雷元元，郭亞男，郭 磊，郭鵬輝，何生虎

（1.延安市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，延安 716000；2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；3.寧夏曉鳴農(nóng)牧股份有限公司，銀川750021）

雞滑液囊支原體病是由雞滑液囊支原體（Mycoplasma synoviae，MS）感染所引起的一種以跗關(guān)節(jié)滲出性的滑液囊膜炎及腱鞘滑膜炎為特征的急性或慢性傳染病[1]。該病季節(jié)性不明顯，但以冬春季多發(fā)，病雞和帶毒雞為主要的傳染源，雞感染后不但可通過呼吸道進(jìn)行同群間水平傳播，也可通過卵進(jìn)行垂直傳播，能夠降低蛋雞產(chǎn)蛋率、蛋品質(zhì)和孵化率，降低飼料轉(zhuǎn)化率，使屠體廢棄率升高[2]。有報(bào)到顯示，美國(guó)商品蛋雞普遍感染[3]，西歐弗蘭德斯地區(qū)感染率達(dá)76.3%[4]，但沒有種雞感染的相關(guān)報(bào)道。2008年國(guó)內(nèi)雞滑液囊支原體的感染率達(dá)到20.7%[5]，近兩年在廣東省、廣西壯族自治區(qū)、湖北省、山東省、遼寧省、河北省、山東省、河南省、山西省等地各品種的雞均有感染滑液囊支原體，且感染率在逐漸增加[6-7]，江蘇省[8]部分地區(qū)雞群血清陽性率最高達(dá)到82.4%，最低為38.9%，平均陽性率為57.7%，可見MS感染給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)嚴(yán)重影響了養(yǎng)禽業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，必須引起人們的高度重視。

1 材料與方法

1.1 病料無菌采集發(fā)病雞的跗關(guān)節(jié)液、血液、血清、脾臟、卵巢等有病理變化的組織樣品，種蛋，1日齡小雞的卵黃、肺臟、喉頭氣管。

1.2 雞場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查通過詢問的方式對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)商品雞來源、飼養(yǎng)規(guī)模、飼養(yǎng)方式、發(fā)病情況、發(fā)病率及死亡率等內(nèi)容進(jìn)行初步掌握。

1.3 臨床癥狀及其剖解病理變化觀察場(chǎng)區(qū)雞群整體情況，精神狀態(tài)、臨床癥狀，對(duì)病危雞進(jìn)行剖解，觀察剖解病變。

1.4 抗體檢測(cè)按試劑盒說明書中方法將雞群中采集的100份（病雞50份，同群雞50份）血清進(jìn)行抗體滴度檢測(cè)。

1.5 病原分離及純化將無菌采集的跗關(guān)節(jié)內(nèi)容物、肺臟等病變組織同時(shí)接種改良的Frey氏固體、液體培養(yǎng)基[9]，在37℃、8%CO2條件下培養(yǎng)3～5 d，觀察是否有“煎蛋樣”菌落生長(zhǎng)，在固體培養(yǎng)基上取單個(gè)菌落進(jìn)行傳遞培養(yǎng)，對(duì)菌落進(jìn)行純化。

1.6 PCR病原學(xué)檢測(cè)取純化后的液體培養(yǎng)物按質(zhì)粒提取試劑盒說明書中方法提取核酸，參照參考文獻(xiàn)[1]，根據(jù)GenBank中收錄的雞滑液囊支原體WVU 1853（ATCC 25204）株（GenBank登陸號(hào)：N-R044811）16S rRNA基因序列合成引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增病原體的16 s rRNA，以實(shí)驗(yàn)室收藏菌株為陽性對(duì)照。

1.7 病理模型的建立本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)文獻(xiàn)[10]將本次分離純化后的菌株分別通過呼吸道、消化道、皮下等不同感染途徑對(duì)6周齡幼雞進(jìn)行感染，對(duì)感染幼雞各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，觀察感染后的病理變化。

1.8 垂直傳播的驗(yàn)證該廠區(qū)耐過雞群開產(chǎn)后隨機(jī)選50只雞在137日齡進(jìn)行人工授精，授精后3 d內(nèi)收集100枚種蛋進(jìn)行孵化，孵化到21日齡出殼時(shí)處死小雞（未出殼的弱雛、畸形等作同樣的處理）取卵黃、肺臟、喉頭器官進(jìn)行PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 雞場(chǎng)發(fā)病情況調(diào)查結(jié)果2016年10月初甘肅省張掖市某商品雞場(chǎng)飼養(yǎng)褐色海蘭雞13 000羽，雛雞未進(jìn)行支原體免疫，20日齡左右雛雞群出現(xiàn)采食量降低，陸續(xù)出現(xiàn)雞只羽毛蓬松、精神萎靡、喜臥、跛行，通過飲水用VC、氟苯尼考進(jìn)行治療，未見明顯效果，用泰萬菌素和泰妙菌素治療后起到一定作用。而63日齡雞群發(fā)病6200羽，死亡2300羽，淘汰6200羽，發(fā)病率48%，病死率37%，死淘率48%?，F(xiàn)場(chǎng)調(diào)查結(jié)果顯示：該雞場(chǎng)主要以籠養(yǎng)為主（圖1），飼養(yǎng)密度偏大，遠(yuǎn)離交通主干道，但場(chǎng)內(nèi)環(huán)境差，場(chǎng)區(qū)沒有任何生物安全措施，該雞舍取暖方式為火爐，整個(gè)雞舍受熱不均勻，人員進(jìn)出雞舍沒有任何消毒措施，死淘雞全部堆在雞舍門口，未及時(shí)進(jìn)行無害化處理，雞舍糞污處理不及時(shí)，導(dǎo)致舍內(nèi)環(huán)境惡劣，氨氣含量超標(biāo)。

有研究表明：28～120日齡雞群較其他日齡雞群最為易感MS[11]；不同雞群對(duì)MS抵抗力也有差別，引進(jìn)品種或品系的雞發(fā)病率要高于本土品種，商品代蛋雞群MS感染陽性率高于父母代，父母代比祖代要高[12]。雞群感染MS后多以隱性經(jīng)過，并不表現(xiàn)出臨床癥狀，當(dāng)飼養(yǎng)管理不當(dāng)引起雞群免疫力下降、雞群受應(yīng)激條件的影響、MS與其他疫病混合感染時(shí)均可促進(jìn)MS的爆發(fā)[13]。該商品雞場(chǎng)不注意生物安全，環(huán)境條件差，病死雞沒有及時(shí)無害化處理，雞舍取暖不均勻，較強(qiáng)的應(yīng)激是引起本疫情的主要原因。

圖1 雞場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)Fig.1 The scene picture of chicken farm

2.2 病雞臨床癥狀及部分剖解病變病雞在臨床上表現(xiàn)為精神萎靡（圖2A）、羽毛蓬松、采食量下降、站立不穩(wěn)、喜臥、跛行，全身檢查可見雙側(cè)關(guān)鍵明顯腫大（圖2B），剖解關(guān)節(jié)流出黃色的膿性液體（圖2C），對(duì)發(fā)病雞進(jìn)行剖解，可見肝臟顏色變深（圖2D），脆性增大，肌腺胃部糜爛、出血（圖2E），脾臟腫大（圖2F），內(nèi)部嚴(yán)重出血（圖2G），卵巢輕度出血、喉頭氣管輕度出血（圖2H）等典型的臨床癥狀，這與參考文獻(xiàn)[5]中禽滑液囊支原體臨床結(jié)果類似，初步診斷為禽滑液囊支原體。

2.3 抗體檢測(cè)結(jié)果按試劑盒說明書中方法將雞群中采集的100份血清（病雞50份，同群雞50份）進(jìn)行抗體滴度檢測(cè)（表1）。經(jīng)檢測(cè)100份全部陽性，陽性率100%，由于雞群沒有支原體免疫史，說明雞群中有支原體的入侵。

2.4 病原體分離結(jié)果將無菌采集的跗關(guān)節(jié)液、脾臟、卵巢等器官分別接種改良的 Frey 氏固體、液體培養(yǎng)基，在37℃、8% CO2條件下培養(yǎng)，5 d后在4×10倍的顯微鏡下可見，接種過跗關(guān)節(jié)液和卵巢的固體培養(yǎng)基長(zhǎng)出菌落，但“煎蛋樣”不太明顯（圖3a），液體培養(yǎng)基顏色由紅變黃，對(duì)固體液體培養(yǎng)物進(jìn)行傳代純化，固體培養(yǎng)物5代后在4×10倍的顯微鏡下出現(xiàn)了典型的“煎蛋樣”菌落（圖3b），液體培養(yǎng)物在3代后培養(yǎng)周期縮短到3 d，培養(yǎng)3 d培養(yǎng)物變?yōu)槌吻逋该鞯狞S色液體（圖4）。

圖2 臨床病理變化Fig. 2 Clinical pathological lesions

表1 抗體檢測(cè)結(jié)果Table 1 The results of antibody test

圖3 純化前后“煎蛋樣”菌落（40×）Fig. 3 Fried eggs colonies before and after purification

圖4 純化前后 Frey 氏液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)情況Fig. 4 Growth of Frey's liquid medium before and after purification

2.5 病原體PCR檢測(cè)結(jié)果經(jīng)PCR擴(kuò)增，陽性對(duì)照與純化產(chǎn)物均得到1077 bp大小的片段（圖5）。由于支原體對(duì)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)要求高，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，培養(yǎng)過程中容易被其他病原微生物污染，臨床采集的病料受多種病原微生物污染，分離純化較困難，這就給MS的研究帶來一定困難，本研究借助寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院臨床獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室多年來對(duì)支原體研究基礎(chǔ)，成功從臨床上分離到滑液囊支原體病原，縮短培養(yǎng)周期，純化后得到典型的“煎蛋樣”菌落，經(jīng)PCR進(jìn)一步驗(yàn)證該培養(yǎng)物為滑液囊支原體，該結(jié)果為禽滑液囊支原體的臨床診斷、防控、科學(xué)研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

2.6 病理模型的建立對(duì)感染后幼雞進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、剖解并分離病原體。結(jié)果顯示，雞滑液囊支原體在雞體感染的病理模型復(fù)制成功，該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)上述病例為滑液囊支原體感染。

2.7 雛雞病料PCR檢測(cè)結(jié)果共檢測(cè)雛雞的喉頭、肺臟混合物98份，采取方法首輪PCR將9份病料模板合為一起作為模板（圖6），若擴(kuò)增陽性，再將9份病料模板一一擴(kuò)增檢測(cè)。最終確定98份樣品中強(qiáng)陽性2份，弱陽性7份，陽性率為9.2%；卵黃共檢測(cè)98份，陽性0份，陽性率0。從商品蛋孵化出的1日齡雛雞的肺臟和喉頭器官中能檢測(cè)到MS，證實(shí)了MS的垂直傳播特性。MS一旦感染，終身帶毒。

圖5 培養(yǎng)物PCR檢測(cè)結(jié)果Fig. 5 PCR results of the culture

圖6 雛雞喉頭、肺臟PCR檢測(cè)結(jié)果Fig. 6 PCR Results test of chick throat and lung

商品雞場(chǎng)為了有效防控MS的發(fā)生，確保種源的安全，從支原體凈化示范場(chǎng)引種，從源頭上控制MS的發(fā)生；其次，在本場(chǎng)建立完善的生物安全體系[14]，防治其他病原菌的感染而引起MS的發(fā)生，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，提高機(jī)體免疫力，抓雞、轉(zhuǎn)群盡量降低對(duì)雞群的應(yīng)激；最后，對(duì)引進(jìn)雛雞檢測(cè)MS母源抗體，對(duì)母源抗體不高的雞群及時(shí)免疫，增加抗體，同時(shí)不定期飼喂Vc提高免疫力，當(dāng)發(fā)病時(shí)及時(shí)飼喂泰勒菌素、泰萬菌素[15]以緩解疫情。