王麗娟，柯潤輝，石 磊，安紅梅，楊春艷，陳嘉杰，吳奕萱

（1.青島大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266071；2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100015）

甜味劑是一類重要的食品添加劑，能改善食品風(fēng)味和口感，提高食品品質(zhì)，尤其是人工甜味劑因成本低、甜度高、大多不參與代謝過程等優(yōu)點(diǎn)成為蔗糖的代用品廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代食品工業(yè)[1-3]，但其可能存在的食品安全風(fēng)險(xiǎn)也一直備受爭議。因此，甜味劑的安全性和使用限量一直是各國政府和相關(guān)機(jī)構(gòu)關(guān)注的熱點(diǎn)。我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定了甜味劑的使用范圍和限量[4]。隨著食品工業(yè)的發(fā)展，復(fù)合甜味劑的使用和新型甜味劑的開發(fā)成為發(fā)展的潮流和趨勢，但這也對監(jiān)管提出了新的挑戰(zhàn)。2008年11月，美國食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)瑞鮑迪苷A可以作為甜味劑應(yīng)用到美國的食品和飲料中[5]。2014年5月，美國FDA批準(zhǔn)高倍甜味劑愛德萬甜作為非營養(yǎng)甜味劑和增味劑用于除肉類及家禽之外的食品中[6]。隨后，歐盟和我國也相繼批準(zhǔn)使用食品添加劑新品種愛德萬甜?？紤]到人工甜味劑的使用所帶來的安全隱患，近年來“植物甜味劑”的產(chǎn)量和使用量持續(xù)增長。目前，國際市場上產(chǎn)業(yè)化和銷路最好的天然植物甜味劑為甘草甜素、甜菊糖（甜葉菊甙）和羅漢果甙[7]，并應(yīng)用于食品工業(yè)，但鮮有此類甜味劑相關(guān)檢測方法的報(bào)道。酒類作為一個(gè)重要的日常消費(fèi)品，其質(zhì)量安全決定了消費(fèi)安全。近年來，我國釀酒行業(yè)發(fā)展勢頭良好，生產(chǎn)技術(shù)水平和產(chǎn)品質(zhì)量不斷提升，但也存在較多問題。由于經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)使，一些不法商販為掩蓋酒體苦、澀等不良口感，改善風(fēng)味，出現(xiàn)在酒中違法添加非自生發(fā)酵產(chǎn)物的現(xiàn)象。根據(jù)國家食品安全監(jiān)督抽檢結(jié)果，酒類產(chǎn)品中違法或過量添加甜味劑是其中一個(gè)突出問題，已成為監(jiān)管重點(diǎn)，但仍有一些企業(yè)通過變換種類等方式逃避監(jiān)管，將未納入監(jiān)管范圍的一些新型甜味劑（包括植物甜味劑）作為替代品，謀取不正當(dāng)利益。因此，建立快速、準(zhǔn)確測定酒類產(chǎn)品中包含人工新型甜味劑和天然甜味劑在內(nèi)的復(fù)合甜味劑的方法顯得非常必要。

近年來，國內(nèi)外關(guān)于酒類產(chǎn)品中甜味劑的研究很多[8-10]，我國也建立了關(guān)于甜蜜素、糖精鈉、阿斯巴甜等傳統(tǒng)甜味劑檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)[11-13]，但這些研究與標(biāo)準(zhǔn)多針對一種或幾種甜味劑，且大多為液相色譜法[14-16]，抗干擾能力較弱，易產(chǎn)生假陽性的情況，即使近幾年發(fā)布的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[17]和相關(guān)文獻(xiàn)[1，18-19]，檢測種類也并不廣泛，對于批準(zhǔn)使用的甜味劑新品種，鮮有文獻(xiàn)報(bào)道，僅可查到的幾篇也沒有針對酒類產(chǎn)品的檢測[6，20]，更沒有相關(guān)的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)、產(chǎn)品使用限量指標(biāo)等。本研究利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了酒類產(chǎn)品中13種人工及天然甜味劑的檢測方法，覆蓋了目前市場上商品化使用的人工甜味劑種類。本方法簡便、快速、靈敏，為酒類產(chǎn)品的生產(chǎn)和流通領(lǐng)域中甜味劑的監(jiān)測提供了技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：白酒、葡萄酒、黃酒樣品，購自零售超市和商店。

儀器設(shè)備：LCMS-8050高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（日本Shimadzu公司，具體配置為LC-20ADXR×2輸液泵，SIL-20AXR自動(dòng)進(jìn)樣器，DGU-20A3R在線脫氣機(jī)，CTO-20AC柱溫箱，CBM-20A系統(tǒng)控制器，LCMS-8050三重四極桿質(zhì)譜儀，LabSolutions Ver.5.91色譜工作站）；超聲波清洗器（KQ-500DE，昆山超聲儀器有限公司）；Milli-Q Reference超純水器（美國Millipore公司）；Acquity UPLC HSS T3柱（100 mm×2.1 mm,1.8 μm，美國Waters公司）；0.22 μm尼龍濾膜（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）。

試劑：乙腈、甲醇、乙酸、乙酸銨（HPLC級，Dikma公司）；甜蜜素（Sodium cycamate）、糖精鈉（Saccharin sodium）、安賽蜜（Acesulfame-K）、阿斯巴甜（Aspartame）、三氯蔗糖（Sucralose）、甜菊糖苷（Stevioside）、紐甜（Neotame）、阿力甜（Alitame）、甘草酸（Glycyrrhizic acid）、愛德萬甜（Advantame）、瑞鮑迪苷A（Rebaudioside A）、羅漢果苷V（Mogroside V）、18β-甘草酸（18β-Glycyrrhetinic acid），美國Sigma-Aldrich公司，加拿大TRC公司和德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，純度≥95%。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取13種人工及天然甜味劑標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL棕色容量瓶中，用水或甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液，于-18 ℃避光保存。用甲醇稀釋并配制中間濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4 ℃避光保存。根據(jù)需要用流動(dòng)相逐級稀釋，配制成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 樣品前處理方法

取葡萄酒、黃酒樣品2.0 mL于10 mL容量瓶中，用超純水定容，超聲混勻，過0.22 μm濾膜，濾液供測定。

準(zhǔn)確吸取10 mL白酒樣品于50 mL燒杯中，于60 ℃恒溫水浴鍋加熱蒸發(fā)至體積不再減少，停止加熱，冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用超純水多次淌洗燒杯合并溶液至容量瓶，定容，過0.22 μm濾膜，濾液供測定。

1.4 檢測條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC HSS T3柱（100 mm×2.1 mm,1.8μm，美國Waters公司）。流動(dòng)相：（A）甲醇和（B）10 mmol/L乙酸銨水溶液，流速0.35 mL/min；梯度洗脫程序?yàn)椋? min，甲醇的體積分?jǐn)?shù)為10%；0～1 min，甲醇的體積分?jǐn)?shù)從10 % 升至50 %，1～3 min，甲醇的體積分?jǐn)?shù)從50%升至80%，3～4 min，甲醇的體積分?jǐn)?shù)從80%升至100%，并保持1.5 min；5.51 min，甲醇的體積分?jǐn)?shù)從100 %降至10 %；5.51～6.5 min，甲醇的體積分?jǐn)?shù)保持10%。柱溫為35 ℃；進(jìn)樣體積：2 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

分析儀器：LCMS-8050；離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：負(fù)離子模式掃描；離子源接口電壓：0.5 kV；霧化氣：氮?dú)?.0 L/min；干燥氣：氮?dú)?0 L/min；碰撞氣：氬氣；DL溫度：250 ℃；加熱模塊溫度：400 ℃；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；駐留時(shí)間：15 ms；延遲時(shí)間：3 ms；13種人工及天然甜味劑標(biāo)準(zhǔn)品MRM參數(shù)：見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 甜味劑種類的選擇

表1 13種甜味劑的保留時(shí)間和質(zhì)譜條件

本研究選擇了13種人工及天然甜味劑，主要包括酒類產(chǎn)品檢測標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定檢測的甜味劑（甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜等），文獻(xiàn)報(bào)道和市場調(diào)研酒類產(chǎn)品中可能使用的甜味劑（紐甜、甜蜜素），對于上述常見人工甜味劑我國建立了標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，且進(jìn)行了嚴(yán)格的監(jiān)管[21]，本研究也包含了鮮有文獻(xiàn)報(bào)道檢測方法的新型甜味劑（愛德萬甜）及天然甜味劑（甘草酸、18β-甘草酸、羅漢果苷V、瑞鮑甜苷A、甜菊糖苷），覆蓋了市場上較為容易獲得的甜味劑種類。

2.2 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相是影響峰形、響應(yīng)值、分離度、柱壓和分析時(shí)間的重要因素[22]。反相色譜的流動(dòng)相通常由有機(jī)溶劑（如甲醇、乙腈）和水組成，本研究對流動(dòng)相進(jìn)行了考察和優(yōu)化，結(jié)果表明，有機(jī)相為強(qiáng)洗脫溶劑乙腈時(shí)，組分分離較差，且乙腈比甲醇毒性更大，因此選擇甲醇為分析的有機(jī)相。水相常用緩沖鹽溶液和弱酸性溶液，以增加電離度，提升響應(yīng)值，實(shí)驗(yàn)比較了甲醇-甲酸水溶液、甲醇-乙酸銨溶液、甲醇-乙酸水溶液3種流動(dòng)相體系，發(fā)現(xiàn)甲醇-甲酸水溶液、甲醇-乙酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)，部分甜味劑色譜峰較寬且拖尾嚴(yán)重，故選擇甲醇-乙酸銨溶液為流動(dòng)相，進(jìn)一步對乙酸銨的濃度進(jìn)行優(yōu)化，比較了5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L 3個(gè)不同濃度的乙酸銨水溶液的分離效果，發(fā)現(xiàn)5 mmol/L乙酸銨水溶液為水相時(shí)，響應(yīng)值較10 mmol/L低，繼續(xù)加大其濃度，響應(yīng)值增加并不明顯，且較高濃度的非揮發(fā)緩沖鹽溶液進(jìn)入質(zhì)譜，對離子源會(huì)造成一定程度的污染。10 mmol/L乙酸銨水溶液為水相時(shí)，因瑞鮑迪苷A的一個(gè)子離子與甜菊糖苷母離子相同，未達(dá)到基線分離，但通過質(zhì)譜通道，可以完成定量分析，其他11種甜味劑均可達(dá)到基線分離，故得到最優(yōu)的流動(dòng)相組成為甲醇-10 mmol/L乙酸銨溶液。

2.2.2 質(zhì)譜條件的選擇

對13種甜味劑分別在全掃描模式（MRM）下進(jìn)行掃描，分別確定其準(zhǔn)分子離子。根據(jù)13種人工及天然甜味劑的分子結(jié)構(gòu)特征，大部分甜味劑在電噴霧離子源中易失去H+成為R-COO-和R-SO3-，且在負(fù)離子監(jiān)測模式下準(zhǔn)分子離子峰強(qiáng)度高于正離子模式，本研究比較了正離子和負(fù)離子模式下各物質(zhì)的響應(yīng)值，發(fā)現(xiàn)大部分目標(biāo)化合物在負(fù)離子模式下的響應(yīng)值明顯優(yōu)于正離子模式，愛德萬甜則在正負(fù)離子模式下均有很高的響應(yīng)，為降低正負(fù)離子同時(shí)檢測的干擾，均選擇電噴霧離子源負(fù)離子模式對其進(jìn)行檢測。利用儀器的自動(dòng)優(yōu)化功能，分別對Q1、Q3、CE等進(jìn)行優(yōu)化，確定13種人工及天然甜味劑的母離子和子離子的最佳質(zhì)譜條件，各化合物的質(zhì)譜條件見表1。13種人工及天然甜味劑的總離子流圖見圖1。

圖1 13種甜味劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

由于白酒中含有高濃度的乙醇及微量香味成分，使用質(zhì)譜檢測器檢測時(shí)，乙醇會(huì)影響待測物的測定。葡萄酒、黃酒中雖然乙醇含量濃度比例較低，但因其含有一定比例的糖類及色素，在質(zhì)譜測定時(shí)，也會(huì)造成基質(zhì)抑制效應(yīng)。為減少基質(zhì)效應(yīng)的影響，本研究對酒精度較高的白酒進(jìn)行加熱除乙醇，針對葡萄酒、黃酒則進(jìn)行稀釋后進(jìn)樣，以降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.4 方法學(xué)評價(jià)

2.4.1 方法的線性范圍和檢出限

將13種人工及天然甜味劑的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用流動(dòng)相分別配制系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，按上文1.4部分所確定的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測，以各組分定量離子色譜峰面積對相應(yīng)的質(zhì)量濃度繪制各被測物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，結(jié)果表明，13種人工及天然甜味劑在一定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.995。以信噪比為3確定方法的檢出限（LOD），以信噪比為10確定方法的定量限（LOQ）。結(jié)果見表2。

表2 13種甜味劑的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

表3 酒類產(chǎn)品13種甜味劑添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.4.2 精密度和回收率

分別選取空白白酒、黃酒、葡萄酒做回收率實(shí)驗(yàn)，用微量移液器向空白酒中準(zhǔn)確加入一定量的13種人工及天然甜味劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，配成低、中、高3個(gè)濃度水平進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，按1.3節(jié)所述實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行處理和測定，進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算其回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果表明，各目標(biāo)物平均回收率在90.6 %～106.5 %之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于8.8%（表3），方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合多殘留分析的要求。

2.5 實(shí)際樣品的測定

按所建立的方法對購自零售超市和商店的共10批次葡萄酒、5批次白酒和5批次黃酒樣品進(jìn)行了13種人工及天然甜味劑的篩查，每個(gè)樣品重復(fù)測定3次。所檢葡萄酒樣品中有1個(gè)檢出安賽蜜、糖精鈉和甜蜜素，含量分別為28.93 μg/L、3399.67 μg/L、566.45 μg/L，其余樣品的檢測結(jié)果均為陰性。葡萄酒陽性樣品的MRM質(zhì)譜圖見圖2。

圖2 某葡萄酒樣品中檢出的安賽蜜、糖精鈉和甜蜜素質(zhì)譜圖

3 結(jié)論

本研究建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀同時(shí)測定酒類產(chǎn)品中13種人工及天然甜味劑含量的方法，該方法前處理簡單、分析速度快、靈敏度高。對實(shí)際樣品的檢測表明，該方法能夠滿足酒類產(chǎn)品中13種人工及天然甜味劑的分析要求，與國標(biāo)方法相比，大大提高了分析效率，降低了分析成本。適合大批量酒類產(chǎn)品中13種人工及天然甜味劑的定性和定量分析。