常柳依，莊晶云，孟 菲，王 純，沈照鵬*，江曉路,3,*

（1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2.中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，山東 青島 266003；3.青島海洋生物醫(yī)藥研究院，山東 青島 266071）

作為一種功能性食品，益生菌產(chǎn)品具有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用。根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織（FAO/WHO）的定義，益生菌是活的微生物，當(dāng)攝取足量時(shí)可對宿主的健康帶來益處[1-2]。雙歧桿菌是一種嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陽性菌，其菌體數(shù)量會在生產(chǎn)加工處理和通過胃腸道的過程中大量減少，瑞士和國際乳聯(lián)標(biāo)準(zhǔn)化委員會規(guī)定益生菌產(chǎn)品中雙歧桿菌的活菌數(shù)需大于106CFU/g或106CFU/mL[3]，因此為雙歧桿菌提供保護(hù)以抵御不利環(huán)境十分必要。微囊化技術(shù)可以通過一定的理化手段將益生菌包裹在微小且封閉的膠囊中，不僅能在加工或貯藏過程中提高益生菌的有效活菌數(shù)，還能在通過胃腸道期間對益生菌進(jìn)行保護(hù)，使其以較少的活性損失到達(dá)腸道靶位點(diǎn)[4]。由于Ca2+-藻酸鹽凝膠的發(fā)全和無毒性質(zhì)，它是最常用的微囊化壁材[5]。

Ca2+-藻酸鹽微膠囊的多孔性會導(dǎo)致消化液或氧滲入微膠囊內(nèi)部，從而造成益生菌的活性損失。殼聚糖作為一種無毒無害的陽離子材料通常用于涂覆藻酸鹽微膠囊，為益生菌提供更好的保護(hù)[6]。然而殼聚糖（平均分子質(zhì)量高于10 000 Da）完全溶解所需要的低pH值環(huán)境[7]可能會降低益生菌的活性[6]。與長鏈的殼聚糖相比，帶正電的短鏈殼寡糖（chitosan-oligosaccharides，COS）在中性環(huán)境中具有更好的水溶性。此外，COS可以作為益生元促進(jìn)雙歧桿菌和乳酸菌的生長，并具有調(diào)節(jié)腸道菌群和減輕結(jié)腸炎的作用[8-9]。因此認(rèn)為具有COS涂層的益生菌微膠囊具有兩種性質(zhì)：作為包衣材料，增強(qiáng)微膠囊對益生菌的保護(hù)作用；作為益生元，當(dāng)益生菌在腸中釋放時(shí)促進(jìn)益生菌的生長。雖然有報(bào)道顯示具有COS涂層的藻酸鹽微膠囊具有良好的生物相容性、良好的機(jī)械穩(wěn)定性、無毒性和生物可降解性[10]，但目前這種微膠囊很少用于益生菌的包埋。

除用陽離子材料涂覆于微膠囊表面，將益生元添加于微膠囊的藻酸鹽壁材中也被認(rèn)為是改善產(chǎn)品中益生菌細(xì)胞活力的有效方法：在體外模擬胃腸液處理或在一定條件下貯藏一段時(shí)間后，與益生元共同包封可以使益生菌具有更高的活性[11-12]。目前，通常用于這種共包封微膠囊的益生元包括果寡糖、菊粉、低聚半乳糖等。藻酸鹽寡糖（alginate-oligosaccharides，AOS）是通過酶水解藻酸鹽獲得的海洋寡糖，對動物消化道酶具有高度抗性，可作為益生元促進(jìn)雙歧桿菌和乳酸桿菌的生長。對于包括長雙歧桿菌在內(nèi)的部分益生菌，AOS的益生元作用甚至優(yōu)于常用的益生元果寡糖[13]。因此，AOS被認(rèn)為是一種可用作益生菌和益生元共包封微膠囊的優(yōu)質(zhì)益生元。

為探究海洋寡糖微膠囊對益生菌的保護(hù)作用，以及在實(shí)際應(yīng)用中的價(jià)值，制備包埋長雙歧桿菌CICC6259的基礎(chǔ)微膠囊。將基礎(chǔ)微膠囊外包COS，或添加AOS且外包COS分別制備兩種海洋寡糖長雙歧桿菌微膠囊：COS-微膠囊和AOS-COS-微膠囊。通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究這些海洋寡糖益生菌微膠囊對長雙歧桿菌的保護(hù)作用，并通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究其對小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，以期為新型益生菌微膠囊的研發(fā)和體內(nèi)體外評估提供參考與指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長雙歧桿菌CICC6259購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，分離自樂賽牌益生菌膠囊；MRS培養(yǎng)基青島海博生物技術(shù)有限公司；海藻酸鈉（黏度500 mPa·s，食品級） 青島明月海藻集團(tuán)有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶 美國Sigma公司；膽鹽 天津市博迪化工有限公司；殼寡糖（脫乙酰度90%，分子質(zhì)量＜1 500 Da，純度＞90%） 青島博智匯力生物科技有限公司；飼料 南通特洛菲飼料科技有限公司；AxyPrepDNA凝膠回回試劑盒 美國AXYGEN公司；TaqDNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、熱啟動SYBR Green實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chainreaction，PCR）預(yù)混液、Stool DNA Kit糞便基因組DNA提取試劑盒、Bacterial DNA 96 Kit細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、Gel Extraction Kit切膠回回試劑盒美國Omega BioTek公司；藻酸鹽寡糖（以三糖和四糖為主）由本實(shí)驗(yàn)室自制；其他試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SK-1型快速混勻儀 常州精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；YQX-II型厭氧培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申發(fā)醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1D超凈工作臺 蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司；ST16R高速冷凍大容量離心機(jī)、Multiskan Sky全波長酶標(biāo)儀、UVP凝膠成像系統(tǒng) 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；ME203E/02型電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；BX51光學(xué)顯微鏡奧林巴斯（中國）有限公司；7900HT熒光定量PCR儀美國Applied Biosystems公司；PowerPac Basic電泳儀美國Bio-Rad公司；P330微量蛋白核酸分析儀 德國Implen公司。

1.3 方法

1.3.1 主要溶液的配制

解囊液：將NaHCO3溶于0.1 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）中（NaHCO3的終濃度為0.2 mol/L），過濾除菌。

模擬胃液[6]：用濃鹽酸將2 mg/mLNaCl溶液的pH值調(diào)至2.0，再加入胃蛋白酶并使最終質(zhì)量濃度達(dá)到0.3 g/L，過濾除菌。

食管到胃連續(xù)過程的模擬液[14]：將5 mg/mL的胃蛋白酶溶于MRS肉湯中，分別將pH值調(diào)節(jié)至5.5、4.6、3.8、2.8、2.3、2.0，過濾除菌。

十二指腸模擬液[14]：將10 mg/mL的胰蛋白酶和3 mg/mL的膽鹽分別溶于MRS肉湯中，將pH值調(diào)節(jié)至5.0，過濾除菌。

小腸模擬液[14]：用0.1 mol/L的NaHCO3溶液將上述十二指腸模擬液的pH值調(diào)節(jié)至6.5，過濾除菌。

1.3.2 菌體的活化與培養(yǎng)

將長雙歧桿菌CICC6259按1∶10（V/V）的接種量接種于無菌MRS肉湯中，于37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)24 h?；罨? 次后，按1∶10（V/V）的接種量接種于無菌MRS肉湯中，于37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)24 h。4 000 r/min離心5 min回集菌體，用無菌生理鹽水（0.85% NaCl）洗滌2 次并重懸后，將濃縮菌液的濃度調(diào)節(jié)至1010CFU/mL。

1.3.3 基礎(chǔ)微膠囊的制備

采用外源乳化法[15]制備基礎(chǔ)微膠囊。將濃縮菌液、無菌海藻酸鈉溶液（30 mg/mL）和含有（2μL/mL）吐溫80的無菌玉米胚芽油以2∶3∶25（V/V）的比例混合。200 r/min磁力攪拌5 min將混合物（總體積50 mL）乳化。方乳化液中迅速加入100 mL無菌CaCl2溶液（20 mg/mL），繼續(xù)攪拌30 min。2 000 r/min離心5 min回集微膠囊，在4 ℃用體積分?jǐn)?shù)0.1%無菌蛋白胨溶液洗滌2 次以除去過量的鈣離子和未被包裹的益生菌，然后用無菌生理鹽水洗滌。

1.3.4 具有COS包衣的微膠囊（COS-微膠囊）的制備

基于Zou Qiang等[6]的殼聚糖包衣方法，采用兩步法制備COS包衣的微膠囊。將0.5 g COS溶解于90 mL蒸餾水中，用0.1 mol/L的NaOH溶液將pH值調(diào)節(jié)至7.0，再用蒸餾水將溶液的總體積調(diào)節(jié)至100 mL，得到5 mg/mL的COS溶液。將10 g基礎(chǔ)微膠囊浸入100 mL過濾除菌的5 mg/mL COS溶液中，用磁力攪拌器100 r/min攪拌20 min進(jìn)行涂覆。過濾回集微膠囊。

1.3.5 添加AOS且具有COS包衣的微膠囊（AOS-COS-微膠囊）的制備

在Krasaekoopt等[16]方法基礎(chǔ)上，稍作修改。將滅菌的AOS溶解于1.3.2節(jié)的濃縮菌液中，使AOS在菌液中的質(zhì)量濃度達(dá)到12.5 mg/mL，微膠囊的制備方法與1.3.3節(jié)相同。最終微膠囊中AOS的質(zhì)量濃度為5 mg/mL。COS包衣的方法與1.3.4節(jié)相同。過濾回集微膠囊。

1.3.6 微膠囊包埋的活菌數(shù)及包埋率的測定

準(zhǔn)確稱取3 種濕微膠囊樣品各1 g，加入9 mL解囊液中，振搖10 min至完全解囊。將混合液梯度稀釋后涂布于MRS瓊脂上，37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h并計(jì)數(shù)。微膠囊的包埋率按照式（1）計(jì)算[6]：

式中：N為包埋于微膠囊中的活菌總數(shù)；N0為制備微膠囊時(shí)濃縮菌液中的活菌總數(shù)。

1.3.7 長雙歧桿菌的體外耐胃酸實(shí)驗(yàn)

分別取3 種微膠囊各1 g，或菌液1 mL，置于在37 ℃預(yù)熱的9 mL模擬胃液中，于37 ℃、100 r/min的搖床中溫育2 h。在5、30、60、120 min時(shí)，取微膠囊或菌液與模擬胃液的均勻混合物各1 mL，加入9 mL解囊液中，振搖10 min至完全解囊。將混合液梯度稀釋后涂布于MRS瓊脂上，37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h并計(jì)數(shù)。

1.3.8 長雙歧桿菌在模擬消化道體系中的存活實(shí)驗(yàn)及微膠囊的崩解實(shí)驗(yàn)

參照李軍等[14]的模擬消化道體系。分別取3 種微膠囊各1 g或菌液1 mL，置于在37 ℃預(yù)熱的9 mL模擬消化液中，于37 ℃、100 r/min的搖床中溫育。每次更換模擬消化液前，以8 000 r/min離心1 min沉淀菌體和微膠囊，再用移液器將上清液小心地吸出。每次更換模擬消化液后，渦旋30 s以充分混合。處理步驟如表1所示。

分別在食管到胃的模擬液、十二指腸模擬液和小腸模擬液處理后，取微膠囊或菌液與模擬消化液的均勻混合物各1 mL，加入9 mL解囊液中，振搖10 min至完全解囊。將混合液梯度稀釋后涂布于MRS瓊脂上，37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h并計(jì)數(shù)。

表1 模擬消化道體系的處理步驟Table 1 Processing steps in simulated digestive system

微膠囊在模擬消化道體系中的崩解實(shí)驗(yàn)參照Annan等[17]方法：每隔5 min取微膠囊與模擬消化液的均勻混合物，于光學(xué)顯微鏡下觀察，記錄微膠囊的崩解時(shí)間。

1.3.9 長雙歧桿菌CICC6259在4 ℃貯藏穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

在Zou Qiang等[6]方法基礎(chǔ)上，稍作修改。每種膠囊各取1 g置于無菌玻璃葡萄糖瓶中，用膠塞和鋁蓋封口，貯藏于4 ℃。分別于第7、14、21、28天取出，添加9 mL解囊液，振搖10 min至完全解囊，計(jì)數(shù)方法見1.3.6節(jié)。

1.3.10 COS涂層的益生元效應(yīng)驗(yàn)證

為確保長雙歧桿菌含量大致相同，準(zhǔn)確稱量（0.200 0±0.000 5）g的基礎(chǔ)微膠囊，分別浸入2 mL不同質(zhì)量濃度（1、3、5 mg/mL）的COS溶液中，涂覆方法見1.3.4節(jié)。過濾回集微膠囊，并加入1.8 mL無菌解囊液充分混合10 min，使微膠囊完全液化。取1 mL液化液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，方法見1.3.6節(jié)。另取1 mL液化液全部注入50 mL MRS肉湯中，37 ℃厭氧培養(yǎng)40 h。每小時(shí)取培養(yǎng)液，稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)后，在96 孔板中用酶標(biāo)儀在600 nm波長處測量細(xì)菌的光密度。

1.3.11 動物分組及處理方案

1.3.1 1.1 微膠囊在體內(nèi)的解囊效果實(shí)驗(yàn)

參照Würth等[18]方法，將8 周齡健康成年雌性SPF小鼠（未禁食）分別用3 種新鮮微膠囊的懸浮液灌胃（微膠囊用量200 mg/只），于灌胃后5 min和1、3、5、7 h處死小鼠?？v方剖開小鼠的胃、小腸、盲腸和結(jié)腸，各取內(nèi)容物0.1 g加入0.9 mL無菌生理鹽水渦旋均勻。用篩絹濾去毛發(fā)和食物殘?jiān)却箢w粒雜質(zhì)，然后用顯微鏡分析微膠囊的存在與否。

1.3.1 1.2 微膠囊對小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用實(shí)驗(yàn)

在Kushal等[19]方法基礎(chǔ)上，稍作修改。將60 只8 周齡健康成年雌性SPF小鼠隨機(jī)分成5 組，每組12 只。所有小鼠均可自由獲取水和正常飼料。用生理鹽將游離的長雙歧桿洗滌并菌重懸，調(diào)節(jié)菌濃度至109CFU /mL。經(jīng)體外計(jì)數(shù)，基礎(chǔ)微膠囊、COS-微膠囊和AOS-COS-微膠囊中包埋的長雙歧桿菌數(shù)均約為109.5CFU/g，加入或外包海洋寡糖不影響包埋產(chǎn)率。將3 種微膠囊各3 g分別懸浮于10 mL無菌生理鹽水中，得到的微膠囊懸浮液中長雙歧桿菌的濃度約為109CFU/mL。每天早晨對每只小鼠進(jìn)行稱質(zhì)量并灌胃，每日灌胃菌液或微膠囊懸浮液的體積約為小鼠當(dāng)天體質(zhì)量的1/100。第1組（空白對照組）灌胃無菌生理鹽水；第2組（陽性對照組）灌胃長雙歧桿菌菌液；第3組（基礎(chǔ)微膠囊實(shí)驗(yàn)組）灌胃基礎(chǔ)微膠囊懸浮液；第4組（COS-微膠囊實(shí)驗(yàn)組）灌胃COS-微膠囊懸浮液；第5組（AOS-COS-微膠囊實(shí)驗(yàn)組）灌胃AOS-COS-微膠囊懸浮液。灌胃持續(xù)21 d，在最后一次灌胃后24 h（使未定植于小鼠腸道或已失活的長雙歧桿菌被小鼠排出體外）處死小鼠，取結(jié)腸內(nèi)容物。

1.3.12 小鼠腸道菌群分析

從每組中隨機(jī)各選擇3 只小鼠結(jié)腸內(nèi)容物樣本各0.1 g，于0.9 mL PBS（0.1 mol/L，pH 7.0）中渦旋至均勻。濾去食物殘?jiān)懊l(fā)等大顆粒雜質(zhì)，將溶液梯度稀釋后涂布于莫匹羅星鋰鹽改良MRS瓊脂上，37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h并計(jì)數(shù)。

從每組中隨機(jī)各選擇3只小鼠結(jié)腸內(nèi)容物樣本，干冰條件下送往北京奧維森基因科技有限公司。完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。針對16S V3-V4區(qū)域合成帶有barcode的特異引物。采用TransGen AP221-02：TransStart FastpfuDNA Polymerase對基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣本3 個(gè)重復(fù)，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回回試劑盒切膠回回PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫。采用Illumina MiSeq測序技術(shù)進(jìn)行測序。原始數(shù)據(jù)下機(jī)后，對測得的PE reads進(jìn)行質(zhì)控和過濾，然后根據(jù)PE測序的overlap關(guān)系將成對的序列拼接成一條序列。用Qiime Version 1.8將97%的相似水平下的序列劃分為一個(gè)可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），進(jìn)行α多樣性分析及菌群構(gòu)成分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Origin8.6作圖。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，使用SPSS 22.0通過One-way ANOVA分析數(shù)據(jù)并表示為 ±s。P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 微膠囊包埋的活菌數(shù)及包埋率

圖1 微膠囊中包埋的活菌數(shù)及包埋率Fig. 1 Viable cell count and microencapsulation efficiency of microcapsules

如圖1所示，3 種長雙歧桿菌微膠囊的包埋率在67%～72%之間，包埋活菌數(shù)在9.2～9.8（lg（CFU/g））之間。3 種微膠囊包埋的活菌數(shù)及包埋率的差異不顯著（P＞0.05），與Zou Qiang等[6]用殼聚糖包衣的微膠囊及Krasaekoopt等[16]添加益生元的微膠囊相似。說明COS包衣或AOS益生元的添加不會對包埋率或包埋活菌數(shù)造成顯著影響。

2.2 模擬胃液處理對長雙歧桿菌CICC6259活性的影響

圖2 微囊化和游離的長雙歧桿菌CICC6259在模擬胃液中活菌數(shù)的變化Fig. 2 Survivability curves of microencapsulated and nonmicroencapsulated B. longum CICC6259 in simulated gastric juice

如圖2所示，在所有樣品中，長雙歧桿菌活菌數(shù)在體外模擬胃液處理的120 min期間連續(xù)降低，說明高濃度的氫離子對長雙歧桿菌具有較強(qiáng)的破壞性，而基礎(chǔ)微膠囊可以為其提供一定的保護(hù)[20]。模擬胃液處理120 min后，COS-微膠囊中的長雙歧桿菌的減少量比沒有涂層的基礎(chǔ)微膠囊低約1 個(gè)數(shù)量級，這證明了小分子的殼寡糖與大分子的殼聚糖[6]類似，也能作為增強(qiáng)微膠囊對益生菌保護(hù)作用的陽離子包衣材料；AOS-COS-微膠囊中長雙歧桿菌的減少量比基礎(chǔ)微膠囊中的低約3 個(gè)數(shù)量級，與Krasaekoopt等[16]方微膠囊中添加菊粉作為益生元的研究結(jié)果類似。說明添加AOS作為益生元可以增強(qiáng)微膠囊對益生菌的保護(hù)作用。AOS-COS-微膠囊在120 min的模擬胃液處理后，活菌數(shù)仍能達(dá)到106CFU/g以上，具有良好的耐胃酸效果。

2.3 長雙歧桿菌CICC6259在模擬消化道體系中的活菌數(shù)及微膠囊的崩解狀況

圖3 微囊化和游離的長雙歧桿菌CICC6259在模擬消化液系統(tǒng)中活菌數(shù)的變化Fig. 3 Survivability curves of microencapsulated and nonmicroencapsulated B. longum CICC6259 in simulated digestive juices

如圖3所示，活菌數(shù)量在模擬消化道體系中降低的原因可能是由于氫離子（0～1.5 h）和膽鹽[20]（1.5～5.5 h）的影響。在5.5 h的模擬消化液處理后，COS-微膠囊與AOS-COS-微膠囊中的活菌數(shù)均能達(dá)到106CFU/g以上，且AOS-COS-微膠囊中的活菌數(shù)比基礎(chǔ)微膠囊高1 000多倍，說明AOS-COS-微膠囊在模擬消化道體系中對長雙歧桿菌具有最佳的保護(hù)作用。

微膠囊完全崩解所需的時(shí)間及形態(tài)變化如表2和圖4所示。相比較基礎(chǔ)微膠囊，添加COS包衣可顯著延長崩解時(shí)間約1.4 h（P＜0.05），COS-微膠囊與AOS-COS-微膠囊的崩解時(shí)間和形態(tài)變化較為相似。所有微膠囊均在小腸模擬液處理期間完全崩解?；A(chǔ)微膠囊在食管到胃的模擬液處理后（1.5 h）邊緣較模糊，在十二指腸模擬液處理后（3 h）已部分崩解，不能保持完整的球狀。而具有COS包衣的微膠囊在食管到胃及十二指腸模擬液處理后均能保持邊緣及形狀完整。

表2 3 種微膠囊完全崩解所需時(shí)間Table 2 Times required for complete disintegration of the three microcapsules

圖4 微膠囊在模擬消化道體系中的形態(tài)變化Fig. 4 Morphological changes of microcapsules in simulated digestive system

制劑在人體小腸內(nèi)的平均轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間為3～4 h[21]，基于上述崩解情況可以推測，COS-微膠囊和AOS-COS-微膠囊是較為有效的長雙歧桿菌運(yùn)載體。它們不僅能將包埋的益生菌完全釋放于腸道，還能在通過消化道期間對益生菌起到保護(hù)作用。

2.4 長雙歧桿菌CICC6259的貯藏穩(wěn)定性分析

在4 ℃條件下貯藏一段時(shí)間后，微膠囊中的活菌數(shù)如圖5所示。COS的包衣和AOS的添加顯著提高了長雙歧桿菌的存活率（P＜0.05）。類似于殼聚糖包衣[6]，COS包衣可以為微膠囊提供致密的外層半透膜，從而加強(qiáng)微膠囊對氧的隔絕作用，在貯藏期內(nèi)保持更高的活菌數(shù)。方微膠囊中加入AOS益生元能夠在貯藏期內(nèi)提供給長雙歧桿菌額外的保護(hù)。

圖5 微囊化和游離的長雙歧桿菌CICC6259在4 ℃條件下的貯藏穩(wěn)定性Fig. 5 Stability of microencapsulated and non-microencapsulated B. longum CICC6259 during 28 days of storage at 4 ℃

2.5 COS涂層的益生元效應(yīng)驗(yàn)證

用對雙歧桿菌無害的解囊液液化微膠囊，計(jì)數(shù)液化液中的活菌，發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)微膠囊與3 種COS-微膠囊中的雙歧桿菌數(shù)基本相同。因此，不同的COS含量是各種微膠囊液化液的唯一區(qū)別。將液化液全部接種到MRS肉湯中，3 種不同質(zhì)量濃度COS包衣的COS-微膠囊中長雙歧桿菌的生長曲線如圖6所示。5 mg/mL COS-微膠囊中釋放的長雙歧桿菌在對數(shù)生長期具有最高的生長速率，是基礎(chǔ)微膠囊中的約1.71 倍；且在生長平臺期具有最高的濃度，相比較基礎(chǔ)微膠囊提高了25%。這證明了作為包衣材料的COS在解囊后可以刺激長雙歧桿菌的生長，同時(shí)發(fā)揮了益生元作用。

圖6 解囊后微膠囊中長雙歧桿菌CICC6259的生長曲線Fig. 6 Growth curves of B. longum CICC6259 in decapsulated microcapsules

綜合上述所有體外實(shí)驗(yàn)，證明了益生菌微膠囊的COS涂層具有作為包衣和益生元的兩種性質(zhì)。此外，添加AOS能加強(qiáng)微膠囊在模擬胃液處理和貯藏時(shí)對益生菌的保護(hù)作用。然而體外模擬胃液實(shí)驗(yàn)并不能夠很好地模擬出實(shí)際復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境[22]，因此有必要在體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)。動物實(shí)驗(yàn)可以進(jìn)一步測試海洋寡糖微膠囊的有益效果，并驗(yàn)證其作為一種功能性食品的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.6 動物實(shí)驗(yàn)分析

2.6.1 微膠囊在體內(nèi)的消化情況

微膠囊能否在腸道中解囊是益生菌能否定植并調(diào)節(jié)腸道菌群的基礎(chǔ)和前提[22]。模擬消化道體系實(shí)驗(yàn)證明，本研究中的所有微膠囊都可在小腸模擬液中解囊。體內(nèi)消化實(shí)驗(yàn)表明，灌胃5 min后，3 種微膠囊在小鼠胃中均保持形態(tài)完好；灌胃1 h或3 h后，小鼠胃中尚有部分完整的微膠囊存在，在小腸中檢出微膠囊碎片；灌胃5 h或7 h后，于小鼠胃和小腸中均未檢出完整的微膠囊或微膠囊碎片；在灌胃后的任一時(shí)間段，盲腸和結(jié)腸中始終未檢出完整的微膠囊或微膠囊碎片。證明了本研究中所有的微膠囊都能在小鼠小腸中完全解囊。

2.6.2 小鼠的腸道菌群分析

對各組小鼠腸道中的長雙歧桿菌分別計(jì)數(shù)，結(jié)果見圖7。陽性對照組小鼠腸道中的長雙歧桿菌含量是空白對照組的1.44 倍。相比較陽性對照組，基礎(chǔ)微膠囊實(shí)驗(yàn)組（不含益生元）小鼠腸道中的長雙歧桿菌含量顯著提高（P＜0.05），這說明基礎(chǔ)微膠囊在小鼠體內(nèi)可為長雙歧桿菌提供一定的保護(hù)，從而增加了小鼠腸道中長雙歧桿菌的含量。COS-微膠囊實(shí)驗(yàn)組和AOS-COS-微膠囊實(shí)驗(yàn)組小鼠腸道中長雙歧桿菌的含量與空白對照組和基礎(chǔ)微膠囊實(shí)驗(yàn)組相比變化均顯著（P＜0.05）。推測這與海洋寡糖微膠囊對益生菌的進(jìn)一步保護(hù)作用以及海洋寡糖的益生元作用有關(guān)。

圖7 5 組不同飲食小鼠的腸道菌群中長雙歧桿菌的數(shù)量Fig. 7 Numbers of B. longum in intestinal fl ora of 5 groups of mice fed on different diets

應(yīng)用Illumina MiSeq高通量測序法分析小鼠的腸道菌群，可以高效避免不可培養(yǎng)菌群的不可測性，較準(zhǔn)確地還原腸道菌群的結(jié)構(gòu)比例及豐度。OTU數(shù)量越大則樣品中物種的豐富度越高[23]。如表3所示，陽性對照組和基礎(chǔ)微膠囊實(shí)驗(yàn)組小鼠腸道菌群均出現(xiàn)OTU數(shù)量和α多樣性顯著上升的現(xiàn)象，而COS-微膠囊實(shí)驗(yàn)組和AOS-COS-微膠囊實(shí)驗(yàn)組與空白對照組無顯著差異。灌胃益生菌可以有效提高小鼠的腸道菌群OTU值和α多樣性[24]，基礎(chǔ)微膠囊提高小鼠的腸道菌群OTU值和α多樣性的效果強(qiáng)于菌液，是由于長雙歧桿菌在通過上胃腸道時(shí)得到了保護(hù)，使更多活菌在腸道內(nèi)定植。然而兩種海洋寡糖微膠囊卻降低了小鼠的腸道菌群OTU值和α多樣性，這可能是益生元COS和AOS的攝入引起的。Matsuki等[25]表明，低聚半乳糖作為益生元可導(dǎo)致嬰兒腸道內(nèi)益生菌含量增加，同時(shí)α多樣性降低。Slavan[26]認(rèn)為，益生元降低腸道菌群多樣性可能是由于益生元選擇性增殖益生菌同時(shí)抑制條件致病菌生長導(dǎo)致的。目前，尚未有直接的證據(jù)論證菌群α多樣性下降對動物健康的影響[27]。

表3 5 組小鼠腸道菌群的OTU數(shù)量及α多樣性Table 3 OTU number and α diversity of intestinal microbiota in 5 groups of mice

優(yōu)勢門的相對豐度如圖8所示。與相關(guān)的研究結(jié)果相似[28]，所有組的主要門都是擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），它們的總和占樣品中微生物總量的97%～99%。組間比較，空白對照組小鼠腸道菌群中擬桿菌門和變形菌門的含量最高，厚壁菌門的含量最低。AOS-COS-微膠囊實(shí)驗(yàn)組小鼠腸道中厚壁菌門的含量最高，相比較空白對照組增加了25%；同時(shí)擬桿菌門和變形菌門的含量最低，相比較空白對照組分別降低了13%和8%。腸道中的厚壁菌門主要包括芽孢桿菌綱和梭菌綱，能夠幫助多糖發(fā)酵。芽孢桿菌綱中包括芽孢桿菌目和乳桿菌目，對維持腸道健康起到重要作用。擬桿菌門主要為擬桿菌綱，作為病原菌可引發(fā)闌尾炎及敗血癥等病癥[29]。變形菌門包括大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌等有害菌，變形菌門的增加是潛在的疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)[30]。

圖8 5 組不同飲食小鼠的腸道菌群優(yōu)勢門的相對豐度Fig. 8 Relative abundance of dominant bacterial phyla in intestinal fl ora of 5 groups of mice fed on different diets

圖9 5 組不同飲食小鼠的腸道菌群優(yōu)勢屬的相對豐度Fig. 9 Relative abundance of dominant bacterial genera in intestinal fl ora of 5 groups of mice fed on different diets

為更清晰地研究小鼠腸道中有益菌和有害菌的變化趨勢，對優(yōu)勢屬進(jìn)行深入分析。如圖9所示，陽性對照組和3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠腸道中脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）、另枝菌屬（Alistipes）、螺桿菌屬（Helicobacter）、腸球菌屬（Enterococcus）顯著降低，羅斯氏菌屬（Roseburia）、乳桿菌屬（Lactobacillus）顯著升高。且就變化幅度的大小排序，實(shí)驗(yàn)組＞陽性對照組＞空白對照組。雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）雖在陽性對照組與3 種微膠囊實(shí)驗(yàn)組的小鼠腸道菌群中顯著升高（相比較空白對照組），但在陽性對照組與3 種微膠囊實(shí)驗(yàn)組之間并未表現(xiàn)出明顯差異。這與上述雙歧桿菌計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不符，推測原因是雙歧桿菌屬在腸道菌群中占比太小，用相對豐度不能清晰地表示出小鼠腸道菌群中雙歧桿菌含量的變化趨勢。脫硫弧菌屬與腸道疾病之間存在一定的聯(lián)系。腸道脫硫弧菌屬數(shù)量的增多是腸道息肉和潰瘍性結(jié)腸炎的一個(gè)重要特征[31]。另枝菌屬是一種兼性致病菌，在患有腸應(yīng)激綜合征患者的腸道內(nèi)的含量增多[32]。螺桿菌屬中的一些菌株如幽門螺旋桿菌具有致病性，與消化性潰瘍、慢性胃炎、十二指腸炎和胃癌密切相關(guān)。腸球菌屬屬于腸桿菌科（Enterobacteriaceae），腸桿菌科包括許多常見的病原菌，如沙門氏菌、大腸桿菌、克雷伯氏菌和志賀氏菌等，可導(dǎo)致腹瀉、腹膜炎、敗血癥等疾病。腸球菌屬是糞便中常見的一種病原菌，可能導(dǎo)致尿路感染、菌血癥及腦膜炎等疾病，且對許多抗菌藥物具有耐藥性。羅斯氏菌屬屬于毛螺菌科（Lachnospiraceae），可以利用碳水化合物和纖維產(chǎn)生丁酸類物質(zhì)。腸道中的丁酸可以刺激腸道細(xì)胞產(chǎn)生抗菌肽類物質(zhì)，從而抵制外來致病菌，有助于腸道健康[33]。乳桿菌屬是最為常見的益生菌屬，對腸道健康具有重要意義。

綜上所述，對小鼠腸道菌群的改善效果由高到低的益生菌制劑依次是AOS-COS-微膠囊、COS-微膠囊、基礎(chǔ)微膠囊、裸雙歧桿菌。包括AOS-COS-微膠囊和COS-微膠囊在內(nèi)的海洋寡糖微膠囊具有最佳的改善腸道菌群的效果，分析原因有：1）在通過上胃腸道時(shí)，微膠囊良好的保護(hù)效果使長雙歧桿菌在到達(dá)腸釋放位點(diǎn)時(shí)具有更多的活菌數(shù)，更多的長雙歧桿菌在腸道定植；2）微膠囊在腸道中被液化后，AOS與COS作為兩種益生元可以刺激腸道益生菌的生長，且對腸道部分條件致病菌的生長有抑制作用[9-10,13]。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以長雙歧桿菌為例，證明了海洋寡糖微膠囊作為一種益生菌制劑，可以顯著增強(qiáng)對益生菌的保護(hù)作用。由于較多的活性益生菌到達(dá)腸靶位點(diǎn)及益生元的釋放，海洋寡糖微膠囊的攝入可以對腸道菌群起到良好的調(diào)節(jié)作用。通過增加益生菌（雙歧桿菌、乳桿菌等）并減少條件致病菌（脫硫弧菌、螺桿菌、腸球菌等）的含量，降低機(jī)體罹患如腸道息肉、消化性潰瘍、慢性胃炎、十二指腸炎等胃腸道疾病的風(fēng)險(xiǎn)。未來海洋寡糖微膠囊還可以被用于包埋其他種屬的益生菌，具有良好的應(yīng)用前景。