姚 威，孫海偉，霍 娜，于婉琪，蕭 颯，陳鴻軍

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌712100）

類(lèi)泛素蛋白NEDD8（neural precursor cell expressed developmentally down-regulated 8）最初的報(bào)道是在小鼠胚胎的腦組織中高度富集的新的mRNA[1]。NEDD8含有81個(gè)氨基酸，是一種類(lèi)泛素蛋白修飾分子，與泛素分子的一致性為59%，相似性高達(dá)80%，其相似程度是眾多類(lèi)泛素分子中最高的[2]。研究表明，Nedd8能像泛素一樣在體內(nèi)固有酶促作用下被共價(jià)結(jié)合到底物蛋白上，參與蛋白質(zhì)翻譯后修飾，這一過(guò)程被稱(chēng)為NEDDylation[3]。NEDDylation的發(fā)生機(jī)制與泛素化（Ubiquitination）[4]和SUMOylation[5-6]相似，成熟的NEDD8分子可以通過(guò)其C端的甘氨酸與UBA3半胱氨酸活性位點(diǎn)形成一個(gè)高能量的硫酯鍵，UBA3是NEDD8活化酶（E1）（APPBP1和UBA3組成的異源二聚體）的催化亞單位且具有ATP依賴(lài)性。而后，活化的NEDD8被轉(zhuǎn)移到結(jié)合酶E2（Ubc12/UBE2M或UBE2F）的半胱氨酸活性位點(diǎn)并形成硫酯鍵，最后，NEDD8被E3連接酶帶到相應(yīng)的底物蛋白的賴(lài)氨酸殘基形成異肽鍵[7-8]。

迄今為止，NEDDylation修飾的底物尚未完全明確，本研究制備特異性抗NEDD8單抗，取代商品化的NEDD8抗體，進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)，旨在以此作為工具鑒定NEDDylation的底物。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人胚腎293T細(xì)胞系、小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞系為本實(shí)驗(yàn)室保存；BALB/c小鼠購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海斯萊克動(dòng)物研究中心。

1.2 載體與主要試劑pET30a（+）原核表達(dá)載體及pcDNA3.1-2×Flag真核表達(dá)載體為本實(shí)驗(yàn)室保存；BamH I、XhoI等限制性核酸內(nèi)切酶以及T4 DNA連接酶均為公司產(chǎn)品；Phanta MaxSuper-Fidelity DNA聚合酶購(gòu)自南京諾唯贊生物公司；單抗（mAb）亞類(lèi)鑒定試劑盒購(gòu)自Southern biotech公司；3, 3, 5, 5'-四甲基聯(lián)苯胺底物顯色液；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司；Hybri-Max聚乙二醇融合試劑盒、辣根過(guò)氧化酶酶標(biāo)兔抗小鼠IgG、完全弗氏佐劑以及不完全弗氏佐劑均為為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；RPMI-1640培養(yǎng)基、HAT培養(yǎng)基、HT培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Cullin-1抗體D-5購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.3 NEDD8 PCR擴(kuò)增參照人源nedd8基因核苷酸序列（GenBank登錄號(hào)：CR407662.1），設(shè)計(jì)并合成了擴(kuò)增nedd8基因全長(zhǎng)的特異性引物。上游引物nedd8-F：5'-CGCGGATCCATGCTAATTAAAGTG AAGACGCTGA-3'；下游引物nedd8-F：5'-GCCC TCGAGTCACTGCCTAAGACCACCTCCTCCT-3'，引物由蘇州金唯智公司合成。收取A549細(xì)胞，利用Qiagen RNeasy試劑盒進(jìn)行RNA提取，以此為模板，利用隨機(jī)引物N9反轉(zhuǎn)錄為cDNA，常規(guī)擴(kuò)增nedd8基因。

1.4 重組原核表達(dá)載體及真核表達(dá)載體的構(gòu)建將PCR擴(kuò)增得到的目的片段用BamH I和XhoI進(jìn)行雙酶切，與同樣進(jìn)行雙酶切的pET30a、pcDNA3.1-2×Flag載體4℃連接過(guò)夜。然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取的質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切鑒定后，挑選出疑似陽(yáng)性重組子的克隆送往蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行最終測(cè)序，篩選出陽(yáng)性重組子，原核或真核重組質(zhì)粒分別命名為pET30-Nedd8、pFlag-Nedd8。

1.5 NEDD8蛋白原核表達(dá)及鑒定將陽(yáng)性重組原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取獨(dú)立菌落于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日以1∶100轉(zhuǎn)接至含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)至OD600值達(dá)0.4～0.6時(shí)，用最終濃度為0.1～1 mmol/L的IPTG在不同溫度、時(shí)間培養(yǎng)體系進(jìn)行誘導(dǎo)，確定最終的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。以最佳的表達(dá)條件進(jìn)行大量誘導(dǎo)，然后4℃離心，將離心所得的菌體送往吉爾生化（上海）有限公司進(jìn)行純化及濃縮，最后將得到的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.6 小鼠免疫及抗體制備取經(jīng)過(guò)純化的His-NEDD8蛋白為免疫原疫腹腔注射6周齡的BALB/c雌性小鼠，每隔7 d免疫一次，每次免疫量為50 μg。一免用等體積的完全弗氏佐劑包裹免疫原經(jīng)腹腔免疫，二免用等體積的不完全弗氏佐劑包裹免疫原經(jīng)腹腔免疫，三免直接用純化抗原經(jīng)腹腔免疫小鼠，三免后第3 d時(shí)按參考文獻(xiàn)[11]方法制備單抗[11]。

1.7 間接ELISA方法的建立對(duì)免疫小鼠及非免疫小鼠進(jìn)行眼球采血，免疫小鼠血清作為陽(yáng)性血清，正常非免疫小鼠血清和SP2/0上清作為陰性血清，純化的免疫原蛋白作為包被抗原，HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG作為酶標(biāo)二抗，以免疫小鼠多抗血清經(jīng)矩陣ELISA的方法確定最佳抗原包被濃度，按照常規(guī)的方法進(jìn)行包備、封閉和洗滌后，4℃保存，待后續(xù)篩選單抗使用。

1.8 SDS-PAGE和Western blot鑒定正常293T細(xì)胞以及過(guò)表達(dá)pFlag-Nedd8和pFlag-Ub的293T細(xì)胞經(jīng)變性處理后，按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)印至NC膜，利用含5%脫脂乳T(mén)BST緩沖液4℃封閉過(guò)夜，加入待檢單克隆抗體，將各種抗體反應(yīng)的NC膜放置于37℃中作用4 h，TBST洗滌3次，HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG室溫作用2 h，ECL顯色試劑盒曝光顯色。

1.9 免疫共沉淀（Co-immuno-precipitation，Co-IP）293T細(xì)胞鋪10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后棄細(xì)胞上清，用常溫PBS洗2遍。向培養(yǎng)皿中加入1 mL弱性RIPA細(xì)胞裂解液置于冰上裂解30～45 min，中間每隔15 min輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿使裂解液均勻分布。將裂解液收集到離心管中于4℃、13 400×g離心10 min。將裂解液分裝到2個(gè)離心管中，每個(gè)離心管中分別加入30 μL的Protein A/G，同時(shí)分別加入2 μL Cullin-1抗體和鼠源IgG作為陰性對(duì)照。另外取40 μL的裂解產(chǎn)物加入10 μL的5×SDS Loading buffer，95℃加熱樣品10 min，該樣品作為IP實(shí)驗(yàn)的對(duì)照?？贵w、蛋白裂解液及protein A/G共孵育5 h后,用IP裂解液洗滌3～4次，用40 μL IP裂解液重懸Protein A/G Agarose并加入10 μL 5×SDS Loading buffer煮樣。4℃、10 800×g離心10 min，取上清，將Input、IgG對(duì)照、IP樣品進(jìn)行SDS-PAGE，然后進(jìn)行后續(xù)的Western blot分析。同樣的方法用制備的單克隆抗體進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。

1.10 NEDD8抗原表位鑒定根據(jù)NEDD8蛋白疏水區(qū)及親水區(qū)，將nedd8基因分成不同的截短體，通過(guò)同源重組的方法克隆至pET30a載體上。所用引物如下：N8-R：5'-CTCGAGCACCACCACCAC-3'；N829aa-F：5'-GTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAA CGCTCC TTGATTCG-3'；N838aa-F: 5'-GTGGTGG TGGTGCTCGAGTCATGGGGGGATTCCCTC-3'；N847aa-F: 5'-GTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGCC ACTGTAGATGAG-3'；N858aa-F: 5'-GTGGTGGT GGTGCTCGAGTCAATCAGCTGCTGTCTT-3'。重組載體分別命名為pET30-NEDD8 (1～29aa)、pET30-NEDD8 (1～38aa)、pET30-NEDD8 （1～47aa）、pET30-NEDD8（1～58aa）。將陽(yáng)性重組原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行原核表達(dá)，Western blot檢測(cè)NEDD8單克隆抗體針對(duì)的抗原表位。

2 結(jié)果

2.1 原核重組質(zhì)粒pET30-Nedd8鑒定參照人源nedd8核苷酸序列，設(shè)計(jì)并合成了擴(kuò)增nedd8基因全長(zhǎng)的特異性引物，從A549基因組中擴(kuò)增出nedd8片段，大小為243 bp，經(jīng)雙酶切后克隆入載體pET30a(+)中，經(jīng)過(guò)PCR鑒定和測(cè)序，nedd8基因已經(jīng)被正確插入到表達(dá)載體中，且方向正確閱讀框完整，無(wú)堿基突變，表明已成功構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-Nedd8。

2.2 重組蛋白的表達(dá)和純化結(jié)果將構(gòu)建好的pETNedd8轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)條件優(yōu)化，確定在37℃條件下，經(jīng)1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)8 h時(shí)，可溶性rNEDD8蛋白的產(chǎn)量最高。由圖1可見(jiàn)，rNEDD8蛋白在上清及包涵體中均有大量表達(dá)。大量誘導(dǎo)表達(dá)之后，送往上海吉爾生化公司純化，由圖2可見(jiàn)，純化結(jié)果良好，純化后的蛋白濃度為0.51 mg/mL。

2.3 間接ELISA方法建立每只小鼠免疫50 μg純化蛋白，共進(jìn)行3次免疫，在最后一次免疫后72 h之內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞融合[11]。根據(jù)ELISA矩陣法，確定蛋白的最佳包被濃度為32 ng（稀釋度為1∶1600），陽(yáng)性血清和陰性血清的最佳稀釋倍數(shù)為1∶2000。

2.4 單抗制備免疫后的小鼠取脾臟進(jìn)行細(xì)胞融合，利用間接ELISA以及Western blot方法進(jìn)行篩選，獲得3株能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1G3、1G11、4B7。這3株單克隆抗體的OD450值維持在3.5以上，而SP2/0上清對(duì)照和陰性血清對(duì)照OD450值維持在0.5以下，對(duì)上述單抗進(jìn)行亞克隆純化及擴(kuò)大培養(yǎng)，分別按照常規(guī)方法制備腹水。經(jīng)間接ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，3個(gè)單克隆抗體的亞克隆株全部具有較高的ELISA效價(jià)，且分泌的抗體都能識(shí)別重組蛋白rNEDD8蛋白。在后續(xù)的培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)1G11雜交瘤細(xì)胞株的ELISA效價(jià)比較穩(wěn)定，所以選擇1G11單抗作為最終的雜交瘤細(xì)胞株。mAb亞類(lèi)鑒定試劑盒鑒定表明，這株mAb重鏈屬于IgG1α，輕鏈屬于κ。

2.5 Western blot檢測(cè)由圖2顯示，分泌的3個(gè)單克隆抗體均能識(shí)別重組蛋白rNEDD8。由于NEDD8蛋白與泛素蛋白Ub具有高度同源性，為了確定NEDD8單克隆抗體的特異性，本研究利用pFlag-Nedd8、pFlag-Ub質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，用單克隆抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：?jiǎn)慰?G11能夠特異性識(shí)別pFlag-Nedd8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解產(chǎn)物，形成多條NEDD8修飾的蛋白梯度，而與pFlag-Ub質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解產(chǎn)物不反應(yīng)（圖2）。

2.6 Co-IP檢測(cè)結(jié)果為檢測(cè)單克隆抗體是否適用于Co-IP實(shí)驗(yàn)，本研究檢測(cè)Cullin-1的NEDDylation修飾。由圖3所示，無(wú)論用Cullin-1抗體還是用1G11單抗，均可以識(shí)別被NEDD8修飾的Cullin-1蛋白，表明單抗能夠識(shí)別Cullin-1的NEDD8修飾。這說(shuō)明制備的單克隆抗體具有良好的免疫反應(yīng)性和特異性，且可用于Co-IP共沉淀實(shí)驗(yàn)。

2.7 NEDD8抗原表位鑒定根據(jù)Protean軟件分析NEDD8蛋白的疏水區(qū)及親水區(qū)，構(gòu)建不同的原核表達(dá)載體，分段表達(dá)NEDD8蛋白，長(zhǎng)度分別為29 aa、38 aa、47 aa、58 aa以及全長(zhǎng)。原核表達(dá)之后，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳，由從圖4A可見(jiàn)，各截短體蛋白都能夠獲得成功表達(dá)。將這些表達(dá)產(chǎn)物作為抗原，用1G11單抗為一抗，進(jìn)行Western blot分析。由圖4B可見(jiàn)，29 aa長(zhǎng)度的多肽不能夠被識(shí)別，而38 aa及以上長(zhǎng)度的多肽的則反應(yīng)性良好。結(jié)合圖4C序列比對(duì)結(jié)果，可以推斷，單克隆抗體1G11的識(shí)別表位可能在29～32 aa，該段表位的aa序列為29RVEE32，其識(shí)別區(qū)的結(jié)構(gòu)模擬圖藍(lán)色球狀區(qū)域（圖4D）。

圖1 重組蛋白rNEDD8的SDS-PAGE分析Fig.1 Analysis of the recombinant protein by SDS-PAGE

圖2 單克隆抗體免疫反應(yīng)和特異性分析Fig.2 Immunoreaction of specificity analysis of mAb 1G11

圖3 NEDDylated修飾Cul1修飾檢測(cè)Fig.3 Detection of NEDDylated Cullin-1 by co-IP assay

圖4 表位鑒定Fig.4 Characterization of the epitope of mAb 1G11

3 討論

NEDDylation是一種類(lèi)泛素化的蛋白質(zhì)翻譯后修飾途徑。在此過(guò)程中，類(lèi)泛素化小分子NEDD8通過(guò)NAE1激活酶、E2結(jié)合酶與E3連接酶的催化作用，共價(jià)結(jié)合到蛋白底物上，對(duì)其進(jìn)行修飾。NEDDylation目前被認(rèn)為廣泛地參與調(diào)控蛋白的活性、穩(wěn)定性、細(xì)胞定位以及蛋白間互作，與癌癥、發(fā)育疾病和病毒感染之間都存在著緊密的聯(lián)系。人免疫缺陷癥病毒多個(gè)病毒蛋白通過(guò)不同方式劫持Cullin相關(guān)的E3連接酶（CRLs）復(fù)合物，從而利用了NEDDylation修飾功能，實(shí)現(xiàn)逃避免疫和促進(jìn)病毒復(fù)制[9-10]。在感染單純皰疹病毒的細(xì)胞中，NEDDylation可以通過(guò)加強(qiáng)CRL對(duì)IκB的泛素化，促進(jìn)其在蛋白酶體的降解，進(jìn)而釋放具有活性的NF-κB入核，啟動(dòng)干擾素基因的轉(zhuǎn)錄[11]。而在卡波氏肉瘤病毒感染的細(xì)胞中，NEDDylation也可以通過(guò)啟動(dòng)NF-κB途徑來(lái)調(diào)控病毒的潛伏期相關(guān)基因表達(dá)[12]。

NEDDylation還能夠修飾病毒蛋白，在多種病毒的生命周期中發(fā)揮重要作用，如流感病毒的PB2蛋白被NEDD8蛋白修飾后其穩(wěn)定性降低，從而抑制流感病毒的復(fù)制[13]；HDM2能夠增強(qiáng)乙型肝炎病毒HBx的NEDDylation修飾，從而抑制其泛素化降解，增強(qiáng)HBx蛋白的穩(wěn)定性及功能[14]。因此，NEDDylation類(lèi)泛素化修飾途徑在天然免疫過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

市場(chǎng)上雖然已有商品化NEDD8抗體，但是在實(shí)際的實(shí)驗(yàn)中操作中，并不能滿足Co-IP實(shí)驗(yàn)需求。本研究制備獲得的單抗能夠特異性地識(shí)別NEDD8蛋白，能用于Co-IP實(shí)驗(yàn)。這為今后更深入地研究?jī)?nèi)源性NEDDylation修飾作用打下了良好的基礎(chǔ)，為更好地闡述在病毒感染中NEDDylation的免疫調(diào)控作用提供了實(shí)用的生物工具。