何愛(ài)娟 張?zhí)煊?/p>

(復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼耳鼻整形外科 上海 200031)

種子細(xì)胞是軟骨組織工程技術(shù)的關(guān)鍵要素，也是該技術(shù)實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化的重要基礎(chǔ)。早期的種子細(xì)胞來(lái)源主要有軟骨細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)等；近年來(lái)隨著細(xì)胞生物學(xué)的快速發(fā)展及研究者對(duì)各種細(xì)胞的深入理解，越來(lái)越多具有軟骨再生潛能的細(xì)胞被嘗試應(yīng)用于軟骨修復(fù)重建領(lǐng)域。然而這些不同來(lái)源的種子細(xì)胞有哪些生物學(xué)特性？其在軟骨再生領(lǐng)域中又獲得了哪些重要研究進(jìn)展？更重要的是，這些細(xì)胞在臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化中將會(huì)面臨哪些挑戰(zhàn)？哪些研究方向仍需進(jìn)一步的探索？本文將針對(duì)這些問(wèn)題展開(kāi)綜述，以期為軟骨組織工程技術(shù)臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化提供參考。

1 軟骨細(xì)胞

軟骨細(xì)胞是分化成熟的成體細(xì)胞，是軟骨組織工程最早、最廣泛應(yīng)用的種子細(xì)胞。軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)技術(shù)體系最早建立于20世紀(jì)70年代[1]，此后有關(guān)軟骨細(xì)胞的生物學(xué)行為特性及其在軟骨再生中的應(yīng)用陸續(xù)被報(bào)道。1982年，有學(xué)者[1]發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞在體外擴(kuò)增培養(yǎng)過(guò)程中極易出現(xiàn)去分化、軟骨形成能力迅速喪失等現(xiàn)象，這無(wú)疑給軟骨細(xì)胞的進(jìn)一步應(yīng)用帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)；但隨后Aulthouse[2]和Mand等[3]發(fā)現(xiàn)利用三維培養(yǎng)、添加細(xì)胞因子等方法可使去分化的軟骨細(xì)胞發(fā)生重分化、功能逆轉(zhuǎn)，這些研究成果為解決軟骨去分化問(wèn)題提供了重要參考依據(jù)，從而推動(dòng)了軟骨細(xì)胞在軟骨再生領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展。近20年來(lái)，軟骨組織工程修復(fù)技術(shù)已在動(dòng)物體內(nèi)取得較大成功[4-5]，且臨床應(yīng)用嘗試也獲得了較大進(jìn)展[6-7]。

軟骨細(xì)胞最早應(yīng)用于關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)治療。Brittberg等[8]最早報(bào)道利用可注射的自體軟骨細(xì)胞復(fù)合軟骨膜覆蓋能成功修復(fù)骨關(guān)節(jié)炎患者的軟骨缺損。經(jīng)過(guò)2年隨訪確認(rèn)有效后，美國(guó)FDA在1997年批準(zhǔn)了這項(xiàng)技術(shù)的臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化[1]。此外，Liu等[9]為減少獲取骨膜后的繼發(fā)組織缺損，嘗試用軟骨細(xì)胞復(fù)合聚羥基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)支架材料修復(fù)豬關(guān)節(jié)軟骨缺損，并獲得了成功。盡管這些研究在關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)重建領(lǐng)域中獲得了較大進(jìn)展，但仍未獲得大規(guī)模的臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化。主要原因在于軟骨細(xì)胞的去分化、病理性肥大、骨膜增生、手術(shù)創(chuàng)傷大等因素影響了最終的軟骨修復(fù)效果[1]。在耳再造領(lǐng)域，有學(xué)者[6-7]應(yīng)用自體殘耳軟骨細(xì)胞在體外或體內(nèi)構(gòu)建了組織工程耳郭形態(tài)軟骨，并成功重建了小耳畸形患者的耳郭。這是組織工程軟骨在耳再造領(lǐng)域里程碑式的成果，但其體內(nèi)的長(zhǎng)期轉(zhuǎn)歸、形態(tài)維持情況、遠(yuǎn)期生物安全性仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。在鼻再造領(lǐng)域，F(xiàn)ulco等[10]應(yīng)用自體耳軟骨復(fù)合膠原支架材料體外構(gòu)建的組織工程軟骨成功修復(fù)了患者的鼻翼軟骨缺損，重建了鼻部外形。在Fulco等[10]的研究結(jié)果中,盡管軟骨體內(nèi)再生并不理想，但再生組織能在體內(nèi)長(zhǎng)期存留并維持鼻部外形(能滿足臨床鼻重建的基本要求)，這為組織工程軟骨的臨床應(yīng)用提供了重要參考依據(jù)。而在氣管修復(fù)重建術(shù)中， Yang等[11]應(yīng)用自體軟骨細(xì)胞復(fù)合DegraPol 支架體外再生了成熟的長(zhǎng)段氣管形態(tài)軟骨。Luo等[12]則應(yīng)用兔耳軟骨細(xì)胞復(fù)合PGA/PLA支架成功修復(fù)了兔的節(jié)段性氣管缺損，且術(shù)后動(dòng)物均能長(zhǎng)期存活。這些結(jié)果說(shuō)明組織工程軟骨是氣管修復(fù)重建的重要方向。盡管如此，節(jié)段性氣管缺損在臨床試用中尚未獲得重大突破，這可能與氣管上皮化、血管化等尚未有效解決有關(guān)[12]。除此之外，基于軟骨細(xì)胞的組織工程軟骨在眼再造、面部整形等領(lǐng)域均有試用研究[13-14]，這些結(jié)果為組織工程軟骨的臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化奠定了重要理論基礎(chǔ)。

2 BMSCs

近年來(lái)，具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞逐漸成為組織工程種子細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。BMSCs具有良好的軟骨分化潛能[15-16]、可自體取材、體外增殖能力強(qiáng)，獲取創(chuàng)傷小(可經(jīng)骨髓穿刺獲得)、無(wú)供區(qū)繼發(fā)組織缺損、可重復(fù)取材等，這些優(yōu)勢(shì)使得BMSCs成為目前最有應(yīng)用前景的軟骨構(gòu)建種子細(xì)胞[4-5, 17]。值得一提的是，BMSCs在皮下微環(huán)境中容易發(fā)生血管化、骨化，最終導(dǎo)致軟骨再生失敗[18-19]。為了解決BMSCs骨化問(wèn)題，前期研究嘗試將軟骨細(xì)胞與其共培養(yǎng)，利用軟骨細(xì)胞分泌抗血管化細(xì)胞因子的作用，抑制BMSCs血管化從而穩(wěn)定體內(nèi)軟骨再生。由此可見(jiàn)，抗血管化是解決BMSCs皮下環(huán)境軟骨再生穩(wěn)定性的關(guān)鍵。應(yīng)用載有抗血管化細(xì)胞因子的支架材料可能是解決BMSCs血管化的重要方向。然而，與皮下環(huán)境不同的是，關(guān)節(jié)微環(huán)境卻十分適合BMSCs的軟骨再生。Goldberg等[17]綜述了1900～2015年有關(guān)關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的2 880篇文獻(xiàn)，其中共有73篇文獻(xiàn)應(yīng)用了BMSCs進(jìn)行人或動(dòng)物的關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)，且大部分研究均獲得了較滿意的軟骨修復(fù)效果。He等[5]更是發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用BMSCs體外構(gòu)建的組織工程軟骨不僅能修復(fù)軟骨缺損，同時(shí)還能修復(fù)骨缺損。這些結(jié)果說(shuō)明，BMSCs可能是未來(lái)關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的理想種子細(xì)胞。

3 脂肪干細(xì)胞

脂肪干細(xì)胞(adipose derived mesenchymal stem cells， ADMSCs)具有來(lái)源廣、容易獲取、能分泌多種細(xì)胞因子、具有多向分化潛能等特點(diǎn)，這些優(yōu)勢(shì)使其在修復(fù)重建領(lǐng)域獲得了較為廣泛的應(yīng)用。Koh等[20]將骨關(guān)節(jié)炎患者自體的ADMSCs分離培養(yǎng)后注入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，隨訪2年后發(fā)現(xiàn)患者關(guān)節(jié)疼痛癥狀明顯緩解，磁共振成像(magnetic resonance imaging， MRI)評(píng)分顯著提高。Wang等[21]甚至將人來(lái)源的ADMSCs注入免疫完全且有骨關(guān)節(jié)炎的大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)，術(shù)后發(fā)現(xiàn)患側(cè)關(guān)節(jié)具有良好的關(guān)節(jié)軟骨再生；Feng等[22]將標(biāo)記的異體ADMSCs復(fù)合透明質(zhì)酸注入羊的關(guān)節(jié)腔內(nèi)，術(shù)后14周觀察到標(biāo)記細(xì)胞在滑膜囊內(nèi)存活，且MRI提示骨關(guān)節(jié)炎明顯改善。這些結(jié)果初步證實(shí)ADMSCs不僅可促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨再生，且具有較低的免疫原性，這為異體移植修復(fù)提供了可能。盡管同種異體ADMSCs在關(guān)節(jié)修復(fù)重建領(lǐng)域獲得了一定成功，但其體內(nèi)長(zhǎng)期轉(zhuǎn)歸如何仍需進(jìn)一步研究。此外，同種異體細(xì)胞移植有疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)，其臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化仍面臨較大挑戰(zhàn)。

4 胚胎干細(xì)胞

胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)具有無(wú)限增殖和分化成各種終末細(xì)胞的能力，這是任何細(xì)胞都無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)。大部分研究已證實(shí)利用細(xì)胞因子定向誘導(dǎo)、共培養(yǎng)誘導(dǎo)等方式可有效提高ESCs的體外成軟骨率。Wang等[23]證實(shí)培養(yǎng)體系中添加細(xì)胞因子可提高人ESCs體外軟骨再生率；McKee等[24]應(yīng)用壓力刺激聯(lián)合三維支架材料促進(jìn)ESCs體外成軟骨。Zhang等[25]發(fā)現(xiàn)，將人來(lái)源的ESCs外泌體注入骨關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)腔內(nèi)12周后，大鼠的關(guān)節(jié)軟骨獲得了較為理想的再生，且其骨關(guān)節(jié)炎癥狀明顯好轉(zhuǎn)。這些研究結(jié)果提示ESCs具有較強(qiáng)的軟骨再生能力。盡管如此，目前ESCs在軟骨再生領(lǐng)域的研究仍處于初級(jí)階段，有關(guān)ESCs的調(diào)控分化機(jī)制至今尚未明確。更重要的是，ESCs主要來(lái)源于胚胎，且具有自發(fā)成瘤風(fēng)險(xiǎn)，內(nèi)移植后的免疫排斥反應(yīng)問(wèn)題、成瘤問(wèn)題、疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)等均是其臨床轉(zhuǎn)化的障礙。

5 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)是利用反轉(zhuǎn)錄病毒將Oct4、Sox2、Klf4等轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入成纖維細(xì)胞后獲得的具有無(wú)限自我更新能力、多向分化潛能的干細(xì)胞[26]。這些重編程細(xì)胞的功能與ESCs十分相近，是軟骨組織工程重要的種子細(xì)胞來(lái)源。Diekman等[27]將大鼠成纖維細(xì)胞重編程獲得的iPSCs進(jìn)行體外軟骨定向誘導(dǎo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞群分化成了較為成熟的軟骨樣細(xì)胞。Ko等[28]發(fā)現(xiàn),將人來(lái)源的iPSCs體外成軟骨誘導(dǎo)后注入具有骨關(guān)節(jié)炎的裸鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)12周后，動(dòng)物的骨關(guān)節(jié)炎癥狀得到明顯緩解，且組織學(xué)檢測(cè)證實(shí)其軟骨的健康狀態(tài)顯著優(yōu)于對(duì)照組。這些研究結(jié)果為iPSCs在軟骨再生領(lǐng)域的應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。由于成體干細(xì)胞(BMSCs、ADMSCs等)隨年齡增長(zhǎng)其活性及功能狀態(tài)逐漸下降，iPSCs無(wú)疑為患者提供了重要的細(xì)胞選擇方案。

6 經(jīng)血源子宮內(nèi)膜干細(xì)胞

經(jīng)血源子宮內(nèi)膜干細(xì)胞(menstrual blood-derived mesenchymal stem cells, MenSCs)是近年發(fā)現(xiàn)的間充質(zhì)干細(xì)胞。Meng等[29]在2007年首次報(bào)道了該細(xì)胞。MenSCs是從月經(jīng)血或者子宮內(nèi)膜中分離獲得的細(xì)胞群。他們發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞高表達(dá)CD9、CD29、CD41a、CD44、CD59、CD73、CD90和CD105等干細(xì)胞表面標(biāo)記物，倍增次數(shù)可超過(guò)68次，且具有較強(qiáng)的成骨、成軟骨、成脂能力，這些特性均符合BMSCs的基本特性。此后有關(guān)MenSCs生物學(xué)特性的報(bào)道陸續(xù)出現(xiàn)。有文獻(xiàn)[30-32]報(bào)道MenSCs比BMSCs具有更旺盛的增殖能力、更強(qiáng)的多向分化潛能、更低的腫瘤形成風(fēng)險(xiǎn)。Wolff等[33]證實(shí)MenSCs 在成軟骨誘導(dǎo)液中培養(yǎng)21 d后形成了軟骨樣細(xì)胞團(tuán)塊，并表達(dá)軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)如糖胺聚糖、Ⅱ型膠原蛋白等。Patel等[34]進(jìn)一步證實(shí)MenSCs具有明確的軟骨分化、骨分化、脂肪分化潛能。這些結(jié)果提示，MenSCs可作為軟骨組織工程的候選種子細(xì)胞。但MenSCs的軟骨再生能力如何？與軟骨細(xì)胞、BMSCs等相比，其形成能力有無(wú)差異？體內(nèi)軟骨再生穩(wěn)定性如何？長(zhǎng)期轉(zhuǎn)歸如何？這些與臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化密切相關(guān)的問(wèn)題仍需進(jìn)一步探討。

7 展望

盡管軟骨組織工程再生技術(shù)的應(yīng)用研究已獲得諸多進(jìn)展，但種子細(xì)胞的來(lái)源問(wèn)題仍是軟骨組織工程的重要瓶頸。軟骨細(xì)胞是目前最成熟、應(yīng)用最廣泛的種子細(xì)胞，但其在去分化問(wèn)題、獲取后繼發(fā)組織缺損等仍是臨床轉(zhuǎn)化面臨的重要挑戰(zhàn)。因此，明確軟骨細(xì)胞生理狀態(tài)下的發(fā)育及分化機(jī)制，應(yīng)用軟骨細(xì)胞的發(fā)育機(jī)制優(yōu)化體外培養(yǎng)擴(kuò)增體系可能是避免軟骨細(xì)胞去分化、穩(wěn)定其細(xì)胞表型的重要方向。而為避免獲取種子細(xì)胞造成的繼發(fā)供區(qū)組織缺損，BMSCs、MenSCs等是較為理想的候選細(xì)胞。盡管BMSCs在關(guān)節(jié)微環(huán)境中軟骨再生穩(wěn)定，但其在皮下環(huán)境的骨化問(wèn)題仍是限制其臨床轉(zhuǎn)化的重要瓶頸。深入探討B(tài)MSCs骨化機(jī)制、軟骨細(xì)胞抑制BMSCs骨化機(jī)制是解決BMSCs在皮下環(huán)境骨化問(wèn)題的切入點(diǎn)。盡管ADMSCs、MenSCs來(lái)源廣、易獲取，但其軟骨形成能力是否能滿足臨床應(yīng)用需求仍需進(jìn)一步驗(yàn)證，其體內(nèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定性和安全性如何仍需大量的大動(dòng)物及臨床試用研究。iPSCs、ESCs等細(xì)胞具有強(qiáng)大的軟骨再生能力，但其人體內(nèi)的生物安全性仍需進(jìn)一步驗(yàn)證，此外臨床轉(zhuǎn)化所面臨的倫理問(wèn)題也需解決。綜上所述，前期研究成果為軟骨組織工程的臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化提供了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，但這些種子細(xì)胞在臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化前仍有諸多科學(xué)問(wèn)題需闡明。