向談婷，劉衛(wèi)容，方守國

（長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，荊州 434025）

雞傳染性支氣管炎（infectious bronchitis，IB）是由傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）引起的一種急性并具有高度接觸傳染性的呼吸道疾病，是危害世界養(yǎng)雞業(yè)的主要疫病之一[1-2]。IBV屬于單股正鏈 RNA病毒[3]，血清型多且復(fù)雜，目前對該病毒的預(yù)防和治療存在著許多困難[4]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，在抗病毒上，中草藥具有相當(dāng)優(yōu)勢[5]。射干味苦、性寒、清熱解毒、消痰利咽，在臨床上應(yīng)用廣泛[6]。射干主要化學(xué)成分包括黃酮類和三萜類化合物，其中異黃酮類具有廣泛的藥理活性[7]。溫雯等[8]發(fā)現(xiàn)射干提取物對慢性咽炎的治療作用可能是通過降低血清及肺組織中IgE水平，抑制血清及咽喉組織中IL-4和LTC4的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。王振飛等[9]證實(shí)射干可以抑制肺癌細(xì)胞的惡性行為，具有良好的抗肺癌應(yīng)用價(jià)值。劉雨娟等[10]在觀察射干對河西走廊地區(qū)沙塵所致大鼠慢性咽炎的保護(hù)作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)射干阻斷沙塵損傷咽部組織的作用機(jī)制可能是通過TNF-α受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、下調(diào)NF-κB的表達(dá)水平而發(fā)揮作用。王光函等[11]證明射干提取物能明顯降低豚鼠模型BALF中炎性細(xì)胞數(shù)量，影響細(xì)胞因子水平變化，減輕肺組織炎癥。目前對射干的研究多集中對咽喉腫痛、咳嗽、氣喘等疾病的治療作用，探究其抗病毒活性的研究甚少。本研究對射干乙醇提取物（簡稱為提取物）體外抗IBV活性以及對 IFN-β的調(diào)控作用進(jìn)行了研究。

表1 引物序列Table1 Primer sequences

1 材料與方法

1.1 藥物中草藥射干購于湖北省荊州市第一人民醫(yī)院中藥房，磨碎稱重后用一定體積的80%乙醇浸泡7 d以上，初始濃度為0.734 g/mL，離心取上清，用直徑為0.22 μm的過濾器過濾除菌備用。

1.2 細(xì)胞株與病毒供試細(xì)胞H1299（人肺癌細(xì)胞系）由新加坡南洋理工大學(xué)生物學(xué)院病毒實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；rIBV由長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室成員構(gòu)建。

1.3 試劑與儀器RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自Gibco公司；乙醇購自天津市天力化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，分析純；熒光定量試劑（RR047A）購自TaKaRa公司；IBV-N一抗由新加坡南洋理工大學(xué)生物學(xué)院病毒實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.4 測定最大無毒濃度使用MTT（3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）法測定最大無毒濃度，參照參考文獻(xiàn)[12]。

1.5 RT-qPCR和Western blot檢測IBV感染H1299細(xì)胞2 h后，提取物處理被IBV感染的H1299細(xì)胞，設(shè)置病毒加藥組、病毒對照組、乙醇對照組、空白對照組，繼續(xù)培養(yǎng)16～24 h，收獲細(xì)胞。按照Trizol試劑盒說明書提取總RNA。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)步驟參照熒光定量試劑盒說明書，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 30 s，94℃變性 5 s，60℃退火 30 s，40個(gè)循環(huán)。所用引物序列見表1。Western blot實(shí)驗(yàn)步驟：將處理好的細(xì)胞樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，經(jīng)5%脫脂乳封閉，以IBV-N上清為一抗，羊抗兔HRP-IgG（1∶1000）為二抗，通過底物顯色進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 MTT檢測結(jié)果提取物作用16～24 h后，加入MTT在細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞周圍形成紫藍(lán)色甲臜結(jié)晶，利用酶標(biāo)儀測OD值。當(dāng)提取物濃度為0.367、0.1835、0.0918、0.0459 g/mL時(shí)，OD值與對照組OD值比較差異不顯著，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明該濃度對細(xì)胞生長無抑制作用。如圖1當(dāng)提取物的濃度為0.734 g/mL，其OD值小于其他提取物濃度的OD值，差異顯著具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明僅原始濃度對細(xì)胞的生長存在抑制作用，因此將提取物濃度為0.367 g/mL時(shí)，確定為最大無毒濃度。

2.2 RT-qPCR檢測采用RT-qPCR法對IBV-N和IFN-β基因進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示（圖2A），病毒加藥組IBV-N mRNA的表達(dá)量低于病毒對照組，差異極極顯著，具有極極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），表明提取物具有抗病毒活性。IFN-β是一種抗病毒因子，病毒侵染細(xì)胞后，會(huì)引起一系列的免疫反應(yīng)，促進(jìn)IFN-β的產(chǎn)生，為進(jìn)一步探究提取物抗IBV的作用機(jī)制，本研究對IFN-β mRNA表達(dá)量進(jìn)行了檢測，由圖2B可知，病毒加藥組IFN-β mRNA的表達(dá)量要低于病毒對照組，差異極顯著，具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），證實(shí)提取物能夠調(diào)控IFN-β的表達(dá)量，推測提取物中含有與IFN-β作用相同的成分，發(fā)揮抗病毒作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明提取物具有抗IBV活性，但中藥的成分復(fù)雜，多種有效成分均可作用于不同的靶點(diǎn)、不同環(huán)節(jié)產(chǎn)生多種藥理作用，具體哪一種或哪幾種有效成分起到抗病毒作用還有待進(jìn)一步研究。

2.3 Western blot檢測利用抗原抗體的特異性結(jié)合，檢測病毒N蛋白的表達(dá)量，從蛋白質(zhì)水平檢測提取物的抗病毒活性。結(jié)果顯示（圖3），病毒加藥組IBV-N蛋白的表達(dá)量低于病毒對照組，證明提取物具有抗IBV作用。所得結(jié)果與RT-qPCR檢測結(jié)果一致。

圖1 MTT法檢測最大無毒濃度Fig.1 The maximum toxic concentration determined by MTT assay

圖2 RT-qPCR檢測細(xì)胞因子的表達(dá)（＊＊P＜0.01,＊＊＊P＜0.001）Fig.2 Expression of cytokines detected by RT-qPCR（＊＊P＜0.01, ＊＊＊P＜0.001）

圖3 IBV-N蛋白表達(dá)量Fig.3 Expression of IBV-N protein