韓昵薇 劉蘭 段妔 張能 吳濤 羅旭

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 1檢驗科，貴州 遵義 563000；2泌尿外科)

膀胱癌具有增殖快，侵襲能力強的特點，嚴(yán)重威脅患者生命安全〔1〕。放化療和手術(shù)是目前臨床治療膀胱癌的主要手段，但療效欠佳，高復(fù)發(fā)率導(dǎo)致患者5年生存率偏低〔2〕。近年來分子生物學(xué)的快速發(fā)展為膀胱癌的治療帶來了新希望，但由于尚未闡明膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，導(dǎo)致缺少膀胱癌診治的分子標(biāo)志物〔3〕。Ras相關(guān)的C3肉毒素底物(Rac)、細胞分裂周期蛋白(Cdc)42等小分子三磷酸鳥苷(GTP)酶共同構(gòu)成了腫瘤發(fā)生與惡化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，p21激活激酶(PAK)是Rac、Cdc42的作用底物，分為Ⅰ類(PAK1、PAK2、PAK3)、Ⅱ類(PAK4、PAK5)〔4〕。研究者發(fā)現(xiàn)，PAK1在肝癌、甲狀腺癌、膀胱癌等多種癌癥組織和細胞中存在高表達，下調(diào)PAK1表達可有效抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移〔5～7〕。本研究通過免疫組化法檢測PAK2在膀胱癌組織中的表達，并通過慢病毒載體轉(zhuǎn)染技術(shù)在體外構(gòu)建PAK2基因沉默的膀胱癌細胞株，探討PAK2表達對膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響。

1 對象與方法

1.1研究對象 2016年6月至2018年3月行手術(shù)治療的膀胱癌患者108例，其中男80例，女28例；年齡26～82〔平均(62.95±9.30)〕歲；腫瘤直徑≤3 cm 72例，>3 cm 36例；病理分級低級別58例，高級別50例；病理分期≤T1期78例，>T1期30例；出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移24例。收集膀胱癌組織標(biāo)本108份，癌旁正常膀胱上皮組織標(biāo)本24份。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者及其家屬簽署知情同意書。

1.2材料與主要試劑 人膀胱癌細胞系BIU-87、人正常膀胱上皮細胞系SV-HUC-1購于上海素爾生物科技有限公司；PAK2基因干擾序列(PAK2-shRNA)、無義序列(siRNA)由上海士鋒生物科技有限公司合成；慢病毒載體購于上海伯易生物科技有限公司；鼠抗人PAK2 單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠免疫球蛋白(Ig)G購于北京博爾邁生物技術(shù)公司。

1.3免疫組化染色 取標(biāo)本組織切片，常規(guī)脫蠟至水，高壓修復(fù)抗原，3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶，封閉20 min后滴加一抗：鼠抗人PAK2 單克隆抗體，1∶200倍稀釋，4℃過夜，滴加HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，室溫孵育1 h。結(jié)果判定：細胞中出現(xiàn)黃色或棕黃褐色為陽性，陽性細胞比例評分標(biāo)準(zhǔn)為：無陽性計0分、陽性細胞比例<25%計1分、25%～50%計2分、51%～75%計3分、>75%計4分。染色強度評分標(biāo)準(zhǔn)：無染色計0分、淡黃色計1分、黃色計2分、棕黃色計3分。以陽性細胞比例評分和染色強度評分之和判斷PAK2表達，0～4分為陰性，5～7分為陽性。

1.4細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 BIU-87和SV-HUC-1細胞均放入含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，5%CO237℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳至5～6代時用于實驗。分別使用含siRNA慢病毒載體(對照組)、PAK2-shRNA慢病毒載體(PAK2基因沉默組)轉(zhuǎn)染BIU-87細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，通過實時熒光-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western印跡驗證BIU-87細胞中PAK2 mRNA和蛋白表達情況。

1.5細胞增殖能力檢測 制備對照組和PAK2基因沉默組細胞懸液，調(diào)整細胞密度至1×105/ml；加入96孔板，100 μl/孔，設(shè)置5個平行對照，放入5%CO237℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μl細胞計數(shù)試劑盒(CCK)-8檢測液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀讀取450 nm波長處的吸光度值。

1.6Transwell細胞遷移和侵襲能力檢測 細胞遷移實驗：取兩組對數(shù)期細胞消化、重懸計數(shù)后，向上室中加入3×105個細胞，下室加入600 μl DMEM完全培養(yǎng)基，5%CO237℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，封片后在光學(xué)顯微鏡下隨機選取10個視野計數(shù)細胞數(shù)量。細胞侵襲實驗：基底膠與不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基按1∶15比例混合，取100 μl加入上室，成膠后加入3×105個細胞，其余步驟同遷移實驗。

1.7RT-PCR檢測 Trizol提取對照組和PAK2基因沉默組細胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。引物序列由南京信帆生物技術(shù)有限公司合成，PAK2引物序列：上游5′-AGTAGTAGGAGTAGAAGACTTTGA-3′，下游5′-GACATATGTGTGCCAGACACTAAA-3′；GAPDH引物序列：上游5′-TAGTAGTCGTTACGGAGGAC-3′，下游5′-TTTACTCGGGGTCGGAAG-3′。反應(yīng)體系30 μl，反應(yīng)條件：95℃ 1 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，共40個循環(huán)，延伸72℃ 5 min。產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，計算目標(biāo)條帶 mRNA的相對表達量。

1.8Western印跡檢測 放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液提取對照組和PAK2基因沉默組細胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量，各點樣孔加入等質(zhì)量的蛋白樣品，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，目標(biāo)蛋白經(jīng)濕法電轉(zhuǎn)膜到聚偏氟乙烯膜，封閉后分別滴加鼠抗人PAK2單克隆抗體(1∶200)、鼠抗人GAPDH多克隆抗體(1∶1 000)，4℃過夜，滴加HRP標(biāo)記的鼠抗人IgG(1∶2 000)，室溫孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光顯色，暗室中顯影，分析各條帶灰度值。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1膀胱癌組織中PAK2表達情況 PAK2呈黃色或棕黃色表達于細胞質(zhì)中，108份膀胱癌組織中PAK2陽性表達56份(51.85%)；24份癌旁正常膀胱上皮組織中PAK2陽性表達2份(8.33%)；膀胱癌組織中PAK2陽性表達率明顯高于癌旁正常膀胱上皮組織(P<0.01)。見圖1。

圖1 PAK2在不同組織中的表達(SP，×200)

2.2不同臨床病理指標(biāo)膀胱癌患者中PAK2陽性率比較 不同腫瘤直徑、病理分級、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的膀胱癌患者中PAK2陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。其中腫瘤直徑>3 cm、病理分級偏高、病理分期>T1、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PAK2陽性率明顯偏高。見表1。

表1 不同臨床病理指標(biāo)膀胱癌患者中PAK2陽性率比較〔n(%)〕

2.3PAK2在不同細胞系中表達情況 SV-HUC-1細胞、BIU-87細胞中PAK2 mRNA相對表達量分別為2.36±0.41、4.21±0.63；PAK2蛋白相對表達量分別為1.95±0.28、3.68±0.50。BIU-87細胞中PAK2 mRNA和蛋白相對表達量明顯高于SV-HUC-1細胞(P<0.05)。見圖2。

圖2 不同細胞中PAK2 mRNA的表達

2.4成功構(gòu)建PAK2基因沉默的人膀胱癌細胞系BIU-87 轉(zhuǎn)染48 h后，對照組、PAK2基因沉默組BIU-87細胞中PAK2 mRNA相對表達量分別為4.18±0.31、0.95±0.17；PAK2蛋白相對表達量分別為3.71±0.28、0.63±0.10。PAK2基因沉默組BIU-87細胞中PAK2 mRNA和蛋白相對表達量明顯低于對照組(P<0.01)。見圖3。

圖3 兩組細胞中PAK2蛋白的表達

2.5兩組細胞增殖情況分析 轉(zhuǎn)染前兩組細胞增殖情況差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；隨著轉(zhuǎn)染時間的延長，對照組和PAK2基因沉默組細胞增殖水平均逐漸增加，轉(zhuǎn)染48 h、72 h 后PAK2基因沉默組細胞增殖情況明顯低于對照組(P<0.01)。見表2。

2.6兩組細胞遷移和侵襲能力比較 Transwell細胞遷移實驗顯示，PAK2基因沉默組遷移細胞數(shù)〔(20.38±5.72)個〕明顯低于對照組〔(56.81±10.95)個,P<0.01〕；細胞侵襲實驗顯示，PAK2基因沉默組侵襲細胞數(shù)〔(14.75±3.90)個〕明顯低于對照組〔(36.29±5.70)個，P<0.01〕。見圖4。

表2 各組細胞增殖情況分析

圖4 Transwell細胞遷移和侵襲實驗(×200)

3 討 論

隨著我國人口老齡化加劇，膀胱癌發(fā)病率呈快速增長趨勢〔8〕；腫瘤細胞的增殖和侵襲是膀胱癌患者病情發(fā)展和死亡的主要原因。細胞核分子結(jié)構(gòu)和染色體變化導(dǎo)致抑癌基因活性喪失或下降，原癌基因被激活，相關(guān)分子通路活化共同促進了膀胱癌的發(fā)生與發(fā)展〔9〕。PAK2為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，介導(dǎo)細胞生長、凋亡等多個過程〔10〕。相關(guān)研究顯示，在胃癌、肝癌等多種惡性腫瘤細胞中均發(fā)現(xiàn)PAK2高表達，且PAK2表達水平與腫瘤細胞生長、轉(zhuǎn)移、凋亡明顯相關(guān)〔11，12〕；但PAK2在膀胱癌組織和細胞中的表達及作用仍鮮有報道。本研究提示PAK2高表達可能介導(dǎo)膀胱癌病情的發(fā)展和惡化，監(jiān)測PAK2表達可用于判斷膀胱癌病變程度，評估患者預(yù)后水平。

相關(guān)研究顯示，PAK2可通過上調(diào)其下游蛋白細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Erk)、蛋白激酶B(Akt)的表達，促進胃癌細胞增殖〔13〕。結(jié)合本研究結(jié)果推測沉默PAK2基因可能通過降低Erk、Akt的活性來抑制膀胱癌細胞增殖。

遷移和侵襲是腫瘤細胞的主要生物學(xué)特征之一，也是導(dǎo)致多數(shù)腫瘤患者死亡的原因，目前仍無較好的防治方法〔14〕；探討影響腫瘤細胞遷移和侵襲的分子機制對改善患者預(yù)后具有重要意義。本研究提示沉默PAK2基因表達可明顯抑制膀胱癌細胞的遷移和侵襲能力。相關(guān)研究顯示，上調(diào)PAK2表達可明顯提升肝癌細胞的遷移和侵襲能力，其作用機制可能與PAK2高表達激活了細胞外調(diào)節(jié)蛋白、應(yīng)激活化蛋白激酶等細胞信號傳遞中的調(diào)控蛋白，介導(dǎo)肝癌細胞的遷移和侵襲過程〔15〕。上述研究與本研究類似，但PAK2基因調(diào)控膀胱癌細胞遷移和侵襲的具體分子機制仍需進一步研究。