任海偉，石菊芬，蔡亞玲，范文廣，姜啟興，李志忠,*，裴佳雯，王彥蕊

（1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

生物活性肽是一類對(duì)人體功能具有積極作用，并可能最終影響健康的特殊蛋白質(zhì)片段[1]。生物活性肽一般含有3～20 個(gè)氨基酸，不僅具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還有促進(jìn)礦物結(jié)合、免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗氧化、抗血栓、降膽固醇、降血壓和抗腫瘤等生物學(xué)功能[2]。因其發(fā)全性高、來(lái)源豐富、生理功效明顯和易于消化吸回等優(yōu)點(diǎn)，生物活性肽一直是功能性食品的關(guān)注熱點(diǎn)，其中抗氧化活性肽的研究較為廣泛。研究表明，許多生物活性肽在母體蛋白中不一定有活性，但如果在體內(nèi)或體外用適當(dāng)生物學(xué)方法處理后，一些具有抗氧化活性的肽片段就會(huì)被釋放[3]，從而能夠保護(hù)身體免受活性氧（羥自由基、超氧陰離子自由基和H2O2等）和活性氮（NO、ONOO—、ONOOH）等自由基的攻擊，預(yù)防相關(guān)疾病的發(fā)生[4]。

目前，抗氧化肽的制備主要有酶解法、微生物發(fā)酵法和化學(xué)合成法等方法，其中酶解法條件溫和，水解程度易控制，能定位生產(chǎn)特定的肽，被視為一種常用的方法[5]。Cai Luyun等[6]使用堿性蛋白酶水解草魚(yú)皮制備得到較高活性的抗氧化肽。李玉芬等[7]以海蜇加工下腳料為原料制備膠原蛋白肽，發(fā)現(xiàn)風(fēng)味蛋白酶和胰蛋白酶分步酶解時(shí)的水解度和還原力高于單一酶水解。另一方面，超聲波因其空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)等特點(diǎn)在活性物質(zhì)提取、酶解反應(yīng)和高分子物質(zhì)降解等方面具有積極作用，尤其超聲作用能縮短酶解反應(yīng)時(shí)間、提高酶解效率、增加產(chǎn)物得率，已廣泛用于動(dòng)植物源蛋白質(zhì)和多肽的提取[8]。Zou Ye等[9]采用超聲波輔助堿性蛋白酶水解豬腦制備得到了分子質(zhì)量小、活性較強(qiáng)的抗氧化肽。Jia Junqiang等[10]用超聲波輔助酶解法從脫脂小麥胚芽蛋白中制備得到血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽，發(fā)現(xiàn)超聲波處理能促進(jìn)酶解過(guò)程中疏水氨基酸的釋放和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽的生成。帥希祥等[11]利用澳洲堅(jiān)果蛋白采用超聲波輔助酶解法制備得到具有較強(qiáng)活性的抗氧化肽，酶解時(shí)間明顯縮短。王軍等[12]也采用超聲波輔助酶解法從鯰魚(yú)中制備得到了具有較強(qiáng)抗脂質(zhì)過(guò)氧化和清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基能力的抗氧化肽。

胎盤(pán)又稱為“紫河車”，《本草綱目》記載：胎盤(pán)味甘咸，性溫，無(wú)毒，具有補(bǔ)血、補(bǔ)氣、益精、美顏之功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)胎盤(pán)富含免疫活性肽、激素、微量元素及多種功能因子，具有調(diào)節(jié)體內(nèi)激素水平、提高免疫、護(hù)肝、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老等作用[13]。其中，胎盤(pán)因子（胎盤(pán)肽）由核苷酸、肽類和各種氨基酸等小分子組合而成，已被證實(shí)是一種無(wú)毒、無(wú)抗原的免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)，在臨床保健、醫(yī)藥和生物制品領(lǐng)域已有應(yīng)用，尤其對(duì)病毒、免疫缺陷及惡性腫瘤等疾病具有良好效果[14-16]。但由于人胎盤(pán)資源短缺或倫理約束等因素，利用羊、鹿、牛等動(dòng)物胎盤(pán)水解制備具有特殊功能的生物活性肽逐漸成為關(guān)注熱點(diǎn)。特別是羊胎盤(pán)的營(yíng)養(yǎng)組成與人胎盤(pán)基本一致，合理的自然結(jié)構(gòu)和豐富的營(yíng)養(yǎng)成分使其成為動(dòng)物胎盤(pán)的首選。藏系綿羊是我國(guó)青藏高原寶貴的遺傳資源之一，分布在青海、甘南等高海拔寒旱地區(qū)，平均海拔4 km以上的世界屋脊孕育了獨(dú)特的藏系綿羊品質(zhì)，具有耐高寒、耐缺氧、適應(yīng)性強(qiáng)等特性[17]。藏醫(yī)學(xué)也認(rèn)為藏系綿羊胎盤(pán)具有極高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值，對(duì)人體保健與疾病治療具有積極功效，但其具體成分及其作用機(jī)理尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

本研究以藏系羊胎盤(pán)肽的制備和抗氧化能力分析為目標(biāo)，以水解度和肽得率為考察指標(biāo)，首先從木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶等6 種蛋白酶中篩選適宜的復(fù)合酶水解組合方案，并通過(guò)單因素和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)考察超聲波輔助酶法制備羊胎盤(pán)肽的工藝參數(shù)，探索不同酶解條件下羊胎盤(pán)肽的抗氧化活性差異，進(jìn)而對(duì)優(yōu)化條件下獲得的羊胎盤(pán)肽的分子質(zhì)量分布和氨基酸組成進(jìn)行分析，以期為藏系羊胎盤(pán)的開(kāi)發(fā)及在功能性食品中的應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藏系羊胎盤(pán)為蘭州名德農(nóng)牧科技有限公司提供。

木瓜蛋白酶（比活力80×104U/g）、菠蘿蛋白酶（比活力50×104U/g）、堿性蛋白酶（比活力2×104U/g）南寧龐博生物科技有限公司；胰蛋白酶（比活力25×104U/g）、動(dòng)物蛋白水解專用復(fù)合酶（比活力1.5×103U/g）、中性蛋白酶（比活力6×104U/g） 北京索萊寶科技有限公司；總抗氧化能力測(cè)試盒 南京建成生物工程研究所；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA25高剪切分散乳化機(jī) 上海弗盧克流體機(jī)械制造有限公司；L-550臺(tái)式低速離心機(jī) 湖南湘儀試驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司；SH220N石墨消解儀 山東海能科學(xué)儀器有限公司；K9840半自動(dòng)凱氏定氮儀 山東海能科學(xué)儀器有限公司；SpectraMax i3x酶標(biāo)儀 美谷分子儀器公司；Ag1100高效液相色譜儀 美國(guó)發(fā)捷倫公司；1525高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 羊胎盤(pán)原料的凈化與均質(zhì)

新鮮羊胎盤(pán)解凍后，用清水沖洗去除殘留血跡、塵沙等污物，然后瀝干羊胎盤(pán)表面水分，剪碎后進(jìn)行高剪切分散乳化，達(dá)到勻漿狀態(tài)后備用。經(jīng)測(cè)定，羊胎盤(pán)蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為87.59%（以干基計(jì)）。

1.3.2 羊胎盤(pán)的酶解方案篩選

以水解度和肽得率為指標(biāo)，結(jié)合色澤、渾濁度和腥味等感官品質(zhì)，從木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶等6 種蛋白酶中篩選適宜的水解酶，酶解條件統(tǒng)一設(shè)置為酶添加量4 000 U/g、酶解時(shí)間1 h。然后利用篩選出的單一蛋白酶進(jìn)行雙酶同步復(fù)合酶解實(shí)驗(yàn)，酶解結(jié)束后立即沸水浴10 min滅酶，快速冷卻至室溫后3 900 r/min離心20 min，取上清液于100 mL容量瓶中定容，用于測(cè)定總氮和氨態(tài)氮含量，通過(guò)計(jì)算肽得率、水解度和理論分子質(zhì)量，綜合考量確定適宜的蛋白酶組合方案。

1.3.3 超聲波預(yù)處理參數(shù)和酶解時(shí)間的單因素試驗(yàn)

在1.3.2節(jié)復(fù)合酶解方案確定的基礎(chǔ)上，首先對(duì)藏系羊胎盤(pán)進(jìn)行超聲波預(yù)處理，處理結(jié)束后進(jìn)入酶解反應(yīng)，研究各參數(shù)對(duì)水解效果的影響。以水解度和抗氧化能力為指標(biāo)，分別考察酶解時(shí)間（1、2、3、4、5、6 h）、超聲時(shí)間（5、10、15、20、25、30 min）、超聲溫度（25、30、35、40、45、50 ℃）、超聲功率（240、300、360、420、480、540 W）4 個(gè)因素對(duì)羊胎盤(pán)雙酶復(fù)合酶解效果的影響。

1.3.4 超聲波預(yù)處理參數(shù)和酶解時(shí)間的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

研究表明，水解度與肽得率、肽的分子質(zhì)量分布和抗氧化能力密切相關(guān)，其中水解度是決定活性肽制備效率和活性高低的關(guān)鍵指標(biāo)[18]。因此，在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以水解度為響應(yīng)值，在固定酶添加量等水解條件的前提下，優(yōu)化超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲功率、酶解時(shí)間4 個(gè)因素對(duì)羊胎盤(pán)肽制備效果的影響。根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理，采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行4因素5水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Variables and levels used for central composite design

1.3.5 酶解指標(biāo)測(cè)定

水解度參考Cui Chun等[19]方法，按式（1）計(jì)算，其中氨態(tài)氮測(cè)定采用甲醛滴定法，總氮測(cè)定采用微量凱氏定氮法；肽得率按照式（2）計(jì)算；平均理論分子質(zhì)量（mw）按式（3）計(jì)算[20-21]。

式中：N1為水解液中氨態(tài)氮含量/g；N為原料中總氮含量/g；N2為水解液中總氮含量/g；W為原料中總蛋白質(zhì)含量/g。

1.3.6 抗氧化能力分析

參照試劑盒說(shuō)明書(shū)中的2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）法，在405 nm波長(zhǎng)處可測(cè)定ABTS陽(yáng)離子自由基吸光度。6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）是一種VE類似物，具有和VE相近的抗氧化能力，以吸光度（y）和Trolox濃度（x）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=-0.862 3x+1.114 8，R2=0.993 9，從而確定羊胎盤(pán)肽的抗氧化能力，以Trolox當(dāng)量表示。

1.3.7 分子質(zhì)量分布的分析

利用高效液相色譜儀測(cè)定。色譜條件為：色譜柱TSKgel 2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）；流動(dòng)相：乙腈-水-三氟乙酸40∶60∶0.1（V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)：紫外220 nm；流速：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃。其中繪制分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線所選的標(biāo)準(zhǔn)品為：細(xì)胞色素C（mw=12 400 Da）；桿菌酶（mw=1 450 Da）；乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（mw=451 Da）；乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（mw=189 Da）。

1.3.8 氨基酸組成分析

采用高效液相色譜法，根據(jù)郭剛軍等[22]方法略作修改。

羊胎盤(pán)原料上柱前處理方法：準(zhǔn)確稱取100.00 mg左右原料置入水解管，然后加入8 mL 6 mol/L的HCl溶液，再用氮?dú)獬? min，調(diào)整流速使溶液呈沸騰狀態(tài)后擰緊水解管蓋，放入120 ℃烘箱中水解22 h，之后將水解管樣品全部轉(zhuǎn)移至容量瓶，加4.8 mL 10 mol/L NaOH溶液中和，蒸餾水定容至25 mL后用雙層濾紙過(guò)濾，取1 mL澄清液于1.5 mL離心管內(nèi)15 000 r/min離心30 min，最后取400 μL上清液于取液相樣品瓶，待測(cè)。

羊胎盤(pán)肽液上柱前處理方法：準(zhǔn)確量取1 mL肽液樣品，依次加入1 mL濃HCl和6 mL 6 mol/L HCl溶液，其余處理與羊胎盤(pán)原料處理方法相同。

色譜條件：O D S H Y P E R S I L色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：A相：8.0 g/L結(jié)晶乙酸鈉加入225 μL三乙胺和5 mL四氫呋喃，用5%醋酸溶液調(diào)pH 7.2；B相：8.0 g/L結(jié)晶乙酸鈉，用2%醋酸溶液調(diào)節(jié)pH 7.20，加入乙腈和甲醇各800 mL；流速：1.0 mL/min；紫外檢測(cè)器：338 nm，262 nm。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次平行，單因素試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS軟件進(jìn)行顯著性差異分析，采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 藏系羊胎盤(pán)原料的氨基酸組成分析

表2 藏系羊胎盤(pán)的氨基酸組成及其含量Table 2 Amino acid composition of TSPP

如表2所示，藏系羊胎盤(pán)中的蛋白質(zhì)高達(dá)80%以上，氨基酸總量為69.52%，主要包括Asp、Glu、Gly、Leu、Lys、Arg和Val等；其中Phe、Lys、Leu、Ile、Met、Val、Thr、His 8 種人體必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26.36%，必需氨基酸占總氨基酸的比值為37.92%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值達(dá)到61.08%。與其他來(lái)源羊胎盤(pán)相比，藏系羊胎盤(pán)中的Glu、Val、Met、Ile、Lys含量較高，其中Val、Met、Ile、Lys均為人體必需氨基酸。此外，藏系羊胎盤(pán)中還含有Glu、Gly、Leu、Arg等具有藥用價(jià)值的氨基酸[23]，并且Tyr、Met、Cys、His和Phe等氨基酸還與抗氧化能力密切相關(guān)[24]?？梢?jiàn)，藏系羊胎盤(pán)蘊(yùn)藏著良好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和抗氧化潛力。

2.2 復(fù)合酶解方案的確定

2.2.1 單酶篩選

有研究認(rèn)為N端氨基酸為強(qiáng)疏水性和弱帶電性氨基酸（如Ala、Gly、Val和Leu）、中心氨基酸為具有強(qiáng)氫鍵作用的氨基酸（如Arg、Lys、His）時(shí)，小分子肽（Leu-His-X、Pro-His-X等）能表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性[4]。不同來(lái)源蛋白酶的酶切位點(diǎn)不同，會(huì)導(dǎo)致酶解產(chǎn)物存在很大差異，故有必要對(duì)藏系羊胎盤(pán)原料篩選適宜的蛋白酶。

表3 不同種類蛋白酶的推薦條件和酶解效果比較Table 3 Comparison of hydrolysis efficiencies of different proteases under recommended conditions

如表3所示，6 種蛋白酶的單一酶解效果差異較大。就水解度而言，中性蛋白酶水解度最高（38.16%），堿性蛋白酶和動(dòng)物蛋白水解復(fù)合酶次之，胰蛋白酶最低（21.68%）。因?yàn)橐鹊鞍酌甘且环NSer內(nèi)切蛋白酶，僅能水解R1為Arg或Lys殘基側(cè)鏈的肽鍵，當(dāng)提供肽鍵的氨基酸為Pro時(shí)水解受阻，而藏系羊胎盤(pán)中含量相對(duì)較高的Pro可能會(huì)對(duì)酶解反應(yīng)形成阻礙作用[27]。從肽得率角度看，中性蛋白酶的肽得率最高（10.55%），其次為菠蘿蛋白酶和動(dòng)物蛋白水解復(fù)合酶，胰蛋白酶的肽得率仍為最低（7.35%），且理論分子質(zhì)量最高。另一方面，由于堿性蛋白酶具有一定特異性，能作用于Ala、Phe、Leu和Ile參與形成的多種肽鍵[21]，故水解度和肽得率相對(duì)較高，但水解液的腥味較重，因此胰蛋白酶和堿性蛋白酶予以排除。

另外，龐博公司生產(chǎn)的動(dòng)物蛋白水解復(fù)合酶是一種復(fù)合內(nèi)切酶，其酶切位點(diǎn)為Ala-、Leu-、Val-和Tyr-，而藏系羊胎盤(pán)中的這些氨基酸含量較高，故水解較為充分，水解度和肽得率相對(duì)較高，所得肽的理論分子質(zhì)量?jī)H330 Da左右。木瓜蛋白酶具有廣泛特異性，酶切位點(diǎn)主要為Arg-、Lys-、Phe-和X-，能獲得較高的水解度和肽得率[28]。菠蘿蛋白酶屬無(wú)特異性蛋白酶，所制得的水解液呈淺黃色、腥味較輕，且酶解條件為中性，操作簡(jiǎn)便。綜合考慮，從6 種蛋白酶中選擇木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶和動(dòng)物水解復(fù)合酶進(jìn)行后續(xù)的雙酶復(fù)合酶解實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步篩選適宜的復(fù)合酶解方案。

2.2.2 雙酶復(fù)合水解的組合方案篩選

由于蛋白酶對(duì)肽鍵作用具有一定專一性，單一蛋白酶水解時(shí)只能從某幾個(gè)固定的氨基酸殘基進(jìn)行水解，水解程度有限；復(fù)合酶解法能強(qiáng)化水解度，得到更低分子質(zhì)量的水解產(chǎn)物[29]。如圖1所示，不同蛋白酶復(fù)合酶解的水解度和肽得率有顯著性差異（P＜0.05）。其中菠蘿蛋白酶和中性蛋白酶均為無(wú)特異性蛋白酶，故菠+中組合的水解度（19.61%）顯著低于其他5 種方案（P＜0.05），木+中組合的水解度最高達(dá)到37.24%。另一方面，木+中組合的肽得率最高，動(dòng)+中組合次之，較單一蛋白酶的水解效果均得到大幅提升，但由于動(dòng)+中組合得到的水解液呈深棕色且有一定腥味，故予以排除。

圖1 不同雙酶組合方案時(shí)的水解度和肽得率Fig. 1 DH and peptide yields with different enzyme combinations

圖2 不同雙酶組合方案時(shí)的抗氧化活性Fig. 2 Antioxidant activities of hydrolysates prepared with different enzyme combinations

結(jié)合圖2抗氧化能力分析，木+中組合的抗氧化能力（0.91 mmol/L）顯著高于其他4 種組合（P＜0.05），且水解液澄清、呈亮黃色狀態(tài)，此時(shí)水解度與肽得率分別為37.24%和13.54%。該結(jié)果與劉建偉等[30]研究報(bào)道一致。木瓜蛋白酶能有效水解羊胎盤(pán)中的Arg、Lys、Phe等肽鍵，生成小分子多肽；中性蛋白酶的酶切位點(diǎn)廣泛，二者酶解過(guò)程中形成良好的協(xié)同作用，使得具有抗氧化能力的氨基酸殘基以及肽鏈暴露在外，大大增強(qiáng)了其抗氧化能力。綜合水解度、肽得率和抗氧化能力3 個(gè)指標(biāo)評(píng)判，木+中組合的酶解效果較好，故選擇該組合進(jìn)行后續(xù)的超聲波輔助酶解試驗(yàn)。

2.3 超聲波輔助雙酶法制備羊胎盤(pán)肽的工藝優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖3可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度和抗氧化能力均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，酶解第5小時(shí)的水解度高達(dá)51.14%，酶解4 h的抗氧化能力最高達(dá)到0.51 mmol/L。在酶解初始階段（1～4 h），底物濃度相對(duì)較高，酶作用使底物蛋白迅速降解為肽片段，水解度逐漸升高，平均肽鏈長(zhǎng)度隨之下降，抗氧化能力亦逐漸增強(qiáng)。但隨著反應(yīng)的進(jìn)行（4～5 h），當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)水解為多肽的速度小于多肽水解為氨基酸的速度時(shí)，游離氨基酸增多，水解度達(dá)到峰值；但同時(shí)會(huì)導(dǎo)致與抗氧化能力相關(guān)的多肽結(jié)構(gòu)序列發(fā)生變化，使肽產(chǎn)物的抗氧化能力快速下降。隨著底物被逐漸消耗（5～6 h），底物蛋白與酶的接觸機(jī)率大幅下降以及可供酶切的位點(diǎn)減少導(dǎo)致水解反應(yīng)放緩[31]，水解度快速下降，這與許英一等[32]研究結(jié)果一致。因此，為獲得抗氧化能力較強(qiáng)的酶解產(chǎn)物，必須嚴(yán)格控制酶解程度。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)水解度和抗氧化能力的影響Fig. 3 Effect of enzymolysis times on degree of hydrolysis and antioxidant activity hydrolysis

圖4 超聲功率對(duì)水解度和抗氧化能力的影響Fig. 4 Effect of ultrasonic power on DH and antioxidant activity and antioxidant capacity

由圖4可知，水解度和抗氧化能力隨著超聲功率的上升亦呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)，當(dāng)功率為420 W和360 W時(shí)二者達(dá)到最高值，分別為48.07%和0.98 mmol/L。當(dāng)超聲波與酶解反應(yīng)偶合時(shí)，超聲作用能使底物蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，增加底物與蛋白酶的結(jié)合位點(diǎn)，有效提高酶解效果，使肽鍵斷裂，水解度增強(qiáng)；同時(shí)使具有抗氧化能力的肽片段增加，在超聲功率為360 W時(shí)表現(xiàn)出最高的抗氧化能力。當(dāng)超聲功率繼續(xù)增至420 W時(shí)，超聲能量的釋放加速了介質(zhì)中的質(zhì)量傳遞作用，有效促進(jìn)反應(yīng)體系的傳質(zhì)進(jìn)程，使水解度達(dá)到最高值。但隨著超聲功率的繼續(xù)增加（＞420 W），超聲空化效應(yīng)會(huì)破壞蛋白分子構(gòu)象，導(dǎo)致酶活性下降，水解度和抗氧化能力均迅速降低[12]，這與藍(lán)尉冰等[33]研究結(jié)果一致?？梢?jiàn)，適宜的超聲功率有利于發(fā)揮酶解作用，使羊胎盤(pán)肽表現(xiàn)出良好的抗氧化能力。

隨著超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)，整個(gè)酶解反應(yīng)體系更趨于均勻，底物蛋白的空間構(gòu)象發(fā)生積極變化，埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的酶切位點(diǎn)暴露，促進(jìn)底物與酶結(jié)合[34]，從而使水解度和抗氧化能力均逐漸增大，反應(yīng)趨于完全。由圖5可知，當(dāng)超聲處理第15分鐘時(shí)抗氧化能力出現(xiàn)峰值0.63 mmol/L，處理第20分鐘時(shí)水解度達(dá)到最高值52.15%。但過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的超聲處理會(huì)產(chǎn)生熱效應(yīng)和剪切力，不僅會(huì)使部分底物蛋白的活性部位遭受破壞，也會(huì)使酶解反應(yīng)體系的溫度隨之升高，超過(guò)酶的最適反應(yīng)溫度從而抑制酶活力，導(dǎo)致酶解反應(yīng)速率下降。另一方面，過(guò)量的超聲能量釋放會(huì)使肽片段降解為游離氨基酸，從而失去抗氧化能力。因此，初步確定超聲波處理時(shí)間為15～20 min。

圖5 超聲時(shí)間對(duì)水解度和抗氧化能力的影響Fig. 5 Effect of ultrasonic times on the degree of hydrolysis and antioxidant capacity

圖6 超聲溫度對(duì)水解度和抗氧化能力的影響Fig. 6 Effect of ultrasonic temperatures on the degree of hydrolysis and antioxidant capacity

由圖6可知，當(dāng)超聲溫度為35 ℃和30 ℃時(shí)，水解度和抗氧化能力達(dá)到最高值。超聲波是一種具有加熱和空化效應(yīng)的能量輻照，對(duì)酶解反應(yīng)可產(chǎn)生促進(jìn)和抑制的雙重效果。在適宜溫度范圍內(nèi)（＜30 ℃），加熱效應(yīng)占主導(dǎo)，超聲場(chǎng)下的酶解反應(yīng)體系吸回能量后加速了底物蛋白和酶作用位點(diǎn)的釋放，促進(jìn)水解反應(yīng)進(jìn)程，使活性肽片段暴露，抗氧化能力升高。當(dāng)超聲溫度繼續(xù)升高，則會(huì)使游離氨基酸增多，抗氧化能力開(kāi)始下降，而水解度則繼續(xù)升高達(dá)到最大值43.5%。但溫度高于35 ℃后，超聲空化效應(yīng)產(chǎn)生的自由基會(huì)對(duì)酶活中心形成破壞作用，導(dǎo)致酶活性降低，使得酶解反應(yīng)速率下降，水解度降低[35]。

另外，超聲功率、溫度和時(shí)間等因素對(duì)水解度、抗氧化能力的影響呈高度相關(guān)性，且抗氧化能力隨反應(yīng)體系的因素變化敏感性較高，均先于水解度發(fā)生變化，原因可能是抗氧化能力的高低與平均肽鏈長(zhǎng)度、產(chǎn)物的末端氨基酸殘基、分子質(zhì)量等肽的微分子結(jié)構(gòu)關(guān)系密切，這一點(diǎn)在趙婕媛等[36]研究結(jié)果中得到證實(shí)。

2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

采用Design-Expert8.0.6軟件，在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以水解度為指標(biāo)，進(jìn)行4因素5水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，共計(jì)30 組，設(shè)計(jì)方案及結(jié)果如表4所示。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Experimental design and results for response surface analysis

2.3.2.2 模型方程的建立及顯著性分析

Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行多元回歸擬合得到回歸方程：水解度＝55.39+0.16A-0.20B+0.061C+1.90D+2.42AB-2.68AC-2.33AD+2.71BC+0.53BD+2.42CD-4.77A2-3.27B2-2.28C2-4.71D2。式中各項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值表示單因素對(duì)水解度參數(shù)的影響程度，正負(fù)反映影響方方。

由表5可知，水解度的回歸模型極顯著（P＜0.001）；失擬項(xiàng)中F值為1.54，P＝0.332 2＞0.05，不顯著，表明模型擬合度良好，能較好解釋響應(yīng)中的變異。模型的回歸系數(shù)R2為0.952 2，說(shuō)明此方程對(duì)試驗(yàn)擬合度結(jié)果比較好，誤差??；R2Adj為0.907 6，說(shuō)明該模型能解釋90.76%響應(yīng)值的變化，能很好預(yù)測(cè)超聲波輔助酶解制備羊胎盤(pán)肽的工藝參數(shù)。另一方面，該模型中回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)顯示，一次項(xiàng)D，交互項(xiàng)AB、AD和CD對(duì)水解度的影響高度顯著（P＜0.01）；二次項(xiàng)A2、B2、C2和D2，交互項(xiàng)AC和BC對(duì)水解度的影響極顯著（P＜0.001）。比較4 個(gè)因素的F值大小可知，影響因素的主次順序依次為：超聲時(shí)間＞超聲溫度＞酶解時(shí)間＞超聲功率。

表5 水解度回歸模型的方差分析Table 5 Analysis of variance of regression model for DH

2.3.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析

圖7 各因素交互作用對(duì)水解度影響的響應(yīng)面圖Fig. 7 Response surface plots showing the effect of interaction among various factors on DH

如圖7所示，隨著各因素水平的升高，水解度均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。圖7a、b、c顯示，沿D因素軸方方的響應(yīng)面坡度明顯比較陡峭，說(shuō)明超聲時(shí)間對(duì)水解度變化的影響較超聲溫度、超聲功率和酶解時(shí)間大。另一方面，等高線是響應(yīng)面在水平方方的投影，橢圓等高線表示兩因素交互作用顯著，圓形等高線表示兩因素交互作用不顯著[37]。圖7中6 組交互作用的等高線圖顯示，超聲溫度與超聲功率、酶解時(shí)間與超聲功率之間的交互作用最強(qiáng)，等高線均為橢圓形；其次是超聲功率與超聲時(shí)間、超聲時(shí)間與酶解時(shí)間、超聲溫度與酶解時(shí)間；超聲時(shí)間與超聲溫度二者的交互作用最弱，等高線為圓形，再次驗(yàn)證了單因素與交互項(xiàng)對(duì)水解度影響的主次順序，且與表4中顯著性檢驗(yàn)結(jié)果一致。

2.3.3 最佳酶解工藝參數(shù)的確定

Design-Expert 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)的優(yōu)化結(jié)果為超聲溫度25.36 ℃、超聲時(shí)間16.56 min、超聲功率437.65 W、酶解時(shí)間4.88 h，該最優(yōu)條件下的水解度預(yù)測(cè)值為55.67%。采用優(yōu)化后的參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，為方便操作，條件設(shè)為超聲溫度25.5 ℃、超聲時(shí)間16.5 min、超聲功率438 W、酶解時(shí)間4.9 h，經(jīng)5 次平行實(shí)驗(yàn)后測(cè)得酶解液的水解度為（55.22±0.12）%，與模型預(yù)測(cè)值55.67%無(wú)明顯差異；肽得率為15.52%；抗氧化能力為1.08 mmol/L，說(shuō)明擬合模型優(yōu)化出的酶解參數(shù)較為準(zhǔn)確。

2.4 藏系羊胎盤(pán)肽的氨基酸組成和分子質(zhì)量分布

圖8 羊胎盤(pán)肽液分子質(zhì)量分布色譜圖Fig. 8 Chromatogram of peptides in TSPP hydrolysate

肽片段長(zhǎng)短與抗氧化能力高低密切相關(guān)，肽片段過(guò)長(zhǎng)（超過(guò)20 個(gè)氨基酸）則結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜，具有抗氧化能力的氨基酸殘基可能被包埋其中，導(dǎo)致無(wú)法發(fā)揮功能活性；適宜長(zhǎng)度的肽片段能表現(xiàn)出良好功能活性[38]。含有2～9 個(gè)氨基酸（分子質(zhì)量500～2 500 Da）的寡肽比大分子蛋白質(zhì)和多肽具有更強(qiáng)的抗氧化能力，二肽或三肽（200～500 Da）與單個(gè)氨基酸相比也表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力[4]。結(jié)合圖8和表6可知，羊胎盤(pán)經(jīng)超聲波輔助酶解后得到的絕大多數(shù)肽為小分子低聚寡肽物質(zhì)，其中分子質(zhì)量低于2 000 Da的肽占95.02%，分子質(zhì)量低于1 000 Da的肽占89.04%，分子質(zhì)量低于500 Da的肽占74.99%。由于小分子低聚寡肽易被人體吸回，能直接參與組織蛋白質(zhì)合成代謝，具有吸回快、功能活性良好等特點(diǎn)，故推測(cè)藏系羊胎盤(pán)肽表現(xiàn)出的抗氧化能力與其較低的肽分子質(zhì)量分布有關(guān)系，不同分子質(zhì)量段位肽片段對(duì)應(yīng)的抗氧化能力需進(jìn)一步深入研究。

另一方面，肽的抗氧化能力在很大程度上取決于氨基酸組成及其序列順序結(jié)構(gòu)。由表7可知，藏系羊胎盤(pán)肽中的酸性氨基酸Glu含量最高，因其側(cè)鏈有氨基或羧基而具有螯合金屬離子和作為質(zhì)子供體的能力，對(duì)肽的抗氧化能力表現(xiàn)有一定貢獻(xiàn)[39]。Zhuang Yufeng等[40]用堿性蛋白酶和中性蛋白酶復(fù)合水解羅非魚(yú)魚(yú)皮，得到N端為Glu的三肽（Glu-Gly-Leu）具有強(qiáng)抗氧化能力。除Glu外，藏系羊胎盤(pán)肽中的Gly和Asp含量也相對(duì)較高，Asp也是酸性氨基酸，Gly的R基為氫原子，能通過(guò)與自由基結(jié)合進(jìn)而增強(qiáng)肽的抗氧化能力。此外，藏系羊胎盤(pán)肽中還包含一定量Leu、Ala、Pro和Val等氨基酸，這些氨基酸在文獻(xiàn)報(bào)道的抗氧化肽序列中多有出現(xiàn)。Huang Yipeng等[41]酶解馬鮫魚(yú)得到了Ser-Lys-Lys-Gly-Leu、Gln-Ala-Pro-Leu-Asn-Pro-Lys-Ala等8 種抗氧化肽。Kou Xiaohong等[42]酶解鷹嘴豆蛋白得到序列為Arg-Gln-Ser-His-Phe-Ala-Asn-Ala-Gln-Pro的抗氧化肽。Lee等[43]從鴨皮副產(chǎn)物中得到具有抗氧化能力的八肽His-Thr-Val-Gln-Cys-Met-Phe-Gln。由此推斷，藏系羊胎盤(pán)肽表現(xiàn)出的較強(qiáng)抗氧化能力與其氨基酸組成密不可分。下一步，課題組將繼續(xù)從肽片段分離純化和化學(xué)結(jié)構(gòu)等角度分析其氨基酸序列，進(jìn)而精準(zhǔn)確定羊胎盤(pán)肽的抗氧化構(gòu)效關(guān)系。

表7 藏系羊胎盤(pán)肽的氨基酸組成Table 7 Amino acid composition of peptides from TSPP hydrolysate

3 結(jié) 論

通過(guò)比較分析單一蛋白酶和復(fù)合蛋白酶的酶解方案，篩選得到木瓜蛋白酶和中性蛋白酶同步復(fù)合酶解的作用效果最好。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得到超聲波輔助復(fù)合酶解制備藏系羊胎盤(pán)肽的最佳條件為酶解時(shí)間4.9 h，超聲溫度25.5 ℃、超聲時(shí)間16.5 min、超聲功率438 W，該條件下水解度達(dá)55.22%，肽得率為18.52%，抗氧化能力為1.08 mmol/L。制備得到的羊胎盤(pán)肽中分子質(zhì)量低于2 000 Da的肽占比為95.02%，絕大多數(shù)為小分子低聚寡肽，而且藏系羊胎盤(pán)肽中富含有Glu、Gly、Asp等氨基酸，使其具有良好抗氧化能力。本研究為藏系綿羊胎盤(pán)制備抗氧化肽的工業(yè)化生產(chǎn)提供了技術(shù)參考，也為肽的分離純化和氨基酸序列結(jié)構(gòu)分析奠定了理論基礎(chǔ)。