楊佳冰，米榮升，張燁華，王進香，陳兆國，于三科

（1. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，楊凌 712100；2. 寧夏回族自治區(qū)動物疾病預(yù)防控制中心，銀川750011；3. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物產(chǎn)品質(zhì)量安全生物性危害因子風(fēng)險評估實驗室（上海）農(nóng)業(yè)農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點實驗室，上海200241）

隱孢子蟲（Cryptosporidiumspp.）是一種人獸共患機會性致病原蟲，可寄生于人類和其他脊椎動物呼吸道或消化道上皮細胞中，是導(dǎo)致人類和幼畜腹瀉的重要病原之一，呈世界性分布[1]。羊感染隱孢子蟲主要對羔羊致病，較輕的會阻礙羔羊生長，影響皮毛質(zhì)量，重者會引發(fā)腹瀉，甚至死亡，給養(yǎng)羊業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失[2]。

目前報道的隱孢子蟲蟲種多達30多種，大部分蟲種形態(tài)學(xué)非常相似，僅利用常規(guī)的顯微鏡檢查很難鑒別蟲種。因此，近些年來，關(guān)于隱孢子蟲蟲種的鑒定，多采用分子生物學(xué)方法。以往的研究表明，能夠感染羊的隱孢子蟲蟲種有安氏隱孢子蟲（Cryptosporidium andersoni，C.andersoni）、牛隱孢子蟲（C. bovis）、犬隱孢子蟲（C. canis）、費氏隱孢子蟲（C. fayeri）、人隱孢子蟲（C. hominis）、微小隱孢子蟲（C. parvum）、瑞氏隱孢子蟲（C. ryanae）、母豬隱孢子蟲（C.scrofarum）、豬隱孢子蟲（C. suis）、泛在隱孢子蟲（C. ubiquitum）、肖氏隱孢子蟲（C. xiaoi）和隱孢子蟲綿羊基因型I（Cryptosporidiumsheep genotype I）[3-7]。其中，微小隱孢子蟲（C. parvum）、泛在隱孢子蟲（C. ubiquitum）和肖氏隱孢子蟲（C.xiaoi）是感染羊的3個常見蟲種[3]。這些蟲種絕大多數(shù)都是人獸共患的蟲種，因此，弄清羊感染的隱孢子蟲的蟲種，對于制定隱孢子蟲病的防控計劃，減少對人群的危害具有重要的意義。

寧夏養(yǎng)羊業(yè)是畜牧業(yè)重要的產(chǎn)業(yè)支柱，然而，關(guān)于寧夏羊隱孢子蟲病的研究還非常少，僅見楊建民等[8]對寧夏銀川和固原地區(qū)進行隱孢子蟲感染情況調(diào)查，未進行蟲種或基因型鑒定，以及人獸共患隱孢子蟲病風(fēng)險評估。吳忠地區(qū)是寧夏重要的羊核心產(chǎn)業(yè)帶，為了解寧夏吳忠市羊隱孢子蟲病分子流行情況，本研究對該地區(qū)2個規(guī)模羊場進行了糞便樣品采集，應(yīng)用基于隱孢子蟲小亞基核糖體RNA（SSU rRNA）基因的巢氏PCR檢測方法，對采集的樣品進行分子檢測，該檢測結(jié)果對了解該地區(qū)羊感染的隱孢子蟲是否存在人獸共患風(fēng)險，以及該地區(qū)羊隱孢子蟲病的防控措施制定提供數(shù)據(jù)支持；同時，對減少隱孢子蟲病對羊的危害，提高該地區(qū)養(yǎng)羊業(yè)的經(jīng)濟效益具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料微小隱孢子蟲（C. parvum）陽性DNA由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動物源性病原生物學(xué)與食品安全創(chuàng)新團隊提供。FastDNA SPIN Kit for Soil基因組DNA提取試劑盒、牛血清白蛋白（BSA）購自美國MP公司；瓊脂糖購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；DL2000 DNA Marker購自天根生化科技有限公司；KOD FX DNA聚合酶購自東洋紡生物科技有限公司。

1.2 樣品采集與處理2016年11月～2017年9月，選取寧夏吳忠市鹽池縣和同心縣的2個規(guī)模羊場進行樣品采集。用無菌棉簽通過直腸進行直接取樣，置于10 mL離心管中。樣本做好采樣時間、地點、日齡等相關(guān)信息標記，于低溫保存箱保存，迅速帶回實驗室。所有樣品置于4℃冰箱，一周內(nèi)處理完畢。

1.3 樣品的處理及DNA提取將保存在10 mL離心管中的糞便樣品加2 mLPBS，吸管反復(fù)吹打沖洗，取1 mL于2 mL無菌離心管中，用于DNA提取，剩余樣品 -20℃保存，備用。按照FastDNA SPIN Kit for Soil試劑盒操作說明提取樣品DNA，提取的DNA-20℃保存，待檢。

1.4 引物的合成及樣品擴增參照參考文獻[9]的巢式PCR引物序列，送賽默飛世爾科技（中國）有限公司合成引物。PCR的反應(yīng)體系：2×PCR buffer 12.5 μL，2 mmol/L dNTP 4 μL，10 μmol/L下游引物各0.5 μL，20 mg/mL BSA 1μL，DNA模板1 μL，1 U/μL KOD酶0.5 μL，加ddH2O補至25 μL；第二輪反應(yīng)體系中除引物換成第二輪上下游引物以外，其余成分不變，DNA模板為第一輪PCR產(chǎn)物取1 μL。每一次PCR反應(yīng)，均設(shè)陽性和陰性對照。兩輪PCR反應(yīng)條件相同，擴增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，56℃退火 45 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min；第二輪退火溫度為60℃，其余不變。PCR擴增結(jié)束以后，取5 μL第二輪擴增產(chǎn)物進行瓊脂凝膠電泳鑒定。

1.5 陽性樣品序列測定及蟲種鑒定將電泳鑒定正確的所有陽性樣品均送賽默飛世爾科技（中國）有限公司測序。對測序結(jié)果進行Blast（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對分析，鑒定羊感染的蟲種或基因型。

1.6 陽性樣品系統(tǒng)發(fā)育分析從GenBank下載不同種隱孢子蟲的SSU rRNA基因序列，與本試驗獲得的序列，利用MEGA 7.0軟件進行系統(tǒng)進化樹分析，進一步確認寧夏地區(qū)感染的羊隱孢子蟲的蟲種或基因型。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析通過SPSS 21.0軟件對獲得的數(shù)據(jù)進行卡方檢驗（χ2），比較不同品種、不同日齡以及不同季節(jié)之間感染率的差異是否顯著。當P＞0.05時，判定為差異不顯著，不具有統(tǒng)計學(xué)意義；當P≤0.05時，判定為差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樣品PCR擴增及序列分析以提取的綿羊和山羊樣品DNA為模板，進行隱孢子蟲SSU rRNA基因巢式PCR擴增。結(jié)果顯示，陽性對照組和部分樣品成功地擴增出了特異性片段，大小約為830 bp，與預(yù)期大小相符（圖1）。對所有陽性PCR產(chǎn)物進行測序，序列經(jīng)Blast比對發(fā)現(xiàn)，所有陽性樣品序列均存在與GenBank登錄的相同蟲種100% 同源序列。序列分析結(jié)果表明，該地區(qū)綿羊和山羊存在3種隱孢子蟲感染，為C. xiaoi、C. ubiquitum和C. parvum，感染率分別為62.5%（85/136）、32.4%（42/136）和5.6%（7/136），見表1。

圖1 部分樣品PCR擴增結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of PCR amplification products of partial samples

2.2 不同品種羊隱孢子蟲感染情況本次調(diào)查分別選取寧夏吳忠市鹽池縣1個綿羊養(yǎng)殖場和同心縣1個山羊養(yǎng)殖場進行隱孢子蟲分子檢測，共采集樣品480份，發(fā)現(xiàn)136份陽性樣品，陽性率為28.3%。其中，綿羊的感染率為33.8%（81/240），山羊的感染率為22.9%（55/240），不同品種的羊感染率存在顯著性差異（χ2=6.936，p＜0.05）。不同品種的羊，隱孢子蟲蟲種的分布也存在差異，其中綿羊感染的優(yōu)勢種為C. xiaoi（72.8%），而山羊中C. xiaoi（47.3%）和C. ubiquitum（50.9%）的感染率相似，兩種羊中均是C. parvum感染率最低，見表1。

2.3 不同季節(jié)羊隱孢子蟲感染情況本次調(diào)查，2個羊場在四個季節(jié)均進行了采樣，結(jié)果顯示，春季的感染率最高（49.2%），其次是冬季（33.3%），秋季（24.2%），夏季的感染率最低（6.7%），不同季節(jié)之間感染率差異顯著（χ2=55.896，p＜0.05）。從感染的蟲種分布來看，春季和冬季C. xiaoi是優(yōu)勢種，秋季C. ubiquitum是優(yōu)勢種，而夏季C. xiaoi和C.parvum感染率相同，并且并未發(fā)現(xiàn)C. ubiquitum感染（表2）。

2.4 不同日齡羊隱孢子蟲的感染情況本次調(diào)查，分3個日齡階段進行取樣。研究發(fā)現(xiàn)未斷奶羔羊感染率最高（34.4%），其次是斷奶后羔羊（31.3%），成年羊感染率最低（19.4%）。其中，未斷奶與斷奶后羔羊感染率差異不顯著（χ2=0.354，p＞0.05），羔羊與成年羊感染率差異顯著（χ2=9.875，p＜0.05）。從感染的蟲種來看，三個日齡段均是C.xiaoi感染率最高，其次是C. ubiquitum，C. parvum的感染率最低，見表3。

2.5 羊隱孢子蟲系統(tǒng)進化樹分析從GenBank上下載隱孢子蟲不同種SSU rRNA基因序列，同本研究獲得部分隱孢子蟲陽性序列進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建。結(jié)果表明，本研究所獲得的陽性樣品序列與相對應(yīng)的GenBank下載的C. parvum、C. xiaoi和C. ubiquitum序列在同一個分枝上，見圖2。

表1 綿羊和山羊隱孢子蟲分子流行情況Table 1 Prevalence and molecular characterization of Cryptosporidium spp. in sheep and goats

表2 不同季節(jié)羊隱孢子蟲的感染情況Table 2 Prevalence and molecular characterization of Cryptosporidium spp. in different seasons in sheep and goats

3討論

養(yǎng)羊業(yè)是畜牧業(yè)的重要組成部分，近年來，我國養(yǎng)羊業(yè)取得了較快的發(fā)展，隨著產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整步伐的加快，養(yǎng)羊業(yè)比重不斷增加，已成為推動我國農(nóng)村經(jīng)濟發(fā)展的重要產(chǎn)業(yè)。然而，羊傳染病、寄生蟲病已經(jīng)嚴重制約我國養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展，部分人獸共患羊傳染病已經(jīng)嚴重威脅公共衛(wèi)生安全。羊隱孢子蟲病呈世界性分布，我國多個省市均有報道，其中綿羊的感染率為0.9%～34.7%[10-11]，山羊的感染率為0.2%～57.6%[12-14]。目前，關(guān)于我國羊隱孢子蟲感染的報道，絕大多數(shù)以常規(guī)鏡檢為主，然而不同種隱孢子蟲在形態(tài)學(xué)上非常相似，因此，光靠鏡檢很難區(qū)分羊感染的隱孢子蟲蟲種或基因型，沒有辦法評估哪些蟲種能夠?qū)θ巳捍嬖跐撛诘娘L(fēng)險。近年來，基于隱孢子蟲SSU rRNA基因為分子靶標的巢式PCR檢測方法被廣泛使用，該方法能夠鑒定絕大多數(shù)隱孢子蟲的蟲種或基因型。因此，本研究采用此方法，對吳忠市2個養(yǎng)殖場的綿羊和山羊進行了隱孢子蟲分子流行病學(xué)調(diào)查。結(jié)果顯示，該地區(qū)羊隱孢子蟲總的感染率為28.3%，其中鹽池縣綿羊陽性率為33.8%，同心縣山羊陽性率為22.9%。到目前為止，寧夏地區(qū)羊隱孢子蟲感染情況的報道還非常少，僅見楊建民等[8]對寧夏銀川和固原地區(qū)綿羊和山羊的常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測。其中，山羊的感染率（22.7%）與本研究相似，而綿羊的感染率（22.3%）則低于本次調(diào)查結(jié)果[8]。造成這些差異的原因可能與檢測方法不同或采樣的地區(qū)不同有關(guān)。

表3 不同日齡羊隱孢子蟲的感染情況Table 3 Prevalence and molecular characterization of Cryptosporidium spp. in different sheep and goats groups

圖2 基于隱孢子蟲SSU rRNA基因的系統(tǒng)進化樹分析Fig. 2 Phylogenetic tree of Cryptosporidium spp. constructed based on SSU rRNA nucleotide sequence

近年來，隨著分子生物學(xué)檢測方法的廣泛應(yīng)用，我國已經(jīng)有部分關(guān)于羊感染隱孢子蟲的報道[3,7,15-23]。以往的研究表明，不同地區(qū)羊感染的隱孢子蟲蟲種存在差異。以山羊的研究為例，Karanis等[15]首次報道我國青海山羊感染的隱孢子蟲為C.xiaoi；隨后對我國廣東省、湖北省、山東省、上海市、陜西省等省市的研究也發(fā)現(xiàn)，C. xiaoi是山羊感染的優(yōu)勢蟲種[16-17]；而Wang等[18]對河南省和重慶市山羊隱孢子蟲調(diào)查發(fā)現(xiàn)，C. ubiquitum是優(yōu)勢種。與以往的研究不同，本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)C. xiaoi（47.3%）和C. ubiquitum（50.9%）的感染率相似。在綿羊的研究方面，Wang等[19]首次報道我國河南綿羊感染的隱孢子蟲優(yōu)勢種為Cryptosporidiumcervine genotype（C. ubiquitum），Shen等[20]對四川的綿羊研究也發(fā)現(xiàn)C. ubiquitum是優(yōu)勢種，而對內(nèi)蒙古自治區(qū)和青海省綿羊研究發(fā)現(xiàn)C. xiaoi是優(yōu)勢種[3,21]。與內(nèi)蒙古自治區(qū)和青海省地區(qū)的綿羊報道相似，本研究也發(fā)現(xiàn)C.xiaoi是綿羊感染的優(yōu)勢種。因此，我們推測羊感染隱孢子蟲的蟲種分布因地域的不同而有所差別。

本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)不同季節(jié)羊的感染率差異顯著，其中春季和冬季更易感，而夏季感染率最低，這與崔彬等[24]對河南山羊的研究相似，該研究應(yīng)用顯微鏡檢法，發(fā)現(xiàn)春季隱孢子蟲的感染率最高（3.1%），夏季最低（1.0%）。與本研究不同，朱丹等[14]對來自河南省、安徽省、重慶市、青海省和內(nèi)蒙古自治區(qū)5個省市區(qū)的山羊的調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)秋季的感染率較高（4.6%）；李夢婕等[25]對來自河南省、吉林省、遼寧省和山東省4個省的綿羊的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，夏季的感染率最高（6.4%）；Maurya等[26]報道印度雨季后羊隱孢子蟲感染率最高；Ahamed等[27]發(fā)現(xiàn)，在印度查謨區(qū)（Jammu district）冬季羔羊隱孢子蟲感染率最高（73.3%）。因此，隱孢子蟲感染是否與季節(jié)相關(guān)，目前還不能確定，需要進一步的研究。

從感染的不同年齡來看，本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)羔羊更易感，隨著年齡的增長，隱孢子蟲的感染率逐漸下降，且3個年齡段的優(yōu)勢蟲種均為C. xiaoi。該結(jié)果與Mi等[16]對廣東省、湖北省、山東省和上海市4個地區(qū)山羊的調(diào)查，以及Li等[21]對青海省綿羊的調(diào)查結(jié)果相似，這兩篇報道均發(fā)現(xiàn)斷奶前羔羊感染率最高，同時C. xiaoi也是優(yōu)勢種。而Wang等[19]對河南綿羊隱孢子蟲調(diào)查也發(fā)現(xiàn)斷奶前羔羊感染率最高，但優(yōu)勢蟲種為C. ubiquitum。與本研究不同，Wang等[18]對河南和重慶山羊隱孢子蟲的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)斷奶后山羊感染率最高，C. ubiquitum是優(yōu)勢蟲種；Ye等[3]對內(nèi)蒙古綿羊的調(diào)查，也發(fā)現(xiàn)斷奶后綿羊感染率最高，但C. xiaoi是優(yōu)勢蟲種。造成這些結(jié)果的差異可能與采樣地區(qū)、采樣的季節(jié)不同有關(guān)。

綜上所述，本研究利用巢式PCR檢測方法，對來自寧夏回族自治區(qū)吳忠市2個規(guī)模養(yǎng)殖場的綿羊和山羊進行了隱孢子蟲檢測。結(jié)果顯示，該地區(qū)羊總的感染率為28.3%，綿羊的感染率（33.8%）要高于山羊（22.9%）。共存在3種隱孢子蟲感染，分別是C. xiaoi（62.5%）、C. ubiquitum（32.4%） 和C.parvum（5.6%），其中C. parvum和C. ubiquitum均是人獸共患的蟲種，需要引起重視。研究結(jié)果表明，不同季節(jié)感染率不同，其中春季的感染率最高；不同日齡感染率也不相同，羔羊的感染率最高。本研究首次報道了寧夏吳忠市羊感染隱孢子蟲的蟲種分布情況，研究結(jié)果為評估該地區(qū)羊隱孢子蟲病對人群的風(fēng)險提供參考，也為制定羊隱孢子蟲病防控措施提供數(shù)據(jù)支持。