李渺苗 邵宏濤 李寧 孔鋮英 孫麗 蔣濤

(1浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第四醫(yī)院呼吸與危重癥學(xué)科，浙江 義烏 322000；2南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院；3江蘇省中醫(yī)藥研究院)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以氣流受限為特征的疾病，氣流受限不完全可逆、并呈進(jìn)行性發(fā)展〔1〕。吸煙是COPD的主要危險(xiǎn)因素，慢性炎癥是COPD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，但令人費(fèi)解的是，即使戒煙后肺部的炎癥仍然存在，所以炎癥一旦啟動(dòng)，就會(huì)一直持續(xù)存在，并進(jìn)行性加重，形成惡性循環(huán)〔2〕。目前缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的COPD動(dòng)物模型構(gòu)建方法，尤其是在停止造模干預(yù)后仍顯示出COPD的特征性變化的造模方法。神經(jīng)生長因子(NGF)在肺組織中廣泛表達(dá)，在不同微環(huán)境下，NGF通過表達(dá)變化及介導(dǎo)細(xì)胞功能的發(fā)揮參與肺部疾病的發(fā)生發(fā)展，如支氣管哮喘、肺結(jié)節(jié)病、肺癌、肺纖維化等〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)香煙刺激COPD大鼠肺巨噬細(xì)胞高表達(dá)NGF〔4〕。因此觀察NGF在COPD、戒煙COPD中的表達(dá)變化有助于進(jìn)一步闡述COPD炎性持續(xù)存在的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠24只，平均體重(145±15)g，清潔級(jí)，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(軍)2012-0014。

1.2試劑與儀器 大豐收牌香煙由中國煙草總公司監(jiān)制(含焦油量11 mg，煙氣煙堿量0.9 mg，煙氣一氧化碳量14 mg)；NGF上下游引物由南京金斯瑞公司合成；總RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自Takara大連寶生物有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為美國ABI StepOne定量PCR儀；大鼠NGF ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3動(dòng)物模型的建立 將24只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組、COPD組，戒煙1個(gè)月COPD組，每組8只。采用單純煙熏法建立COPD大鼠模型：將大鼠置于自制的熏箱(70 cm×50 cm×30 cm)內(nèi)，每次點(diǎn)燃5只香煙，2次/d，共暴露2 h/d，每周5 d，連續(xù)6個(gè)月。戒煙1個(gè)月COPD組：按COPD大鼠模型進(jìn)行香煙刺激6個(gè)月后，停止香煙刺激1個(gè)月。正常對照組亦同時(shí)放入另一相同自制熏箱做偽暴露，余飼養(yǎng)條件相同。

1.4肺組織病理HE染色 2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠(30 mg/kg)，心臟抽血處死，將右上肺浸入4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，脫蠟，HE染色，脫水，透明，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5支氣管肺泡灌洗進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù) 麻醉大鼠后，75%酒精浸泡消毒2～3 min，移至超凈工作臺(tái)，固定四肢，逐步暴露氣管后，絲線結(jié)扎上端氣管防止灌洗液倒流，靜脈留置針行氣管穿刺，成功后退金屬內(nèi)芯并將塑料套管緩慢送入氣管約1 cm，經(jīng)套管注入PBS行支氣管肺泡灌洗，每次5 ml，共6次，灌洗時(shí)輕柔按摩雙肺1 min后回吸。收集灌洗液后，1 000 r/min離心10 min，DMEM重懸細(xì)胞，在光鏡下行有核細(xì)胞計(jì)數(shù)。吸取100 μl細(xì)胞懸液行細(xì)胞涂片，經(jīng)瑞士吉姆薩染色。

1.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定3組大鼠血、肺組織、支氣管肺泡灌洗中NGF蛋白表達(dá) 取3組大鼠右下肺0.5 mg左右，充分剪碎，研磨，加入約 500 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)，充分混勻，5 000 r/min離心10 min，取上清。取3組大鼠血液2 ml，1 000 r/min離心5 min，取上清。收集支氣管灌洗液后，1 000 r/min離心10 min，取上清。配制1 000.0 pg/ml，500.0 pg/ml，250.0 pg/ml，62.5 pg/ml，31.3 pg/ml，15.6 pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品，并依次加入一排7個(gè)孔中，1孔只加樣品稀釋液做為零孔。其余孔加入樣品稀釋液稀釋的上清液100 μl，酶標(biāo)板加上蓋，37℃反應(yīng)90 min，甩去酶標(biāo)板的液體，對著吸水紙拍4次，不洗，加入NGF抗體工作液100 μl，37℃反應(yīng)60 min，甩去液體，PBS洗3次，每次1 min，加入100 μl ABC工作液，37℃反應(yīng)30 min，甩去液體，PBS洗5次，每次1 min，加入90 μl TMB顯色液，37℃避光反應(yīng)25 min，加入100 μl TMB終止液，用酶標(biāo)儀在460 nm測定OD值。

1.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測3組大鼠肺組織、支氣管灌洗液NGF mRNA表達(dá) 按照總RNA提取試劑盒提取的總RNA，并測量RNA的濃度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作合成cDNA，反應(yīng)條件(30 μl反應(yīng)體系)為：37℃ 30 min，85℃ 5 s。NGF上游序列為5′-CACTCTGAGGTGCATAGCGT-3′，下游序列為5′-GCTTCAGGGACAGAGTCTCC-3′，內(nèi)參照GAPDH上游序列為5′-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3′，下游序列為5′-AGGTGGAAGAATGGGAGTTG-3′。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系采用SYBR GreenⅠ，其最終反應(yīng)體系為20 μl，采用兩步法擴(kuò)增，最后得到熒光閾值循環(huán)數(shù)(Ct值)。NGF mRNA相對表達(dá)量用2-ΔΔCt進(jìn)行比較。ΔCt目的基因=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCtCOPD組-ΔCt正常對照組。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行單因素方差分析、LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1大鼠肺組織HE染色 COPD組、戒煙1個(gè)月COPD組大鼠肺組織HE染色均可見肺泡壁變薄、肺泡間隔破裂、肺泡腔不規(guī)則擴(kuò)大，部分融合形成肺大皰，肺氣腫形成明顯，見圖1。

圖1 各組肺組織病理改變(HE，×100)

2.2大鼠肺功能檢測結(jié)果 相比正常對照組，COPD組、戒煙1個(gè)月COPD組肺順應(yīng)性和每分鐘通氣量均明顯下降，氣道阻力明顯升高(均P<0.05)。見表1。COPD組戒煙1個(gè)月COPD組均出現(xiàn)氣流受限，肺通氣功能障礙，即使戒煙，COPD大鼠仍存在肺通氣功能障礙。

2.3支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞分類 正常對照組支氣管灌洗夜中白細(xì)胞總數(shù)及肺泡巨噬細(xì)胞，明顯少于COPD組、戒煙1個(gè)月COPD組(P<0.05)。肺泡巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞所占比例在3組無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表1 各組肺功能檢測結(jié)果

與正常對照組比較：1)P<0.05，下表同

表2 各組支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞總數(shù)及細(xì)胞分類

2.4NGF蛋白的表達(dá) 正常對照組、COPD組、戒煙1個(gè)月COPD大鼠血中NGF蛋白表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。相比正常對照組，COPD組、戒煙1個(gè)月COPD組大鼠肺組織、支氣管肺泡灌洗液中NGF蛋白表達(dá)明顯升高，但兩組間無明顯差異(P>0.05)。見表3。

表3 各組NGF蛋白在血、肺組織、支氣管肺泡灌洗液中的表達(dá)

2.5NGF mRNA的表達(dá) COPD組、戒煙1個(gè)月COPD組大鼠血中NGF mRNA表達(dá)分別是正常對照組的(1.76±0.25)倍及(1.34±0.15)倍，但3組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。COPD組、戒煙1個(gè)月COPD組大鼠肺組織及支氣管肺泡灌洗液中NGF mRNA分別是正常對照組的(24.76±5.99)倍、(25.32±5.45)倍及(23.34±3.50)倍、(26.32±7.45)倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。COPD組與戒煙1個(gè)月COPD組大鼠肺組織、支氣管肺泡灌洗液NGF mRNA表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。

3 討 論

目前根據(jù)COPD的致傷因素把COPD模型的建立方法分為單一因素誘導(dǎo)、復(fù)合因素誘導(dǎo)模型〔5〕。單一因素包括：吸入有毒、有害氣體(香煙煙霧、二氧化硫、氯化鎘等)〔6〕；氣管內(nèi)注入豬胰彈性蛋白酶、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶、LPS等化學(xué)藥物；鼻多次吸入肺炎克雷伯桿菌、肺炎鏈球菌；基因調(diào)控模型〔7〕。復(fù)合因素建立在慢性煙霧暴露基礎(chǔ)上聯(lián)合氣管內(nèi)注入蛋白酶或脂多糖〔8〕。關(guān)于采用何種動(dòng)物模型，主要根據(jù)臨床上常見的誘因、研究目的、動(dòng)物種屬和實(shí)驗(yàn)條件決定。吸煙是導(dǎo)致COPD發(fā)生發(fā)展的最主要環(huán)境因素，90%的COPD患者為吸煙者，香煙煙霧中含有一氧化碳、氮氧化物、氨、丙烯醛、對苯二酚、煙堿、氫氰酸等在內(nèi)的4 500多種化合物。吸入這些有害物質(zhì)可以使氣道纖毛脫落、倒伏、不規(guī)則，纖毛運(yùn)動(dòng)發(fā)生障礙，降低局部清除能力，并直接損傷氣道上皮細(xì)胞，增加病毒及細(xì)菌的感染，引起支氣管痙攣，增加氣道阻力〔9〕，長期的煙霧刺激還使黏膜下腺體過度增生，杯狀細(xì)胞分泌過多，加強(qiáng)氣道阻塞，大量氧化劑和自由基可以激活巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞(尤其是CD8+T細(xì)胞)、中性粒細(xì)胞在肺部浸潤，激活的這些炎性細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素8、腫瘤壞死因子等多種炎性因子及中性粒細(xì)胞蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、α-胰蛋白酶等蛋白酶類從而引起氣道、肺實(shí)質(zhì)、肺血管的慢性炎癥和肺組織的破壞〔10〕。因此單一煙熏模型更符合COPD的發(fā)病過程和病理改變，被動(dòng)吸煙可以誘導(dǎo)出最真實(shí)的COPD〔11〕，因此本實(shí)驗(yàn)采用單一煙熏法建立COPD模型。

煙霧暴露的時(shí)間要長達(dá)數(shù)月〔12〕，如6個(gè)月或者更長時(shí)間可使肺氣腫形成越典型，可能是因?yàn)榉螌?shí)質(zhì)的修復(fù)相關(guān)的基因在香煙暴露3個(gè)月時(shí)明顯下降，6個(gè)月時(shí)下調(diào)更明顯，從而造成肺實(shí)質(zhì)的破壞，形成肺氣腫〔9〕，其中以大鼠、小鼠、豚鼠最為常用。有研究顯示SD大鼠每天暴露于10支香煙的煙霧中，連續(xù)16 w，肺病理顯示肺氣腫形成，支氣管周圍及血管周圍炎性細(xì)胞浸潤，可以成功復(fù)制COPD模型〔13〕。若每次同時(shí)點(diǎn)燃5支香煙，每天暴露4次，每周6 d，連續(xù)80 d，肺功能及肺組織病理提示也可以成功建立COPD模型。若采用早晚各1次，每次1 h，1支香煙燃燒約15 min，間隔5 min，再燃燒另1支，每次共燃燒3支香煙的方法，連續(xù)36 w，24 w時(shí)成功復(fù)制肺氣腫及氣道重塑模型，但肺功能在36 w時(shí)才有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異〔14〕。在臨床中，即使戒煙，COPD的炎癥仍繼續(xù)發(fā)展，肺功能仍在下降，建立戒煙后COPD模型利于對COPD發(fā)病機(jī)制的探討〔5〕。因此延長被動(dòng)吸煙時(shí)間、加大煙霧刺激量，采用6個(gè)月單純煙煙熏法建立的COPD模型，即使戒煙，大鼠肺組織HE染色仍證實(shí)肺氣腫、肺大泡的形成，肺功能證提示氣流仍受限，支氣管灌洗液中炎性細(xì)胞持續(xù)浸潤，這對研究COPD發(fā)生發(fā)展的機(jī)制提供良好的動(dòng)物模型。

體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明NGF介導(dǎo)細(xì)胞的存活、增生、分化和活化。NGF在肺組織的結(jié)構(gòu)細(xì)胞及炎性細(xì)胞有一定的基礎(chǔ)量表達(dá)，這有助于細(xì)胞的存活及生理功能的發(fā)揮〔15〕。有研究表明如果肺組織缺乏NGF受體，動(dòng)物的早期死亡率升高，NGF可能通過上調(diào)bcl-2表達(dá)及激活核轉(zhuǎn)錄因子κB抑制單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞、上皮細(xì)胞、B細(xì)胞的凋亡〔16〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示NGF持續(xù)參與COPD肺部炎性反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)觀察到香煙刺激的大鼠氣管灌洗夜中中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞數(shù)目明顯增多，這與相關(guān)研究相同〔17〕。肺泡巨噬細(xì)胞強(qiáng)大的吞噬作用、抗原提呈能力，分泌及調(diào)節(jié)炎性因子和蛋白酶的功能在COPD發(fā)病中起到關(guān)鍵作用〔18〕，在COPD急性發(fā)作期，中性粒細(xì)胞浸潤增多〔19〕。研究表明NGF可以上調(diào)單核巨噬細(xì)胞表面趨化因子受體4，增強(qiáng)其趨化性。在脂多糖刺激下，單核巨噬細(xì)胞高表達(dá)NGF和TrkA，并呈濃度、時(shí)間依賴性，高表達(dá)的NGF通過結(jié)合單核細(xì)胞表面的TrkA激活ERK1/2及部分c-Jun氨基末端激酶上調(diào)腫瘤壞死因子-α表達(dá)，而預(yù)先用NGF抗體拮抗內(nèi)源性NGF后，在脂多糖刺激下單核巨噬細(xì)胞凋亡明顯增多〔20〕。以上研究提示在急性炎癥時(shí)，NGF介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的存活并調(diào)節(jié)功能的發(fā)揮。在我們前期研究發(fā)現(xiàn)，香煙刺激COPD大鼠肺泡巨噬細(xì)胞高表達(dá)NGF及其受體〔4〕，增多的NGF與受體TrkA結(jié)合是否介導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞在肺部的存活及調(diào)控細(xì)胞功能，從而參與COPD的進(jìn)程，這需要深入研究。