馬瑞佳，蔡晨晨，雷財玉，王友法，陸登俊*

（廣莫大學輕工與食品工程學院，廣莫 南寧 530004）

近年來，保鮮劑的研究已經(jīng)成為熱點之一。食品在生產(chǎn)和貯存過程中極易受到微生物的污染而發(fā)生變質(zhì)現(xiàn)象，帶來了極大的經(jīng)濟損失，所以延長食品的貨架期顯得尤為重要。蔗渣作為甘蔗制糖工業(yè)的一種副產(chǎn)品，僅將其用于鍋爐燃料回回所產(chǎn)生的經(jīng)濟效益是極低的[1-2]。Mishra等[3]探索了各種木質(zhì)纖維素原料使用不同的無機酸作為分離餾分回回最大數(shù)量的可發(fā)酵糖，提供了蔗渣利用的一條新途徑。蔗渣主要成分是纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等，這些成分決定了蔗渣具有吸附功能。劉雪梅等[4]以甘蔗渣為原料，將其在真空環(huán)境下炭化制得甘蔗渣炭，研究了甘蔗渣炭對廢水中Cr（VI）的吸附效果。Juchen等[5]將釀造過程的副產(chǎn)品麥芽甘蔗渣作為活性藍色BF-5G染料的生物吸附劑。

納米材料的研究在近幾年來也取得了引人注目的成就，納米材料由于其尺寸介于原子、分子和宏觀體系之間[6]，性能更加符合人們的要求。銀基抗菌材料抗菌效果優(yōu)于其他金屬基材料，比如銅基、氧化鋅、二氧化鈦等[7]。納米氧化銀作為一種納米材料，其性能遠遠優(yōu)于氧化銀，目前國內(nèi)外對納米氧化銀的研究很多，其在數(shù)據(jù)存儲和光伏電池等方面均有應用[8]。殷立峰等[9]用納米氧化銀開發(fā)了一種光電化學太陽能電池。Prasher等[10]提出隨著多重耐藥超級細菌的發(fā)現(xiàn)，納米氧化銀作為對抗致病超級細菌的新一代治療藥物，具有可調(diào)的物理化學效力。無論是單獨作用還是與主流抗生素協(xié)同作用，都具有廣泛的抗菌活性，使納米氧化銀作為潛在的抗菌素具有重要的研究意義。Archana等[11]利用納米氧化銀的抗菌性開發(fā)了一種新型的傷口愈合材料。金盈等[12]在改性纖維上負載納米氧化銀，從而賦予納米復合纖維良好的抑菌性能。雖然已有不少學者對納米氧化銀進行開發(fā)應用，但是利用蔗渣負載納米氧化銀制備保鮮劑的研究鮮見報道。納米氧化銀也作為一種納米抗菌材料被廣泛應用，具有發(fā)全、高效、廣譜、不易產(chǎn)生抗藥性和耐熱性等特點[13]。

蔗渣是甘蔗制糖工業(yè)的副產(chǎn)品，資源豐富，本研究通過蔗渣預處理，將其作為納米氧化銀的載體，有助于納米氧化銀在載體上分布均勻，大大減少了納米氧化銀團聚的現(xiàn)象。此新型防腐劑，為蔗渣的綜合利用提供了新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蔗渣（100 目篩）、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌廣莫大學輕工與食品工程學院實驗室提供；蔗糖酯廣莫高通食品科技有限公司；NaOH、AgNO3（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇（分析純） 天津市富宇精細化工有限公司。

1.2 儀器與設備

Zetasizer Nano S納米粒度分析儀 英國馬爾文公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司；LG10-2.4A型離心機 磁海普力斯發(fā)防工程有限公司；UV-1100紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；XW-80A旋渦混合器 上海精密科學儀器有限公司；S-3400N型掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本日立公司；4153B172型X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）儀 日本理學公司。

1.3 方法

1.3.1 納米氧化銀的制備

用容量瓶配制NaOH和AgNO3溶液。將一定量的蔗糖酯加到配制好的NaOH溶液中攪拌均勻，將燒杯置于超聲波清洗器中10 min后，在超聲環(huán)境中緩慢滴加AgNO3溶液，溶液逐漸變成黑褐色。反應結束后，進行離心分離，產(chǎn)物用蒸餾水和無水乙醇各洗滌2 次。洗凈后的產(chǎn)物置于60 ℃真空干燥箱中干燥1 d，得到納米氧化銀保鮮劑。通過改變NaOH、AgNO3濃度、蔗糖酯質(zhì)量濃度、超聲場中反應時間和功率得出納米氧化銀顆粒生成的最佳條件。

1.3.2 納米氧化銀粒徑的測定

納米氧化銀的粒徑用馬爾文Zetasizer Nano S激光粒度儀進行測量，取一定量的納米氧化銀水懸液于燒杯中，用蒸餾水稀釋至適當濃度，放入粒度儀中進行測量。

1.3.3 蔗渣-納米氧化銀的制備

在得出納米氧化銀顆粒制備的最優(yōu)工藝條件后，在該最優(yōu)工藝條件基礎上制備蔗渣-納米氧化銀，用容量瓶配制NaOH和AgNO3溶液。方一定量蔗渣和蔗糖酯中加入AgNO3溶液，攪拌均勻。將燒杯置于超聲波清洗器中10 min后，在超聲環(huán)境中緩慢滴加NaOH溶液，溶液逐漸變成黑褐色。反應結束后，進行離心分離，產(chǎn)物用蒸餾水和無水乙醇各洗滌2 次。洗凈后的產(chǎn)物置于60 ℃真空干燥箱中干燥1 d，得到蔗渣-納米氧化銀保鮮劑。

1.3.4 XRD分析

稱取一定量的蔗渣-納米氧化銀樣品，烘干研磨，將制得的蔗渣-納米氧化銀粉末鋪撒于玻璃片凹槽中，使樣品覆蓋整個凹槽，壓平樣品，然后放入衍射儀中掃描，衍射角2θ掃描范圍為20°～80°，掃描速度10°/min，掃描電壓40 kV，掃描電流100 mA。

1.3.5 SEM分析

取少量液體導電膠滴在樣品臺上，用鑷子取微量蔗渣-納米氧化銀粉末撒在液體導電膠中，使樣品達到半浸沒狀態(tài)，待液體導電膠干后置于電鏡載物臺上，對保鮮劑樣品進行形貌和顯微結構的表征分析。

1.3.6 抗菌性能測定

采用最小抑菌濃度（minimal inhibit concentration，MIC）的標準方法考察蔗渣-納米氧化銀保鮮劑對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌性能，參考HG-T 3794—2005《無機抗菌劑——性能及評價》[14]。

1.3.6.1 培養(yǎng)基的配制

采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨5 g、氯化鈉2.5 g、牛肉膏2.5 g、瓊脂9 g、蒸餾水500 mL。

方燒杯內(nèi)加蒸餾水100 mL，加入牛肉膏2.5 g、蛋白胨5 g、氯化鈉2.5 g，用電爐加熱。待燒杯內(nèi)各組分溶解后，加入瓊脂，不斷攪拌以免黏底。瓊脂完全溶解后補足失水，用NaOH調(diào)整pH值到7.2～7.4，分裝在錐形瓶里，用高壓蒸汽滅菌：121 ℃維持20 min。

1.3.6.2 菌懸液的配制

菌懸液的配制在無菌操作臺上進行，以除去雜菌影響。用接種環(huán)取出實驗菌種放入無菌水中，用渦旋混合器混合20 s，將菌種均勻分散到溶液中形成菌懸液。將懸菌液用無菌水稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4梯度。

1.3.6.3 抗菌液的配制

抗菌液的配制采用二倍稀釋法[15]，取標記為1～4號共4 支試管排列于試管架上。稱取23.173 mg蔗渣-納米氧化銀樣品于燒杯中，加入20 mL無菌水，配制蔗渣-納米氧化銀抗菌液，混合均勻。1號試管中加入14.0 mL蔗渣-納米氧化銀水懸液，其余試管均加入7.0 mL無菌水。吸取1號試管中7.0 mL納米氧化銀溶液加入到2號試管中，混合均勻，再從2號試管中吸取7.0 mL加到3號試管中，以此類推，直至第4管。

1.3.6.4 MIC的測定

取56 個無菌培養(yǎng)皿分為14 組，7 組培養(yǎng)大腸桿菌，7 組培養(yǎng)枯草芽孢桿菌，每組4 個。其中第5組加入等量無菌水作對照，第6組加入與第1組抗菌液中所含等量的納米氧化銀作對照，第7組加入與第1組抗菌液中所含等量的蔗渣作對照。用移液槍分別吸取1～4號蔗渣-納米氧化銀抗菌液1.0 mL對應加于無菌培養(yǎng)皿中，即1號抗菌液加入到第1組無菌培養(yǎng)皿。方已加入抗菌液的培養(yǎng)皿中傾注約15 mL的培養(yǎng)基，將培養(yǎng)皿蓋好，輕搖使培養(yǎng)基與抗菌液充分混勻，搖勻后平放，待瓊脂凝固后備用。

培養(yǎng)基凝固后，用移液槍吸取菌懸液0.1 mL接種到培養(yǎng)皿中，用涂布棒將菌懸液均勻分布在培養(yǎng)皿表面。接種后水平放置20 min，倒置恒溫培養(yǎng)24 h。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結果與分析

2.1 納米氧化銀粒徑測定結果

2.1.1 AgNO3濃度對納米氧化銀粒徑的影響

在NaOH濃度0.02 mol/L、蔗糖酯質(zhì)量濃度1.0 g/L、反應溫度40 ℃、反應時間30 min、超聲功率350 W的條件下考察AgNO3濃度對納米氧化銀粒徑的影響。由圖1可知，隨著AgNO3濃度增加，納米氧化銀粒徑逐漸減小，當AgNO3濃度超過0.02 mol/L時，納米氧化銀粒徑逐漸增加。在低濃度AgNO3范圍內(nèi)，增大其濃度有利于加快反應速率，生成數(shù)量多、粒徑小的納米氧化銀顆粒。當AgNO3濃度過大時，納米氧化銀生成速率小于生長速率，同時生成的大量納米氧化銀粒子容易發(fā)生碰撞團聚，甚至過量的銀離子會在原有晶核的基礎上二次成核，故納米氧化銀粒徑增大。納米氧化銀粒徑越小，其比表面積越大，氧化銀抗菌性越強，分散性越好，越易被蔗渣吸附。在AgNO3濃度為0.02 mol/L時，納米氧化銀粒徑最小，為107.6 nm。

圖1 AgNO3濃度對納米氧化銀粒徑的影響Fig. 1 Effect of AgNO3 concentration on particle size of nano silver oxide

2.1.2 NaOH濃度對納米氧化銀粒徑的影響

圖2 NaOH濃度對納米氧化銀粒徑的影響Fig. 2 Effect of NaOH concentration on particle size of nano silver oxide

NaOH濃度對納米氧化銀粒徑的影響很大。在AgNO3濃度0.02 mol/L、蔗糖酯質(zhì)量濃度1.0 g/L、反應溫度40 ℃、反應時間30 min、超聲功率350 W的條件下考察NaOH濃度對納米氧化銀粒徑的影響。由圖2可知，當NaOH濃度增加，納米氧化銀粒徑先增加后減小再增加。當NaOH在低濃度范圍內(nèi)，由于NaOH不足，納米氧化銀生成速率較慢而生長速率較快，故粒徑較大。當NaOH濃度超過一定值后，其反應速率增加，納米氧化銀生成速率大于生長速率，故納米氧化銀粒徑逐漸較小。由于蔗糖酯在低堿度穩(wěn)定，在高堿度容易發(fā)生水解使其親水性能下降[16]，降低其對納米氧化銀粒子的保護作用，故納米氧化銀粒徑會增大。在NaOH濃度為0.03 mol/L時，納米氧化銀粒徑最小，為108.4 nm。

2.1.3 蔗糖酯質(zhì)量濃度對納米氧化銀粒徑的影響

在AgNO3濃度0.02 mol/L、NaOH濃度0.03 mol/L、反應溫度40 ℃、反應時間30 min、超聲功率350 W的條件下考察蔗糖酯質(zhì)量濃度對納米氧化銀粒徑的影響。由圖3可知，納米氧化銀粒子粒徑隨著蔗糖酯濃度先減小后增加。蔗糖酯質(zhì)量濃度在0.8～1.4 g/L范圍內(nèi)，納米氧化銀粒徑隨著蔗糖酯質(zhì)量濃度增加而減小，這是因為蔗糖酯在納米氧化銀生成反應中能吸附納米氧化銀粒子抑制其生長，降低納米氧化銀生長速率。但是由于蔗糖酯會增加溶液的黏度，同時過量的蔗糖酯會吸附在納米氧化銀-蔗糖酯溶膠顆粒上，降低粒子的穩(wěn)定性。所以當蔗糖酯用量過多時，納米氧化銀粒徑反而增加。當蔗糖酯質(zhì)量濃度在1.4 g/L時，納米氧化銀粒徑最小，為97.38 nm。

圖3 蔗糖酯質(zhì)量濃度對納米氧化銀粒徑的影響Fig. 3 Effect of sucrose ester concentration on particle size of nano silver oxide

2.1.4 反應溫度對納米氧化銀粒徑的影響

圖4 反應溫度對納米氧化銀粒徑的影響Fig. 4 Effect of reaction temperature on particle size of nano silver oxide

在AgNO3濃度0.02 mol/L、NaOH濃度0.03 mol/L、蔗糖酯質(zhì)量濃度1.4 g/L、反應時間30 min、超聲功率350 W的條件下，考察反應溫度對納米氧化銀粒徑的影響。由圖4可知，反應溫度在40 ℃時納米氧化銀粒徑最小，為91.22 nm。當反應溫度低于40 ℃時，由于溫度過低，納米氧化銀生成所需的能量不足[17]，故反應速率低于生長速率，納米氧化銀粒徑較大。當反應溫度超過40 ℃，隨著反應溫度的升高，納米氧化銀粒徑主要呈增加的趨勢。這是由于隨著反應溫度升高，布朗運動增加，納米氧化銀顆粒碰撞團聚現(xiàn)象加劇[18]，故粒徑增加。此外，納米氧化銀在高溫下容易分解成銀單質(zhì)[19]，所以在反應溫度為40 ℃時最佳。

2.1.5 反應時間對納米氧化銀粒徑的影響

在AgNO3濃度0.02 mol/L、NaOH濃度0.03 mol/L、蔗糖酯質(zhì)量濃度1.4 g/L、反應溫度40 ℃、超聲功率350 W的條件下考察反應時間對納米氧化銀粒徑的影響。由圖5可知，在上述實驗條件中，反應時間對納米氧化銀粒徑影響很大。納米氧化銀生成反應過程中，反應體系先生成小顆粒，然后再逐漸長大，最后形成穩(wěn)定的納米氧化銀粒子。在反應時間30～110 min范圍內(nèi)，納米氧化銀粒徑主要隨著反應時間的延長而減小。這是因為生成的大量晶核可以穩(wěn)定分散在溶液中，沉淀反應能夠在穩(wěn)定條件下反應完全，因而納米氧化銀粒徑主要呈減小的趨勢。但是反應完全后，隨著時間的延長，納米氧化銀顆粒會發(fā)生碰撞團聚，因而粒徑會有所增加。反應時間在第110分鐘時，納米氧化銀粒徑最小，為80.01 nm。

圖5 反應時間對納米氧化銀粒徑的影響Fig. 5 Effect of reaction time on particle size of nano silver oxide

2.1.6 超聲功率對納米氧化銀粒徑的影響

圖6 超聲功率對納米氧化銀粒徑的影響Fig. 6 Effect of ultrasonic power on particle size of nano silver oxide

在AgNO3濃度0.02 mol/L、NaOH濃度0.03 mol/L、蔗糖酯質(zhì)量濃度1.4 g/L、反應溫度40 ℃、反應時間110 min的條件下考察超聲功率對納米氧化銀粒徑的影響。由圖6可知，在上述實驗條件中，納米氧化銀粒徑隨著超聲功率的增加先減小后增加，由此可見超聲功率對納米氧化銀粒徑有較大影響。在溶液反應體系中，超聲波所起作用與攪拌有相似之處，能加快傳質(zhì)速率，提高反應速率。此外，超聲波空化作用所產(chǎn)生的微小氣泡能降低氧化銀晶核表面自由能[20]，降低了其生長速率，故在一定超聲波功率范圍內(nèi)，納米氧化銀粒徑隨著超聲波功率增加而減小。但所施加的超聲波功率超過一定范圍后，粒徑會增加，這是因為在空化作用過程中，空泡崩潰時產(chǎn)生的高壓、高溫度變化率會給反應造成一個極端的物理環(huán)境，當超聲功率過大時，傳質(zhì)和傳熱過程增大，增加了顆粒相互碰撞的幾率[21]，劇烈的物理化學作用又會引起生成的顆粒重新團聚[22]，超聲空化產(chǎn)生的剪切力也會增加，打碎已成核的納米顆粒，導致顆粒殘缺、大小不一[23]。其次，超聲波產(chǎn)生的空化作用能提高反應體系的溫度，使其超過反應體系最佳的溫度。當超聲波功率為400 W時氧化銀粒徑最小，為63.38 nm。

2.2 蔗渣-納米氧化銀的XRD分析

圖7 蔗渣-納米氧化銀的XRD圖譜Fig. 7 XRD pattern of bagasse-silver oxide particles

圖7 為蔗渣-納米氧化銀XRD圖譜，在2θ20°～80°有4 個特征衍射峰，與單質(zhì)銀標準卡（JCPDS卡編號65-2871）和氧化銀標準卡（JCPDS卡編號65-6811）對比得知，產(chǎn)物為銀和氧化銀的混合物。由圖7可知，納米氧化銀的強度較大，峰尖較窄且尖，說明合成的納米氧化銀結晶較好，XRD的結果表明納米氧化銀成功的吸附在蔗渣纖維上[24]，單質(zhì)銀的產(chǎn)生可能是實驗過程中氧化銀分解所造成的。

2.3 蔗渣-納米氧化銀SEM分析

圖8 蔗渣-納米氧化銀的SEM圖Fig. 8 SEM photograph of bagasse-silver oxide particles

如圖8所示，對蔗渣-納米氧化銀進行SEM成像，從而闡明其表面形貌和粒徑的測定[25]。由電鏡照片可以看出，蔗渣纖維表面呈粗糙狀態(tài)，在蔗渣纖維表面分散著許多小顆粒，這些白色小顆粒亮點為納米氧化銀粒子。SEM圖像清楚地顯示，沉淀法[26]制備的納米氧化銀為近球狀粒子，直徑較小，顆粒較為分散，其吸附在蔗渣表面，團聚現(xiàn)象不明顯，但分布無規(guī)律，只是簡單分散在蔗渣表面，可能因為蔗渣纖維吸附功能較弱，可通過對蔗渣纖維進行化學改性增強其吸附功能[27]。

2.4 蔗渣-納米氧化銀抑菌性能

2.4.1 蔗渣-納米氧化銀對大腸桿菌的抗菌性能

大腸桿菌屬于革蘭氏陰性短桿菌，廣泛分布于自然界和動物腸道中，大腸桿菌長期應對不同環(huán)境的過程中，會發(fā)生進化并增強其抗性，是一種極易造成食品污染的細菌[28]。圖9為不同濃度蔗渣-納米氧化銀對不同稀釋度（10-1、10-2、10-3、10-4）大腸桿菌的抗菌性能。蔗渣-納米氧化銀對稀釋度為10-1的大腸桿菌的MIC為289.662 5 μg/mL，對稀釋度為10-2的大腸桿菌的MIC為579.325 μg/mL，對稀釋度為10-3的大腸桿菌的MIC為289.662 5 μg/mL，對稀釋度為10-4的大腸桿菌的MIC為289.662 5 μg/mL。

圖9 蔗渣-納米氧化銀對大腸桿菌的抗菌結果Fig. 9 Antibacterial effect of bagasse-silver oxide on E. coli

表1 蔗渣-納米氧化銀對大腸桿菌的抗菌性能Table 1 Antibacterial activity of bagasse-silver oxide on E. coli

從表1可以看出，所有蔗渣-納米氧化銀樣品對大腸桿菌均有明顯的抑制作用。從無菌水對照組和蔗渣對照組可知對大腸桿菌起到抑制作用的物質(zhì)是納米氧化銀，蔗渣對大腸桿菌無抑制作用，蔗渣-納米氧化銀樣品和納米氧化銀樣品對大腸桿菌均有抑菌效果，蔗渣-納米氧化銀抑菌效果優(yōu)于納米氧化銀。這是因為由于蔗渣吸附納米氧化銀顆粒，使其均勻分布于蔗渣上，使得納米氧化銀顆粒團聚現(xiàn)象減少，增強了其抑菌性能。對比不同蔗渣-納米氧化銀抗菌液得到其MIC為289.662 5 μg/mL。

2.4.2 蔗渣-納米氧化銀對枯草芽孢桿菌的抗菌性

圖10 蔗渣-納米氧化銀對枯草芽孢桿菌的抗菌結果Fig. 10 Antibacterial effect of bagasse-silver oxide on B. subtilis

枯草芽胞桿菌是一類需氧型、內(nèi)生孢子的桿狀革蘭氏陽性菌[29]，具有較強的抗逆能力[30]?？莶菅挎邨U菌具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡、促進畜禽對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸回和增強免疫等作用，目前已在畜禽生產(chǎn)中廣泛應用[31]。圖10為不同濃度蔗渣-納米氧化銀對不同稀釋度（10-1、10-2、10-3、10-4）枯草芽孢桿菌的抗菌性能。納米氧化銀對稀釋度為10-1的枯草芽孢桿菌的MIC為289.662 5 μg/mL，對稀釋度為10-2的枯草芽孢桿菌的MIC為289.662 5 μg/mL，對稀釋度為10-3的枯草芽孢桿菌的MIC為579.325 μg/mL，對稀釋度為10-4的枯草芽孢桿菌的MIC為579.325 μg/mL。

表2 蔗渣-納米氧化銀對枯草芽孢桿菌的的抗菌性能Table 2 Antimicrobial activity of bagasse-silver oxide on B. subtilis

從表2可以看出，所有蔗渣-納米氧化銀樣品對枯草芽孢桿菌均有明顯的抑制作用。從無菌水對照組和蔗渣對照組可知對枯草芽孢桿菌起到抑制作用的物質(zhì)是納米氧化銀，蔗渣對枯草芽孢桿菌無抑制作用，蔗渣-納米氧化銀樣品和納米氧化銀樣品對枯草芽孢桿菌均有抑菌效果，蔗渣-納米氧化銀抑菌效果優(yōu)于納米氧化銀，這是因為由于蔗渣吸附納米氧化銀顆粒，使其均勻分布于蔗渣上，使得納米氧化銀顆粒團聚現(xiàn)象減少，增強了其對枯草芽孢桿菌的抑菌性能。對比不同蔗渣-納米氧化銀抗菌液得到其MIC為579.325 μg/mL。

3 結 論

本實驗在AgNO3濃度0.02 mol/L、NaOH濃度0.03 mol/L、蔗糖酯質(zhì)量濃度1.4 g/L、反應溫度40 ℃、反應時間110 min、超聲功率400 W的條件下制得的納米氧化銀粒徑最小，為63.38 nm。在此最優(yōu)條件下制備出蔗渣-納米氧化銀保鮮劑，通過XRD和SEM得出納米氧化銀吸附在蔗渣上；對蔗渣-納米氧化銀進行抑菌性能測定，得出蔗渣-納米氧化銀抗菌液對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的MIC分別為289.662 5 μg/mL和579.325 μg/mL。該項研究用蔗渣作為載體，納米氧化銀作為抑菌物質(zhì)制備了一種綠色、無毒的保鮮劑，為蔗渣吸附抗菌劑的研究開發(fā)提供科學依據(jù)，也為蔗渣的綜合利用提供了一條新途徑。