劉茂林，Rippley Berry，Lee Soyoeng

(1. 杭州師范大學 醫(yī)學院，浙江 杭州 311121；2. 日本國立大阪大學 免疫學前沿研究中心，日本 大阪 565-0871)

沙利度胺(thalidomide, Thal)作為一種治療免疫介導性疾病的免疫調(diào)節(jié)劑，被用于強直性脊柱炎(AS)、類風濕關(guān)節(jié)炎(RA)、白塞氏病(BD)等自身免疫性疾病(autoimmune disease, AID)的治療[1-3]。研究表明[4]，Thal能減少TNF-α及相關(guān)基因的表達，減少TNF-α誘導的NF-κβ活化，繼而減弱免疫反應。樹突狀細胞(dendritic cells, DCs)在激發(fā)和控制獲得性免疫反應中起關(guān)鍵作用，是啟動、調(diào)控和維持免疫應答的中心環(huán)節(jié)，溝通固有免疫應答和適應性免疫應答的重要橋梁細胞。許多證據(jù)表明[5]，DCs不僅是機體免疫應答的始動者，而且在誘導免疫耐受等方面發(fā)揮重要作用。DCs通過分泌細胞因子和趨化因子調(diào)節(jié)炎癥反應，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、RA、BD、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、銀屑病、哮喘等多種AID的發(fā)生發(fā)展過程中起重要調(diào)控作用[6-7]。有研究表明[5,8]，DCs已成為免疫治療的靶點細胞。本研究通過觀察Thal對Toll樣受體7/9(toll-like receptor 7/9, TLR7/9)介導的脾臟DCs分泌的AID相關(guān)細胞因子變化，探討Thal對DCs免疫調(diào)節(jié)作用的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 選用C57BL/6J小鼠12只，雄性，8周齡，體重20±2 g，購自日本CLEA股份有限公司。動物實驗經(jīng)日本國立大阪大學生物科學院動物保護和使用倫理委員會批準。

1.2 主要試劑和儀器 RPMI 1640 培養(yǎng)基購自Sigma公司。小鼠DCs分離盒、CD11c Micro Beads、免疫磁珠分選儀、分選柱購自德國Miltenyi Biotec公司。RNA RNeasy 購自Qiagen公司。小鼠白介素-6 (IL-6)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、干擾素-α (IFN-α)引物購自Applied Biosystems公司。TLR9激動劑CpG-A、CpG-B購自Gene Design公司，TLR7激動劑咪喹莫特(Imiquimod)購自3M Health Care公司，Thalidomide購自Sigma公司。小鼠IL-6、TNF-α、IFN-α ELISA檢測試劑盒購自Biolegend公司。ABI PRISM 7900 HT熒光定量PCR儀購自Applied Biosystems公司。

1.3 小鼠脾臟單個核細胞的制備 小鼠斷頸處死，無菌取脾臟，PBS沖洗2次后，去除脾臟表面被膜。于220目金屬濾網(wǎng)上，無菌注射器活塞反復研磨脾臟釋放細胞，采用70 μm細胞過濾器過濾細胞液，收集細胞并加入PBS稀釋至14 mL。

1.4 小鼠脾臟CD11c+樹突狀細胞的提取 采用免疫磁珠細胞分選(MACS)法收集小鼠脾臟CD11c+樹突狀細胞，按照試劑盒說明書步驟進行。細胞懸液(1×108個細胞)中加入0.25 μg小鼠Fc受體阻滯劑(CD16/CD32)單克隆抗體、100 μL CD11c微珠。通過MACS分選柱收集磁性標記細胞，所得脾臟CD11c+樹突細胞用10 mL RPMI 1640培養(yǎng)基(5×105細胞/mL)重懸后備用。

1.5 脾臟CD11c+樹突細胞實驗分組 每孔100 μL 2.5×105個小鼠脾臟CD11c+樹突細胞于5%CO2細胞培養(yǎng)箱，37℃孵育2 h，設置①不加細胞的質(zhì)控孔(100 μL PBS，50 mg/mL Thal 1.5 μL)用于控制批間、批內(nèi)標本檢測結(jié)果的一致性，②Control組(100 μL 2.5×105個CD11c+樹突細胞，PBS 200 μL), ③CpG-A組(100 μL 2.5×105個CD11c+樹突細胞，1 μmol/L CpG-A 100 μL)，④CpG-B組(100 μL 2.5×105個CD11c+樹突細胞，1 μmol/L CpG-B 100 μL)，⑤Imiquimod組(100 μL 2.5×105個CD11c+樹突細胞，500 μg/mL Imiquimod 20 μL)，⑥CpG-A+Thal組(100 μL 2.5×105個CD11c+樹突細胞，1 μmol/L CpG-A 100 μL，50 mg/mL Thal 1.5 μL)，⑦CpG-B+Thal組(100 μL 2.5×105個CD11c+樹突細胞，1 μmol/L CpG-B 100 μL，50 mg/mL Thal 1.5 μL)，⑧ Imiquimod+Thal組(100 μL 2.5×105個CD11c+樹突細胞，500 μg/mL Imiquimod 20 μL，50 mg/mL Thal 1.5 μL)，各組用PBS調(diào)整至300 μL，共同培養(yǎng)24 h。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測細胞因子水平 采用ELISA試劑盒分別檢測各組細胞上清液中IL-6、TNF-α、IFN-α水平，各組均設3個復孔，實驗重復3次。

1.7 實時定量PCR檢測 采用RNeasy試劑盒提取小鼠脾臟CD11c+樹突狀細胞的總RNA并進行反轉(zhuǎn)錄，所有操作按照試劑盒說明書進行。使用小鼠IL-6引物：5′-TGTGCAATGGCAATTCTGAT-3′，5′-GGTACTCCAGAAGACCAGAGGA-3′；TNF-α引物：5′-TGCCTATGTCTCAGCCTCTTC-3′，5′-GGTCTGGG CCATAGAACTGA-3′；IFN-α引物：5′-TGGTGCATGAGATGCTCCA-3′，5′-GCCGAGCCCTCTGTGCT-3′。以GAPDH為內(nèi)參對照，定量PCR過程：50 ℃2 min，95 ℃10 min，95 ℃循環(huán)40次15 s，60 ℃1 min。IL-6、TNF-α、IFN-αmRNA相對表達量采用ΔΔCt法，實驗重復3次。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件，計量資料比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Thal對小鼠脾臟樹突細胞表達IL-6的影響 單用TLR9激動劑CpG-A、CpG-B的CpG-A組、CpG-B組，單用TLR7激動劑的Imiquimod組的小鼠脾臟樹突細胞IL-6 mRNA和IL-6表達量均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CpG-A+Thal組、CpG-B+Thal組、Imiquimod+Thal組小鼠脾臟樹突細胞IL-6 mRNA和IL-6表達量均分別低于CpG-A組、CpG-B組、Imiquimod組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；見圖1、圖2。

2.2 Thal對小鼠脾臟樹突細胞表達TNF-α的影響 單用激動劑的CpG-A組、CpG-B組和 Imiquimod組的小鼠脾臟樹突細胞TNF-α mRNA和TNF-α表達量均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CpG-A+Thal組、CpG-B+Thal組、Imiquimod+Thal組小鼠脾臟樹突細胞TNF-α mRNA和TNF-α表達量均分別低于CpG-A組、CpG-B組、Imiquimod組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；見圖3、圖4。

與Control組比較，**P<0.01,***P<0.001; 與各單用激動劑組比較，### P<0.001。圖1 沙利度胺對小鼠脾臟樹突細胞IL-6 mRNA表達的影響

與Control組比較，*P<0.05,***P<0.001; 與各單用激動劑組比較，## P<0.01, ### P<0.001。圖2 沙利度胺對小鼠脾臟樹突細胞IL-6表達的影響

與Control比較，**P<0.01,***P<0.001; 與各單用激動劑組比較，## P<0.01, ### P<0.001。圖3 沙利度胺對小鼠脾臟樹突細胞TNF-α mRNA表達的影響

與Control組比較，**P<0.01,***P<0.001;與各單用激動劑組比較，## P<0.01, ### P<0.001。圖4 沙利度胺對小鼠脾臟樹突細胞TNF-α表達的影響

與Control組比較，***P<0.001; 與單用激動劑組比較，## P<0.01。圖5 沙利度胺對小鼠脾臟樹突細胞IFN-α mRNA表達的影響

與Control組比較，***P<0.001; 與單用激動劑組比較，##P<0.01。圖6 沙利度胺對小鼠脾臟樹突細胞IFN-α表達的影響

2.3 Thal對小鼠脾臟樹突細胞表達IFN-α的影響 單用激動劑的CpG-A組的小鼠脾臟樹突細胞IFN-α mRNA和IFN-α表達量均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CpG-A+Thal組小鼠脾臟樹突細胞IFN-α mRNA和IFN-α表達量均高于CpG-A組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；見圖5、圖6。

3 討論

樹突狀細胞在免疫識別、免疫應答和免疫調(diào)控中發(fā)揮作用，決定著免疫應答的結(jié)果及強度，并在疾病的免疫治療中有著深遠的應用前景[5-6]。在樹突狀細胞各亞型中，CD11c+樹突狀細胞有刺激T細胞增殖以及分泌更多的IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-α等炎性因子的作用，與AID發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9]。樹突狀細胞表面的I型跨膜蛋白—Toll樣受體(TLRs)是連接天然免疫和獲得性免疫的關(guān)鍵分子，為細胞表面重要的模式識別受體。在機體獲得性免疫中，TLRs家族成員中的TLR7、TLR8和TLR9高度同源，在細胞內(nèi)涵體中起作用，結(jié)合其配體可識別微生物的核酸。TLR7可識別咪喹啉家族低分子量的Imiquimod等，TLR9可識別細菌的CpG-DNA，激活包括機體最強的抗原呈遞細胞(antigen presenting cells, APC) 樹突狀細胞的免疫刺激特性，在樹突狀細胞成熟過程中起重要的調(diào)控作用[10]。

TLRs的激活及其介導的信號轉(zhuǎn)導機制一直是研究的重點。在特定條件下, TLRs可在細胞表面異常高表達和過度激活, 除外源性配體外，還可識別一些內(nèi)源性分子，甚至識別自身組織成分,引發(fā)機體功能紊亂，導致自身免疫性疾病。研究表明[11-14]，TLRs參與許多慢性炎癥和AID的發(fā)生發(fā)展。因此，TLRs 的激活必須受到嚴格的負調(diào)控，以保持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定。隨著對TLRs信號通路認識的逐步深入，基于TLRs及其信號通路為靶點的干預治療成為研究的熱點，為AID的治療提供理論基礎及新的藥物靶點[14-15]。

細胞因子參與免疫細胞功能紊亂和自身免疫性疾病的病理進程。研究表明[16-19]，包括IL-6、TNF-α、IFN-α在內(nèi)的細胞因子，通過TLR7/TLR9信號通路激活的樹突狀細胞分泌，并參與類風濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展[20-21]。IL-6、TNF-α在類風濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用，導致滑膜發(fā)炎、血管生成增加和淋巴管減少；IFN-α能通過調(diào)控多種免疫細胞的分化影響免疫系統(tǒng)的功能進而促進系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)生發(fā)展，通過干預IFN-α的活性有益于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的控制，可能是治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的新靶標。目前，細胞因子參與自身免疫性疾病是一個快速發(fā)展的生物學和臨床研究領域，以細胞因子、受體和信號分子為治療靶點的靶向制劑研究取得了較大進展。

沙利度胺及其衍生物是以鎮(zhèn)靜、胎兒致畸、抗血管生成和抗炎為特性的免疫調(diào)節(jié)藥物(IMiD)，通常用于治療多發(fā)性骨髓瘤和骨髓增生異常綜合征(MDS)等。IMiD也被用于治療與漢森氏病/麻風病相關(guān)的炎癥性皮膚病變。IMiD還在治療自身免疫性疾病方面顯示出應用前景，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡和炎性腸病[22]。本研究依據(jù)樹突狀細胞的TLRs激活機制體外選擇Thal，分別與自身免疫性疾病細胞因子生成相關(guān)的TLR7/TLR9激動劑Imiquimod、CpG-A、CpG-B配對刺激小鼠脾臟樹突狀細胞，結(jié)果顯示：與單用激動劑組比較，Thal配對組小鼠脾臟樹突狀細胞的IL-6和TNF-α的表達量均受到明顯抑制，提示Thal對樹突狀細胞分泌的自身免疫性疾病相關(guān)炎性細胞因子具有較強的抑制作用。與細胞因子IL-6和TNF-α不同，僅CpG-A組小鼠脾臟樹突狀細胞的IFN-α表達增加，且Thal對IFN-α的分泌有協(xié)同增強作用。Ma等[23]在對免疫性血小板減少癥(ITP)的研究中發(fā)現(xiàn)，Thal能恢復ITP患者骨髓間充質(zhì)干細胞對樹突狀細胞的調(diào)控效應。Millrine等[24]的研究表明，Thal衍生物雷利度胺通過靶分子Rabex-5負調(diào)控TLRs介導的細胞因子Ⅰ型干擾素(IFN-Ⅰ)產(chǎn)生。以上研究結(jié)果提示Thal作為IMiD的作用有可能是通過對樹突狀細胞TLRs介導的細胞因子分泌的影響得以實現(xiàn)，Thal對自身免疫性疾病以及其他血液腫瘤疾病治療的機制可能涉及樹突狀細胞TLRs介導的細胞因子的作用。后期的研究將以此為基礎進一步展開，探討Thal對樹突狀細胞TLRs信號通路靶點的干預作用，為自身免疫性疾病治療提供理論依據(jù)。

綜上所述，本研究初步探討了免疫調(diào)節(jié)劑Thal對小鼠脾臟樹突狀細胞免疫功能的影響，Thal對自身免疫性疾病等疾病的治療可能通過影響TLR7/9介導的樹突狀細胞分泌IL-6、TNF-α、IFN-α 的改變而產(chǎn)生作用。