鮮義坤1,2,王承東,林俊帆1,李 果,李裕冬1,孔 凌5,熊鐵一1,張貴權(quán)

(1.四川省自然資源科學研究院,四川 成都 610041;2.峨眉山生物資源實驗站,四川 峨眉山 614201;3.大熊貓國家公園珍稀動物保護生物學國家林業(yè)和草業(yè)局重點實驗室,四川 臥龍 623006;4.中國大熊貓保護研究中心,四川 臥龍 623006;5.成都大帝漢克生物科技有限公司,四川 成都 611130)

大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)屬世界生物多樣性保護成功的珍稀動物?！坝状婊铍y”是大熊貓人工繁殖過程中的三大難題之一,雖然獲得一些技術(shù)突破,但仍在不斷完善。在大熊貓繁育過程中,50%左右的妊娠母獸1胎產(chǎn)2仔,極個別的妊娠母獸產(chǎn)3仔[1],泌乳量難以滿足2—3仔快速生長發(fā)育需要；有的母獸分娩后棄仔、不會哺乳，需用其他動物乳汁或奶粉進行人工喂養(yǎng)或補飼。選擇既誘食(香氣)又喜食(滋味、質(zhì)地)還能滿足幼仔營養(yǎng)需要的乳汁或奶粉已成為人工育幼的關(guān)鍵技術(shù)之一,因此有必要探究大熊貓幼仔喜食物的香氣及其呈香物質(zhì)。

電子鼻又稱氣味掃描儀,根據(jù)仿生學原理制成,用于檢測樣品中揮發(fā)性成分整體的氣味信息;頂空(HS)—固相微萃取(SPME)—氣相色譜(GC)—質(zhì)譜(MS)聯(lián)用技術(shù)是當今國內(nèi)外分析樣品中未知混合型揮發(fā)性有機物質(zhì)(VOCs)的主流方法。部分學者用電子鼻技術(shù)檢測過牛奶粉[2]、羊奶粉[3]、嬰兒奶粉[4]中的揮發(fā)性成分,用HS-SPME-GC-MS法分析過羊乳[5]、牛乳[6,7]、豬乳[8,9]、羊奶粉[10-12]、牛奶粉[12]、驢奶粉[13]中的風味物質(zhì),為本研究提供了可供參考的方法。我們曾用非極性毛細管色譜柱對大熊貓幼仔補飼兩種奶粉的揮發(fā)性成分進行過初步分析,但探尋出的VOCs和香氣成分數(shù)量不及預期[14]。本文改用強極性毛細管色譜柱等HS-SPME-GC-MS方法中的關(guān)鍵技術(shù)節(jié)點,采用電子鼻技術(shù),再結(jié)合專業(yè)人員的嗅感品評進一步研究這兩種奶粉的氣味特點與香氣成分,旨在從補飼奶粉中探尋大熊貓幼仔喜食物的氣味韻調(diào)、整體氣味信息和更多的香氣物質(zhì),為篩選大熊貓幼仔專用誘食劑原料提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供測奶粉

供測奶粉為兩種:奶粉A,為美國某企業(yè)生產(chǎn);奶粉B,為我國某中外合資企業(yè)生產(chǎn),屬嬰兒配方奶粉,適用于喂養(yǎng)0—6月齡的嬰兒。這兩種奶粉均在中國大熊貓保護研究中心(簡稱“大熊貓中心”)用于補飼大熊貓幼仔多年。奶粉A樣品采自大熊貓中心臥龍神樹坪基地,奶粉B從成都市某超市購買,與大熊貓中心臥龍神樹坪基地飼喂的品牌、型號和適用月齡一致。首先，將樣品置入已清洗干凈并經(jīng)濕熱高溫滅菌除味(高溫→室溫→高溫,熱冷間歇,重復3次)的10mL棕色玻璃瓶中,旋緊瓶蓋,再用無味的封口膜纏繞瓶蓋與瓶頸結(jié)合處數(shù)圈密封,防止奶粉氣味散失和環(huán)境氣味串入,置于-20℃冰箱中保存待測。

1.2 分析儀器

表1 PEN3型電子鼻傳感器信息

1.3 香氣品評方法

稱取1.0g奶粉置入干凈無味的50mL的燒杯中,由長時間從事飼料或食品調(diào)味劑工作的專業(yè)人員通過嗅覺感知和辨別奶粉散發(fā)出的香氣韻調(diào)與強弱等,描述并記錄嗅辨結(jié)果。品評小組由6名人員(其中女性3名)組成,平均年齡43歲,無嗅覺疾患和臨床感冒癥狀,在適宜的室內(nèi)環(huán)境中(室溫24—25℃,自然氣壓與濕度)品評,最后由品評小組負責人對嗅辨結(jié)果進行匯總、分析并確定奶粉中的香氣特點。

1.4 電子鼻測試方法

準確稱取0.700g奶粉(精確至0.001g)置入干凈無味的燒杯中,再加入14.0mL溫水(純凈水),攪拌至完全溶解后,準確地量取5mL奶液置入20mL干凈無味的樣品瓶中,迅速將帶有密封墊圈的瓶帽旋緊,室溫下平衡1.5h后,直接將進樣針頭插入樣品瓶,采用頂空吸氣法測試。完成一次檢測后待系統(tǒng)自動清零和標準化后再進行第二次頂空采樣,每個樣品平行測定3次。測試參數(shù)為樣品準備時間5s、檢測時間180s、測量計數(shù)1s、自動調(diào)零時間5s、清洗時間90s,內(nèi)部流量400mL/min、進樣流量8mL/min。所得數(shù)據(jù)經(jīng)儀器自帶軟件Winmuster和Origin pro 2018自動統(tǒng)計分析。

1.5 HS-SPME-GC-MS方法

HS-SPME方法:稱取2.0g奶粉置入20mL的頂空瓶中,迅速用密封墊和鋁蓋密封;將已老化的SPME纖維頭(250℃下老化)插入頂空瓶,推出SPME纖維頭至離奶粉平面約1cm處;將頂空瓶與SPME纖維頭置于電熱恒溫水浴鍋內(nèi),固定,70℃或80℃溫度下分別頂空萃取1h;拔出SPME纖維頭后快速插入GC進樣口,推出SPME纖維頭解吸。

GC-MS方法:按相關(guān)文獻[15]中的測試方法二進行儀器分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種補飼奶粉的香氣品評

奶粉A的香氣韻調(diào)描述:淡淡的奶香氣,略帶乳脂香和奶腥氣；微弱的青香氣,甜度明顯；有人嗅辯出豆香氣、發(fā)酵樣酸香氣。奶粉B的香氣韻調(diào)描述:較淡的奶香氣,略帶乳脂香,奶腥氣突出。相對而言,奶粉A的香氣韻調(diào)較多、濃度較強、腥氣較淡、甜度明顯、氣味擴散性較好但持久性較差;奶粉B的香氣韻調(diào)較少、濃度較淡、腥氣突出、氣味擴散性較差但持久性較好。

2.2 兩種補飼奶粉的電子鼻測試結(jié)果

傳感器響應值:從圖1和圖2可見,奶粉A和奶粉B的響應曲線存在明顯不同,奶粉A在R2和R7傳感器上的響應峰值均明顯低于奶粉B。當連續(xù)吸附40s以后,奶粉A在R6傳感器上的響應值最高,且一直持續(xù)到測試結(jié)束;而奶粉B在吸附100s后R6傳感器的響應值才達到最高。當180s測試結(jié)束時,奶粉A響應值排前三位的傳感器依次為R6、R8和R2,奶粉B依次為R6、R7和R2。從表1可見,奶粉A和奶粉B的揮發(fā)性成分存在部分差異。

圖1 奶粉A的電子鼻響應曲線

圖2 奶粉B的電子鼻響應曲線

從圖3可知,180s時奶粉A和奶粉B在R1、R2、R3、R5、R9、R10傳感器上的響應值差異均較小,但奶粉A在R4、R6、R8傳感器上的響應值均高于奶粉B,奶粉B僅R7傳感器上的響應值高于奶粉A。從表1可見,這兩種奶粉中揮發(fā)性成分差異的主要貢獻物質(zhì)類別為氫化物、甲基類、無機硫化物、萜烯類、醇類、酮類和醛類。

主成分分析(PCA):PCA分析是降低數(shù)據(jù)維度和解決多重共線性問題最常用的多變量統(tǒng)計方法,其原理是利用降維思想,通過研究指標體系內(nèi)在結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系,把多指標轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個相互獨立且包含原有指標大部分信息的綜合指標。

據(jù)中國農(nóng)業(yè)科學院最新消息，中國水稻研究所種質(zhì)創(chuàng)新團隊發(fā)現(xiàn)一種新型水稻種質(zhì)“小薇”，可以像雙子葉模式植物擬南芥一樣，在實驗室內(nèi)大規(guī)模種植和篩選。相關(guān)研究成果在線發(fā)表于《分子植物》雜志上。

圖3 奶粉A和奶粉B的電子鼻雷達圖

從圖4可見,奶粉A和奶粉B的電子鼻數(shù)據(jù)信息點所在的橢圓區(qū)域分別位于圖中的不同區(qū)域,說明PCA法可用于對這兩種奶粉中揮發(fā)性成分的識別分析。第一主成分(PC1)貢獻率為74.58%,第二主成分(PC2)貢獻率為24.20%,累積貢獻率高達98.78%,表明前兩個主成分所代表的信息能完整反映樣品的整體氣味信息,奶粉A和奶粉B在PC2上存在較大差異。這兩種奶粉所在區(qū)域沒有交叉重疊,彼此獨立成簇且相互有一定的距離,表明兩種奶粉的整體氣味信息差別顯著,PCA法能將其準確區(qū)分。

圖4 奶粉A和奶粉B的電子鼻PCA分析

線性判別分析(LDA):LDA分析是在PCA分析的前提下將揮發(fā)性物質(zhì)的響應信號進行進一步優(yōu)化處理,與PCA分析的主要區(qū)別在于LDA分析更注重同類別組分在空間中的分布狀態(tài)和彼此之間的距離,將數(shù)據(jù)之間的差異性進一步擴大,可提高分類精度。

從圖5可見,奶粉A和B的LD1與LD2貢獻率分別為99.63%和0.05%,累積貢獻率高達99.68%,能較好地反映樣品的整體氣味信息。這兩種奶粉的空間分布均無任何重疊,且相距較遠,差異主要在LD1上,表明兩種奶粉的氣味信息差別較大,可見利用電子鼻中的LDA模式能準確識別其整體氣味信息的差異。

圖5 奶粉A和奶粉B的的電子鼻LDA分析

載荷分析(LA):不同傳感器在LA分析圖中的不同位置可反映傳感器對樣品氣味貢獻的大小,距離原點越遠,表示此傳感器在揮發(fā)性成分分析中所起的作用越大;反之,說明該傳感器的貢獻越小。

從圖6可見,對第一主成分貢獻較大的傳感器為R6,其他依次為R7、R8和R1;對第二主成分貢獻較大的傳感器為R2,其余依次為R8和R7;R3、R4、R5、R9、R10傳感器對第一主成分和第二主成分的貢獻率均較小,因為集中分布在0點附近,可見這5個傳感器所對應的揮發(fā)性物質(zhì)在這兩種奶粉中差異均較小。從表1可知,這兩種奶粉的主要揮發(fā)性化合物類別可能為:甲基類、醇類、醛類、酮類、無機硫化物、萜類、氮氧化物、芳香類,這些類別的揮發(fā)性成分構(gòu)成了這兩種奶粉的整體氣味信息,可能因為它們含量不同，導致其整體氣味呈現(xiàn)較大差異。

圖6 奶粉A和奶粉B的電子鼻LA分析

2.3 兩種補飼奶粉中的VOCs和香氣成分

奶粉A中的VOCs:經(jīng)70℃ HS-SPME預處理1h和GC-MS測試,奶粉A中的VOCs組成見圖7、表2。從圖7和表2可見,確定(匹配度≥80%,下同)的VOCs有76種,分別歸類于醇14種、酚1種、醛6種、酮6種、羧酸6種、酯1種、內(nèi)酯3種、烷烴2種、烯烴4種、芳香烴29種、含硫化合物3種、雜環(huán)化合物1種,相對含量排前五位的VOCs為己醛(10.95%)、2-丙醇(6.32%)、1,3-二甲基苯(5.18%)、丙酮(4.56%)、α-蒎烯(4.18%),累計為31.19%。經(jīng)80℃ HS-SPME預處理1h和GC-MS測試,奶粉A中的VOCs組成見圖8、表2。從圖8和表2可見,確定的VOCs有87種,分別歸類于醇12種、酚1種、醛10種、酮7種、羧酸7種、酯3種、內(nèi)酯3種、烷烴2種、烯烴5種、芳香烴27種、含硫化合物4種、雜環(huán)化合物6種,相對含量排在前五位的VOCs分別為己醛(11.22%)、戊醛(5.20%)、2-丙醇(4.76%)、丙酮(3.73%)、1,3,5-三甲基苯(2.99%),累計為27.90%。

圖7 奶粉A經(jīng)70℃ HS-SPME處理1h的VOCs總離子流色譜圖

圖8 奶粉A經(jīng)80℃ HS-SPME處理1h的VOCs總離子流色譜圖

表2 奶粉A中的VOCs

(續(xù)表2)

序號VOCs名稱70℃ HS-SPME 1h80℃ HS-SPME 1h保留時間(min)匹配度(%)相對含量(%)保留時間(min)匹配度(%)相對含量(%)家畜乳汁與奶粉中被檢出的文獻與奶粉B異同成分6癸烷———4.418900.84[12,13]√7α-蒎烯4.475964.184.916962.16[9]×8三氯甲烷4.654920.745.135780.96[6,10,11]×9甲基苯4.933943.935.463942.15[7,9,13]×104-甲基十二烷———5.697800.50×11二甲基二硫醚5.639941.086.334971.00×12己醛5.8149510.956.5929311.22[7-9,12,13]√13β-蒎烯6.291901.947.055911.74[9]×14乙基苯6.873931.847.821930.83[6,10,11,13]×151,4-二甲基苯7.043951.438.060971.03[6,8-10,13]×161,3-二甲基苯7.217955.188.259972.97[9,11]×171-丁醇7.316640.308.498900.88×182-庚酮———9.66791—[7,10,12,13]√191,2-二甲基苯8.356953.669.762952.15×20庚醛———9.826831.84[12,13]√21十二烷8.520930.41———[6,8,10,12,13]√22d-檸檬烯8.600970.9610.130981.08[13]×232-寧烯8.84991————×24β-水芹烯———10.44391—×25丙基苯8.973900.5910.608870.35×26吡嗪———10.82680—×272-己烯醛———11.025940.08×281-乙基-2-甲基苯9.401952.2111.130950.41×292-戊基呋喃9.590910.6411.568910.56[12,13]√301,2,4-三甲基苯9.903971.1811.926950.94[11]×311-戊醇10.117902.5912.389902.21[7,12]√32苯乙烯10.34194—12.553941.43[6,10,11]×331-乙基-4-甲基苯10.381861.38———×341,3,5-三甲基苯10.923973.0913.364972.99×35辛醛———13.797811.07[7]×363-羥基-2-丁酮11.222831.43———[6,7]√371-甲基-3-丙基苯11.505900.7614.254930.84×382-乙基-1,4-二甲基苯———15.120960.66×391-乙基-3,5-二甲基苯12.083960.75———×40順式-2-戊烯-1-醇———15.255900.43×411,2,3-三甲基苯12.401951.1915.583971.08×422-甲基-3-戊醇12.749830.49———×431-甲基-4-(1-甲基乙基)苯12.844940.2416.260950.36[8,9]×441-己醇12.904830.4316.543720.81×451-乙基-2,3-二甲基苯13.018950.45———√464-乙基-1,2-二甲基苯13.237970.6016.842961.12×47二甲基三硫醚———17.389870.11×48乙酸-2-乙基己酯13.645830.3017.633910.20×492-壬酮———17.787870.48[6,7,10-13]√50壬醛13.937910.3618.011810.88[6,7,12,13]√511-苯基-1-丁烯14.014860.33———×523-辛烯-2-酮14.302900.7518.543900.84[12,13]×531,2,4,5-四甲基苯14.725970.4419.101970.48[6]×54反式-2-辛烯醛———19.42983—[9,12]×551,2,3,5-四甲基苯15.003970.7519.553970.85×561,3-二氯苯15.307950.2720.041950.25×571-辛烯-3-醇15.466900.3020.558800.35[12]√581-庚醇15.575800.1920.67390—×593-甲硫基丙醛15.670930.1920.722930.48×602,3-二氫-5-甲基-1H-茚———21.066900.28×61呋喃甲醛15.958910.5821.155910.53[6,7,13]√622,3-二氫-4-甲基-1H-茚16.01891————×

(續(xù)表2)

序號VOCs名稱70℃ HS-SPME 1h80℃ HS-SPME 1h保留時間(min)匹配度(%)相對含量(%)保留時間(min)匹配度(%)相對含量(%)家畜乳汁與奶粉中被檢出的文獻與奶粉B異同成分631,2,3,4-四甲基苯16.362950.3421.583950.62×642-乙基-1-己醇16.451862.6922.076861.87[7,12,13]×65乙酸16.51187—22.131871.41[6-11]√661-異丙基-2,4-二甲基苯———22.742930.16×671-甲基-2,3-二氫茚16.675910.39———×683,5-辛二烯-2-酮17.212901.8422.917912.45[13]×69苯甲醛17.376970.5623.056961.06[6,7,10-13]√70(R,R)-2,3-丁二醇17.83486—23.89280—×711,5,6,7-四甲基雙環(huán)[3.2.0]庚-2,6-二烯———24.19492—×72甲酸辛酯———24.28591—×731-辛醇18.133870.1224.290910.24√74反式,反式-3,5-辛二烯-2-酮18.426871.1924.534901.67[12]√75丙酸18.561940.4524.842950.26[7]√762,3-丁二醇18.745900.1625.06683—√771,2-丙二醇19.118900.4625.529910.47×782,3-二氫-4,7-二甲基-1H-茚19.227860.3926.067950.14×79γ-丁內(nèi)酯———26.35593—[7]√801,2,3,4,5-五甲基苯———26.55995—×81苯乙酮20.456900.2726.952900.53√82丁酸20.600911.8927.305911.42[6-11]√832-呋喃甲醇20.770950.3327.474970.46[9,10,13]√84α-甲基苯甲醇21.237870.14———[10,11]×852,7-二甲基氧雜環(huán)庚三烯———27.907900.19×86γ-己內(nèi)酯21.635910.1228.305780.17×87萘22.426951.0129.161951.65[6-8]√88戊酸23.078830.2930.061800.37[7,10,11]√89δ-己內(nèi)酯23.630810.1730.524900.12×901-甲氧基-4-(1-丙烯基)苯24.32790—31.350970.06×912-甲基萘24.810970.3731.798960.77[6,7,13]×92己酸25.352901.1032.484902.07[6-11]√93苯甲醇25.496830.07———[10,11]√941-甲基萘25.586970.1832.634960.55[6,8,10,11]√95二甲基砜26.098961.2233.231960.91[6,7,10-12]√96δ-辛內(nèi)酯27.25390—34.410950.08[12,13]×97麥芽酚27.332580.1234.519940.22[7,9]√98苯酚28.287940.1135.524940.05[6,7,10,11]√99辛酸———36.858900.05[5-7,9-13]√1004-甲基-5-噻唑乙醇———40.111930.09×101苯甲酸37.228950.2142.982960.16[6,7,10,11]√102煙酰胺———47.485970.27√

注:未列出70℃和80℃ HS-SPME預處理1h后測出的匹配度均小于80%的成分,—表示儀器未檢出或未自動算出,×表示奶粉A與奶粉B不同的成分,√表示奶粉A與奶粉B相同的成分,表3同。

奶粉A的上述兩次測試均為同一人員操作,并在同日經(jīng)同一儀器檢出的結(jié)果,VOCs數(shù)量及其相對含量的差異可能是不同的HS-SPME溫度所致。HS-SPME溫度升高可使樣品中的VOCs擴散加速,有利于增強SPME纖維頭對VOCs的吸附效果,所以在80℃ HS-SPME預處理下測出的VOCs比在70℃ HS-SPME預處理下多11個。若將70℃和80℃ HS-SPME兩個預處理的GC-MS測試數(shù)據(jù)合并,奶粉A中可確定的VOCs達102種(未計相互之間的重復成分,下同),分別歸類于醇16種、酚1種、醛10種、酮8種、羧酸7種、酯3種、內(nèi)酯4種、烷烴4種、烯烴6種、芳香烴33種、含硫化合物4種、雜環(huán)化合物6種,可見奶粉A中的VOCs是以芳香烴類、醇類、醛類、酮類、羧酸類為主,其中52種(占總數(shù)的51.0%)VOCs曾在家畜乳汁[5-9](羊乳或牛乳或豬乳,下同)或奶粉[10-13](羊奶粉或牛奶粉或驢奶粉,下同)中檢出,即已確定成分的相同度為51.0%,說明奶粉A與家畜乳汁或奶粉之間既有相同的成分,又存在50種VOCs的較大差異,可能導致奶粉A與家畜乳汁或奶粉在香氣韻調(diào)上既有相同,又有不同。若將奶粉A兩次測試的相對含量排前五位者合并進行算術(shù)平均計算,則其中平均相對含量排前五位的VOCs為己醛(11.09%)、2-丙醇(5.54%)、戊醛(4.34%)、丙酮(4.15%)、1,3-二甲基苯(4.08%),累計為29.20%,這些成分可能對奶粉A中主要香氣韻調(diào)的形成發(fā)揮了重要作用。

奶粉B中的VOCs:經(jīng)70℃ HS-SPME預處理1h和GC-MS測試,奶粉B中的VOCs組成見圖9、表3。從圖9和表3可見,確定的VOCs有57種,分別歸類于醇6種、酚1種、醛8種、酮7種、羧酸9種、酯1種、內(nèi)酯1種、烷烴17種、烯烴1種、芳香烴1種、含雜環(huán)化合物4種、含硫化合物1種,相對含量排在前五位的VOCs分別為丁酸(7.59%)、2,4,6-三甲基辛烷(4.76%)、2,6,11-三甲基十二烷(4.64%)、乙酸(4.52%)、2-呋喃甲醇(3.94%),累計為25.45%。經(jīng)80℃ HS-SPME預處理1h和GC-MS測試,奶粉B中的VOCs組成見圖10、表3。從圖10和表3可見,確定的VOCs有55種,分別歸類于醇8種、醛5種、酮9種、羧酸10種、內(nèi)酯1種、烷烴11種、烯烴1種、芳香烴3種、雜環(huán)化合物4種、含硫化合物1種、含氮化合物2種,相對含量排前五位的VOCs為丁酸(10.38%)、己酸(7.80%)、己醛(5.05%)、3,6-二甲基癸烷(4.60%)、辛酸(4.39%),累計為32.22%。

圖9 奶粉B經(jīng)70℃ HS-SPME處理1h的VOCs總離子流色譜圖

圖10 奶粉B經(jīng)80℃ HS-SPME處理1h的VOCs總離子流色譜圖

表3 奶粉B中的VOCs

(續(xù)表3)

序號VOCs名稱70℃ HS-SPME 1h80℃ HS-SPME 1h保留時間(min)匹配度(%)相對含量(%)保留時間(min)匹配度(%)相對含量(%)家畜乳汁與奶粉中被檢出的文獻與奶粉A異同成分22庚醛9.816860.518.364720.39[12,13]√23十二烷10.110962.188.528971.59[6,8,10,12,13]√242-戊基呋喃11.548950.799.597940.60[12,13]√254-甲基十四烷———9.697862.43×261-戊醇———10.130901.00[7,12]√271-乙基-2,3-二甲基苯———10.617910.26√28十五烷———11.433800.20[6,10-13]×295-乙基-2-甲基辛烷11.836803.17———×30甲酸戊酯12.379831.04———×31十九烷12.648800.47———×323-羥基-2-丁酮13.827801.22———[6,7]√331-羥基-2-丙酮14.478863.0611.647802.72[7]×34反式-2-庚烯醛15.070950.3212.105970.78×356-甲基-5-庚烯-2-酮15.63393—12.483920.19[7]×362-環(huán)戊烯-1-酮16.195900.2813.011870.23×372-壬酮———13.80283—[6,7,10-13]√38壬醛17.543901.5313.931911.43[6,7,12,13]√39N,N-二甲基乙酰胺———14.225860.50×40二十二烷———15.031830.41×411-辛烯-3-醇19.464860.5915.468900.58[12]√42呋喃甲醛19.966860.4615.971910.55[6,7,13]√43乙酸20.693914.5216.528912.17[6-11]√44反式,反式-3,5-辛二烯-2-酮———17.210870.17[12]√45苯甲醛21.519900.5117.384930.43[6,7,10-13]√46反式-2-壬烯醛21.75786————×471-辛醇22.459900.4218.125910.42√48丙酸22.917951.0318.548980.52[7]√492,3-丁二醇———18.767870.54√502,2-二甲基丙酸23.787910.83———[10]×51γ-丁內(nèi)酯24.34591—19.991970.16[7]√52苯乙酮24.842900.4220.434910.32√53丁酸25.076947.5920.5989110.38[6-11]√542-呋喃甲醇25.250973.9420.757974.03[9,10,13]√55α-松油醇25.937910.2621.429900.20[9]×565-甲基-2-呋喃甲醇———22.120940.10×57萘———22.439940.49[6-8]√58戊酸27.643860.8123.071860.65[7,10,11]√592-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮27.85790—23.280900.12×601-甲基萘29.41590—24.841950.23[6,8,10,11]√61己酸29.987902.2825.354907.80[6-11]√62苯甲醇30.096950.3725.494970.13[10,11]√63二甲基砜30.698963.4826.106962.63[6,7,10-12]√64麥芽酚31.952860.3227.335930.59[7,9]√65苯酚32.91780————[6,7,10,11]√66庚酸———27.514900.29[5,6,10,11]×67辛酸34.236870.2429.579974.39[5-7,9-13]√681,6-己內(nèi)酰胺35.833970.4131.459970.29[10,11]×69壬酸35.892900.2731.564960.57[5-7,10,11]×70癸酸———33.454960.15[5-7,9-13]×71苯甲酸40.330800.3237.231930.21[6,7,10,11]√72N-甲基二乙醇胺———37.515800.43×73煙酰胺44.813950.4441.868950.43√

奶粉B的上述兩次測試均如奶粉A一樣由同一人員操作并在同日經(jīng)同一儀器檢出的結(jié)果,VOCs數(shù)量及其相對含量的差異可能是不同的HS-SPME溫度所致。在80℃ HS-SPME預處理下測出的VOCs比在70℃ HS-SPME預處理下少了2個,與相關(guān)文獻[16]報道70℃和80℃ HS-SPME預處理的羊奶檢出結(jié)果是基本一致的。若將70℃和80℃ HS-SPME兩個預處理的GC-MS測試數(shù)據(jù)合并,奶粉B中可確定的VOCs達73種,分別歸類于醇9種、酚1種、醛8種、酮10種、羧酸11種、酯1種、內(nèi)酯1種、烷烴21種、烯烴1種、芳香烴3種、雜環(huán)化合物4種、含硫化合物1種、含氮化合物2種,可見奶粉B中的VOCs以烷烴類、羧酸類、酮類、醇類、醛類為主,其中45種(占總數(shù)61.6%)VOCs曾在家畜乳汁或奶粉中檢出,說明奶粉B與家畜乳汁或奶粉之間既有相同的成分,又存在28種VOCs的差異,可能導致奶粉B與家畜乳汁或奶粉在香氣韻調(diào)上既有相同,又有不同。若將奶粉B兩次測試的相對含量排前五位者合并進行算術(shù)平均計算,則其中平均相對含量排前五位的VOCs為丁酸(8.99%)、己酸(5.04%)、己醛(4.45%)、2-呋喃甲醇(3.99%)、3,6-二甲基癸烷(3.67%),累計為26.14%,這些成分可能對奶粉B中主要香氣韻調(diào)的形成起到了重要作用。

表4 補飼大熊貓幼仔用的兩種奶粉香氣成分異同分析

注:※表示在圈養(yǎng)大熊貓乳汁中測出[15]。

兩種奶粉中VOCs與香氣成分的異同分析:由表2與表3對比可知,奶粉A的VOCs比奶粉B多29種,奶粉A與奶粉B之間相同的VOCs有36種,奶粉A不同于奶粉B的VOCs有66種,奶粉B不同于奶粉A的VOCs僅37種,奶粉A與奶粉B互不相同的VOCs多達103種,可見這些差異可能是兩種奶粉間在香氣韻調(diào)和強度上不同的直接物質(zhì)原由,驗證了上述專業(yè)人員的香氣品評結(jié)果,并與上述電子鼻的測試結(jié)果相吻合;且這兩種奶粉的VOCs數(shù)量與文獻報道[5-14]的家畜乳汁及其奶粉之間都存在部分異同(表2、表3),可能是因為用于加工奶粉的乳汁來自不同的動物種類、或是添加了其他非乳源性原料或添加的種類和比例不同、或乳源動物種類相同而日糧組成和代謝類型不同,以及奶粉的生產(chǎn)工藝流程不同和VOCs分析方法不同如色譜柱的極性強弱[14]、SPME纖維頭的不同型號[14,17]等所致。

香氣韻調(diào)雖然與VOCs數(shù)量及其濃度密切相關(guān),但能起到關(guān)鍵作用的揮發(fā)性物質(zhì)是其中的香氣成分數(shù)量及其濃度,因為香氣成分屬于VOCs大類中的一部分。由表4可知,奶粉A中的香氣成分有58種,分別歸類于醇12種、酚1種、醛10種、酮8種、羧酸7種、酯3種、內(nèi)酯4種、烴6種、含硫化合物3種、雜環(huán)化合物4種,這些成分對奶粉A中香氣韻調(diào)的形成可能起到主要或主導作用,其中41種香氣成分(占總數(shù)的70.7%)在家畜乳汁或奶粉中檢出,17種(占總數(shù)29.3%)未在家畜乳汁或奶粉中檢出(表2),即已確定成分的不同度為29.3%;22種香氣成分(占總數(shù)的37.9%)曾在大熊貓乳汁中測出,36種(占總數(shù)62.1%)未在其中測出(表4)。奶粉B中的香氣成分有40種,分別歸類于醇6種、酚1種、醛8種、酮8種、羧酸10種、酯1種、內(nèi)酯1種、烴2種、雜環(huán)化合物3種,這些成分對奶粉B中香氣韻調(diào)的形成可能起到主要或主導作用,其中34種(占總數(shù)85.0%)香氣成分在家畜乳汁或奶粉中檢出,僅6種(占總數(shù)的15.0%)未在家畜乳汁或奶粉中檢出(表3);20種香氣成分(占總數(shù)的50.0%)曾在大熊貓乳汁中測出,20種(占總數(shù)50.0%)未在大熊貓乳汁中測出(表4)。奶粉A的香氣成分比奶粉B多18種,奶粉A和奶粉B相同的香氣成分有28種,互不相同的香氣成分達42種,據(jù)此推知這兩種奶粉的香氣韻調(diào)和強度存在異同,與上述的香氣品評和電子鼻測試結(jié)果一致。從已確定香氣成分的相同度而言,奶粉B(85.0%)比奶粉A(70.7%)更趨像家畜乳汁或奶粉,而奶粉A和奶粉B與圈養(yǎng)大熊貓乳汁中的香氣成分相同度僅分別為37.9%和50.0%,可間接說明這兩種奶粉的香氣韻調(diào)和強度與圈養(yǎng)大熊貓乳汁存在差異。根據(jù)相關(guān)文獻[17]，對表4中香氣成分(單體呈香物質(zhì))的香氣特征描述記載中可找到這兩種奶粉中的香氣韻調(diào)所對應的香氣成分,某種香氣韻調(diào)并非單獨由1種香氣成分引起,而是由多種單體呈香物質(zhì)相互作用(協(xié)同增效或抵消減弱)的綜合表象。

3 討論

3.1 大熊貓幼仔喜歡的食物香氣韻調(diào)

按一定比例用溫開水調(diào)混后的奶粉飼喂大熊貓幼仔的最初幾天,雖然幼仔不樂意吸食,但經(jīng)過一段時間的風味適應,奶粉中的主要香氣韻調(diào)逐漸被幼仔接受,奶粉是除母乳外的圈養(yǎng)大熊貓幼仔首先品嘗并成為最喜愛的人類加工食品。根據(jù)已述及的兩種補飼奶粉中的香氣品評結(jié)果,再結(jié)合圈養(yǎng)大熊貓乳汁香氣特征[18],大熊貓幼仔喜歡的食物香氣韻調(diào)有:奶香氣、甜氣、乳脂香、奶腥氣、青香氣、酸香氣。隨著大熊貓幼仔嗅覺系統(tǒng)不斷發(fā)育完善,感知和認知的食物與環(huán)境氣味越來越多,喜歡的食物香氣韻調(diào)也會不斷拓展,無疑補飼奶粉A或奶粉B除增強營養(yǎng)物質(zhì)供給外還有利于對幼仔嗅覺馴化,提升幼仔對安全性氣味的識別能力。當然幼仔喜歡的某種香氣韻調(diào)受其強度限制,香氣強度過大,會引起幼仔產(chǎn)生厭倦;強度過小,不被幼仔感知,適宜的香氣強度有待進一步深入探究。

3.2 HS-SPME-GC-MS法的關(guān)鍵技術(shù)節(jié)點

曾用50/30μm DVB/CAR/PDMS的SPME纖維頭對奶粉A和奶粉B的復原乳(1.0g奶粉加5mL去離子水混勻)在50℃ HP-SPME預處理1h,經(jīng)DB-5MS型毛細管色譜柱內(nèi)置于QP2010Plus型的GC-MS聯(lián)用儀分析,奶粉A中測出的VOCs有46種、香氣成分14種;奶粉B中測出的VOCs僅有6種、香氣成分也為6種[14]。本文又用75μm CAR/PDMS的SPME纖維頭對這兩種奶粉的原粉(2.0g)70℃和80℃ HP-SPME行預處理1h,經(jīng)HP-INNOWax型毛細管色譜柱內(nèi)置于Agilent 7890B-5977B型的GC-MS聯(lián)用儀分析,奶粉A中測出的VOCs多達102種,香氣成分58種;奶粉B中測出的VOCs 73種,香氣成分也有40種?？梢姴煌腟PME纖維頭類型、供測樣品氣味強度、HP-SPME溫度、毛細管色譜柱類型、GC-MS聯(lián)用儀的生產(chǎn)廠家和新舊程度、譜庫是否為最新版本、自動檢索還是人工檢索等關(guān)鍵技術(shù)節(jié)點的差異都有不同的測試結(jié)果。此外,HP-SPME時長、不同的程序升溫、毛細管色譜柱長度、解吸時間長短、檢測器的靈敏性高低等也是影響測試結(jié)果的關(guān)鍵技術(shù)節(jié)點。

3.3 應用建議

根據(jù)圈養(yǎng)大熊貓乳汁的青腥氣突出[18]和本次奶粉香氣的品評結(jié)果,在不比較奶粉A和奶粉B營養(yǎng)價值高低的前提下,僅就主要香氣韻調(diào)而言,大熊貓幼仔在日齡較小時以補飼奶粉B為好,因為奶粉B的主要香氣韻調(diào)不復雜,奶腥氣突出,與母乳的主體香氣韻調(diào)近似;在日齡較大時補飼奶粉A較好,因為奶粉A的香氣韻調(diào)較多,可訓練幼仔對食物中多種香氣韻調(diào)的嗅覺感知和大腦認知,有助于幼仔斷奶后憑借熟知的氣味記憶對食物氣味信息做出判斷,決定是否采食或采食多少,可供制定奶粉A和奶粉B補飼大熊貓幼仔的先后順序時參考。

奶粉A和奶粉B通過電子鼻測試,從響應曲線、雷達圖、主成分分析、線性判別分析以及載荷分析得知,這兩種奶粉的氣味物質(zhì)類別、整體氣味信息等存在差異。應用電子鼻技術(shù)能準確識別這兩種奶粉的整體氣味信息差異,可用于摻假和溯源的快速鑒別檢測。

在調(diào)制大熊貓幼仔專用誘食劑(仿制大熊貓乳源性化學信息素)時,若按從食物中來的成分,可添加到食品中去,表4中的70種不同香氣成分均可作為單體香原料用于調(diào)制產(chǎn)品,除3,5-辛二烯-2-酮、乙酸-2-乙基己酯、苯乙烯外,其它香氣成分均有國際上認可的、經(jīng)過食品安全性試驗或評估的FEMA編號。我國食品安全國家標準——《食品添加劑使用標準》(GB 2760-2014)中未允許在食品中添加使用的順式-2-戊烯-1-醇、苯甲醇、5-甲基-2-呋喃甲醇、1-羥基-2-丙酮、3,5-辛二烯-2-酮、甲酸辛酯、乙酸-2-乙基己酯、1,6-己內(nèi)酰胺共8種單體呈香物質(zhì),因此應嚴格遵照國家有關(guān)法規(guī)和標準的要求,酌情酌量、有針對性地篩選和應用。