察組(50例)。兩組間在性別、年齡、病程、致病原因等方面無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。本研究獲得了桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)并征得了患者家屬書面知情同意。
1.2主要設(shè)備及試劑 主要設(shè)備:熒光定量PCR儀(美國Bio-rad公司);主要試劑:人淋巴細胞分離液(美國Sigma公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量試劑盒(Takara公司);Western印跡相關(guān)試劑盒,如二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)配制試劑盒(上海碧云天公司);人血清IL-1β和IL-18酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(中國博士德公司);內(nèi)毒素ELISA檢測試劑盒(南京GenScript公司);抗NLRP3、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-1單克隆抗體(美國Abcam公司);抗甘油醛-2-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(美國Santa公司)。
1.3治療方法 入院后對照組患者給予嚴(yán)格禁食禁水,留置胃管,給予補液用以維持機體水、電解質(zhì)和酸堿平衡,抑制胰酶分泌,提供靜脈營養(yǎng)并給予持續(xù)血液灌流等治療。觀察組在對照組治療的基礎(chǔ)上加用血必凈注射液(天津紅日藥物公司,批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字Z20040033,規(guī)格10 ml/支),每次100 ml,每天2次,連用1 w。
1.4觀察指標(biāo)
1.4.1一般臨床資料采集 記錄患者一般臨床資料如年齡、性別、基礎(chǔ)疾病等,同時記錄患者治療前后修正CT嚴(yán)重指數(shù)評分(MCTSI)、Ranson評分及APACHEⅡ評分。
1.4.2分離外周血單個核細胞(PBMCs) 取兩組患者治療前后靜脈血5 ml,置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管,按照1∶1比例與人外周血淋巴細胞分離液混勻后離心,分離PBMCs,將1 ml Trizol加入PBMCs中混勻后備用。
1.4.3qRT-PCR檢測炎性小體NLRP3及Caspase-1 mRNA水平 運用Trizol法提取各組治療前后PBMCs總RNA,測定RNA濃度,然后按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄。其中qPCR引物由上海生工公司設(shè)計合成,NLRP3上游引物:5′-CATGAGTGCTGCTTCGACAT-3′,下游引物:5′-GCTTCAGTCCCACACAGA-3′;Caspase-1上游引物:5′-ATCGCTTTCTGCTCTTCCAC-3′,下游引物:5′-TCCTCCACATCACAGGAACA-3′;內(nèi)參GAPDH上游引物:5′-AGACAGCCGCATCTTCTTGT-3′,下游引物:5′-CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT-3′。依據(jù)TaKaRa公司提供的熒光定量PCR試劑盒說明書建立20 μl反應(yīng)體系,反應(yīng)條件:預(yù)變性,95℃120 s,95℃5 s,60℃30 s,40個循環(huán);溶解曲線:95℃15 s,60℃1 min,95℃30 s,60℃15 s。結(jié)果分析:以GAPDH為內(nèi)參,計算各組相應(yīng)基因的ΔΔCT值。以目的基因的量為定量結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。
1.4.4免疫印跡法檢測PBMCs NLRP3、Caspase-1的蛋白表達水平 提取兩組治療前后人PBMCs總蛋白,采用BCA法測定蛋白濃度。取50 μg蛋白于10%PAGE分離后,轉(zhuǎn)移置硝基纖維素膜,給予5%脫脂牛奶封閉2 h,分別孵育抗NLRP3抗體(1∶400)、Caspase-1抗體(1∶300)及抗GAPDH抗體(1∶400),4℃避光孵育過夜。次日取出膜,給予避光室溫孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶10 000),采用凝膠成像系統(tǒng)測定蛋白條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參,并計算目的條帶與GAPDH灰度比值。
1.4.5外周血細胞因子(IL-1β、IL-18)的檢測 取各組清晨空腹靜脈血4 ml,離心后收集上清,采用ELISA法測定不同組間外周血IL-1β、IL-18、內(nèi)毒素水平,具體操作依據(jù)試劑盒說明書進行。
1.4.6臨床療效的觀察 觀察兩組患者治療后臨床療效,其臨床療效分為痊愈、顯效、有效及無效,具體見中華醫(yī)學(xué)會頒布的SAP診治指南〔9〕。
1.5統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。
2.1兩組治療前后相關(guān)病情嚴(yán)重程度評分比較 與治療前比較,兩組治療后MCTSI評分、Ranson評分及APACHEⅡ評分均顯著降低(P<0.05);而與對照組治療后比較,觀察組治療后上述評分降低程度更顯著(P<0.05),見表1。
表1 兩組治療前后相關(guān)病情嚴(yán)重程度評分比較分)
與治療前比較:1)P<0.05;與對照組治療后比較:2)P<0.05;下表同
2.2兩組治療前后外周血單核細胞NLRP3、Caspase-1 mRNA及蛋白表達水平比較 兩組治療后外周血單核細胞NLRP3、Caspase-1 mRNA及蛋白表達水平均顯著低于治療前(P<0.05);與對照組治療后比較,觀察組治療后上述指標(biāo)明顯降低(P<0.05),見圖1,表2。
1~4:對照組治療前、觀察組治療前、對照組治療后、觀察組治療后圖1 Western印跡檢測各組NLRP3、Caspase-1蛋白表達
表2 兩組治療前后外周血NLRP3、Caspase-1蛋白及mRNA表達水平比較
與治療前比較:1)P<0.05;與對照組治療后比較:2)P<0.05
2.3兩組患者治療前后炎性因子水平比較 與治療前比較,兩組治療后外周血IL-1β、IL-18及內(nèi)毒素水平均明顯降低(P<0.05);而觀察組治療后上述指標(biāo)降低程度較對照組治療后更明顯(P<0.05),見表3。
表3 兩組治療前后炎性因子水平比較
2.4兩組臨床療效比較 觀察組臨床總有效率顯著高于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表4。
表4 兩組臨床療效比較〔n(%),n=50〕
與對照組比較:1)P<0.05
SAP常并發(fā)多器官功能障礙,易出現(xiàn)肺、腎等功能受損,表現(xiàn)為急性呼吸窘迫綜合征和急性腎衰竭,造成病情進展迅速,死亡率極高。大量研究顯示,炎癥反應(yīng)的激活在SAP的發(fā)生及其他部位器官進行性損傷過程中起重要作用,SAP可引起大量促炎因子的激活,導(dǎo)致炎癥反應(yīng)瀑布效應(yīng)及級聯(lián)放大,造成組織器官損傷〔10〕。SAP患者早期即可出現(xiàn)IL-6及TNF-α水平升高,而給予抗感染治療后,其炎性水平可明顯降低,并且與病情嚴(yán)重程度及預(yù)后的改善密切相關(guān)〔11〕。因此,在早期常規(guī)治療的基礎(chǔ)上,給予阻斷炎癥級聯(lián)反應(yīng),調(diào)節(jié)機體免疫平衡,對于SAP的治療至關(guān)重要。
調(diào)節(jié)免疫,改善機體炎癥狀態(tài),對于改善SAP患者病情,提高治療效果有重要意義。相關(guān)研究已證實,由免疫炎性體NLRP3介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在多種疾病如器官缺血再灌注損傷、膿毒癥、惡性腫瘤等的發(fā)生、發(fā)展過程中,發(fā)揮重要作用〔4,12,13〕。NLRP3是由胞質(zhì)內(nèi)多種蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體,其含有凋亡相關(guān)微粒蛋白、Caspase-1等,是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。當(dāng)NLRP3受外在刺激被激活時,活化的Caspase-1隨后激活I(lǐng)L-1β和IL-18,產(chǎn)生炎癥級聯(lián)反應(yīng)。相關(guān)研究顯示,NLRP3可促進炎癥性疾病如慢性阻塞性肺疾病、糖尿病腎病及動脈粥樣硬化等的進展,同時其可作為潛在的治療靶點,如動物實驗表明,抑制NLRP3激活可顯著降低糖尿病腎病的炎癥反應(yīng),改善腎功能及預(yù)后〔5,7,14〕。血必凈注射液是由多種中藥提取而成,具有調(diào)節(jié)機體免疫,抑制炎癥反應(yīng),減輕重要組織器官損傷的作用,已在SAP患者的治療中,得到了廣泛運用〔15〕。血必凈注射液對SAP治療作用的具體機制,同時對老年SAP患者NLRP3炎性小體的表達如何,目前尚不清楚。本研究中,對于老年SAP患者,在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上,給予血必凈注射液,其可顯著改善患者臨床治療效果,主要表現(xiàn)為患者病情嚴(yán)重程度評分,包括MCTSI評分、Ranson評分及APACHEⅡ評分均較對照組顯著降低。動物實驗表明,急性胰腺損傷時,體內(nèi)炎性通路可顯著激活,其NLRP3炎性小體及下游Caspase-1 mRNA、IL-1β及IL-18水平均顯著升高〔16〕。以往研究顯示,炎癥可促進細胞凋亡,而細胞凋亡是引起組織器官功能障礙的主要機制之一,在細胞凋亡通路中,Caspase-1是重要的剪切酶,抑制Caspase-1活性可顯著減輕細胞凋亡〔17〕。本研究結(jié)果顯示,血必凈注射液可顯著降低NLRP3炎性小體及下游相關(guān)炎性通路的激活,其可能與改善患者臨床癥狀及提高治療效果密切相關(guān)。NLRP3炎性小體是炎癥反應(yīng)發(fā)起及進一步放大的重要環(huán)節(jié),有研究顯示,抑制NLRP3炎性小體活性及表達,可顯著降低體內(nèi)炎性細胞因子水平,從而降低炎癥反應(yīng)〔18〕。針對老年SAP患者,血必凈注射液可能通過降低NLRP3炎性小體水平,抑制炎性通路激活,提高臨床療效。