劉媛媛 綜述，王建功 審校

063000河北 唐山， 唐山市人民醫(yī)院 腫瘤綜合治療一科

肺癌是世界范圍內(nèi)患病人數(shù)及癌癥相關(guān)死亡人數(shù)最多的癌種[1]。最新的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，我國肺癌在所有癌癥中發(fā)病率居首位，且發(fā)病率逐漸升高[2]。多個大型研究(如IPASS、NEJ002、OPTIMAL、LUX-Lung3和LUX-Lung6等)使得第一、二代表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)成為一線治療表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)敏感突變型非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的標準藥物，但最終仍不可避免地出現(xiàn)耐藥問題，其中T790M突變是發(fā)生頻率最高也是研究最多的耐藥突變，針對此突變研制出以奧希替尼為代表的第三代EGFR-TKIs。AURA3研究[3-4]結(jié)果顯示奧希替尼二線治療獲得性T790M突變的患者，其無進展生存期(progression-free survival,PFS)對比傳統(tǒng)含鉑雙藥治療為10.1個月vs4.4個月，總生存期(overall survival,OS)為26.8個月vs22.5個月。而FLURA Ⅲ期研究[5-6]結(jié)果顯示奧希替尼一線治療對比標準一代EGFR-TKIs(吉非替尼、厄洛替尼)治療局部晚期或轉(zhuǎn)移性EGFR突變型NSCLC，其PFS顯著延長 (18.9個月vs10.2個月)，OS則為38.6個月vs31.8個月。雖然研究數(shù)據(jù)顯示出了奧希替尼的優(yōu)越性，但最終也仍無可避免地出現(xiàn)耐藥問題。

近年來出現(xiàn)的第三代EGFR-TKIs數(shù)量較多，如：Nazartinib(EGF816)，Olmutinib(HM61713)，Naquotinib(ASP8273)，Osimertinib(奧希替尼)，WZ4002, Roceletinib等，但被FDA及國家藥品監(jiān)督管理局雙批準的只有奧希替尼。且WZ4002和Roceletinib是目前基本上已經(jīng)處于完全終止申報程序的EGFR-TKIs，故本文主要以奧希替尼為第三代EGFR-TKIs代表性藥物進行相關(guān)綜述。EGFR-TKIs的耐藥機制十分復雜，具有顯著的瘤間和瘤內(nèi)異質(zhì)性，大體分為EGFR相關(guān)性耐藥機制：EGFR再突變、T790M減少或缺失、EGFR擴增;EGFR非相關(guān)性耐藥機制：間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化(mesenchymal-epithelial transition,MET)、人表皮生長因子受體2 (human epidermal growth factor receptor 2,HER2) 擴增、RAS突變、BRAF突變、磷酸酰肌醇-3-激酶突變、磷酸酶和張力蛋白類似物 (phosphatase and tensin homolog,PTEN) 缺失、成纖維細胞生長因子受體 (fibroblast growth factor receptor,FGFR) 通路異常、細胞表型轉(zhuǎn)化、細胞周期基因改變、致癌基因融合、Bcl-2樣蛋白11缺失多態(tài)性、極光激酶A(aurora kinase A,AURKA)的激活、Src通路激活與整合素、AXL的激活、氧化供能途徑的改變、肝配蛋白A型受體2 (EPH receptor A2,EPHA2) 過表達等。現(xiàn)就上述機制及相關(guān)治療策略研究進展進行綜述，分述如下：

1 EGFR相關(guān)性耐藥機制及治療策略研究進展

1.1 EGFR再突變

1.1.1 C797S突變EGFR第20號外顯子797位點上的絲氨酸被半胱氨酸取代而發(fā)生錯義突變時被稱為C797S突變。體外實驗首次觀察到C797S突變是在人源性EGFR突變細胞系長期暴露于WZ4002的情況下發(fā)生的[7]。奧希替尼作為一線治療時，C797S突變的頻率為7%，是僅次于MET擴增的第二種耐藥機制[8]；而對二線使用奧希替尼后進展的患者進行檢測時發(fā)現(xiàn)C797S突變頻率居于耐藥機制首位，占比14%[9]。研究[10-11]發(fā)現(xiàn)T790M和C797S位置不同則耐藥不同，后續(xù)治療也有差異：1) 當T790M與C797S為順式結(jié)構(gòu)即位于同一等位基因時，第一、三代EGFR-TKIs聯(lián)合或單藥使用無效，而目前正在研究中的第四代EGFR-TKIs[12]可能對此突變有效；2) 當T790M與C797S為反式結(jié)構(gòu)即位于不同等位基因時，對第三代EGFR-TKIs耐藥，而對第一、三代EGFR-TKIs聯(lián)合使用敏感。NSCLC小鼠模型(L858R/T790M/C797S突變)的體外實驗[13]顯示，EAI045(第四代變構(gòu)抑制劑)與西妥昔單抗聯(lián)合使用可以有效防止EGFR二聚化，但是EAI045與西妥昔單抗聯(lián)合使用的效果、副反應的嚴重程度等仍需要進一步研究證實；此外，有文獻[14]指出布加替尼(ALK抑制劑)對L858R/T790M/C797S突變有抑制作用。

1.1.2 其他罕見突變

1.1.2.1 L718突變 L718殘基位于EGFR激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點上，該殘基可發(fā)生L718Q、L718V兩種突變，突變的產(chǎn)生可以導致空間結(jié)構(gòu)變異，進而阻礙奧希替尼與EGFR的結(jié)合。文獻報道[15]，一位71歲老年晚期女性肺腺癌患者在使用奧希替尼治療13個月后出現(xiàn)L718Q突變。且EGFR/T790M/L718Q對所有TKIs耐藥，但當為雙突變體即L718Q突變與T790M不同時出現(xiàn)時，則對奧希替尼、吉非替尼和阿法替尼相對敏感。另外，L718殘基突變在大多數(shù)情況下并不存在C797突變，這提示L718突變導致的耐藥機制可能是獨立存在的。目前已有文獻指出L718突變在T790M突變消失的前提下，可能對第一、二代TKIs敏感[16]。

1.1.2.2 G796突變 G796突變包括G796D/S/R三種突變。其中，Ou等[17]的研究第一次指出奧希替尼治療耐藥后出現(xiàn)G796S/R前沿突變，并表明G796位于奧希替尼芳環(huán)下方，當L718殘基或G796殘基發(fā)生突變時則會使這兩種殘基與奧希替尼的溶劑前芳環(huán)共同形成的“疏水三明治”的作用失效，從而使奧希替尼與激酶結(jié)構(gòu)域的結(jié)合失效，最終導致耐藥。Zheng等[18]的研究發(fā)現(xiàn)了G796D突變，此突變與奧希替尼的復合物結(jié)構(gòu)模擬顯示,突變的G796殘基的側(cè)鏈會和奧希替尼的分子表面發(fā)生碰撞，導致結(jié)合親和力的降低或喪失。這一現(xiàn)象則可能為下一代抑制劑提供新的研究方向。

1.1.2.3 L792突變 Chen等[19]的研究顯示L792F/H/Y突變可影響奧希替尼苯環(huán)上的甲氧基群，進而對奧希替尼產(chǎn)生耐藥性，并指出L792突變與C797S的耐藥機制具有相似作用。而Zhang等[20]則從體內(nèi)和體外分別研究了L792H以及G796R突變，結(jié)果顯示這兩種突變與L858R/T790M均為順式突變，無論EAI045單藥還是EAI045與西妥昔單抗聯(lián)合使用均療效甚微，但奧希替尼與西妥昔單抗聯(lián)合使用時，L792H突變體的50%生長抑制濃度值有所降低，除此之外，多西紫杉醇單藥表現(xiàn)出強烈的抑制突變細胞增殖的現(xiàn)象，但是是否有效，仍需要大量的基礎(chǔ)及臨床實驗證實。

1.1.2.4 G724突變 G724S突變[21]發(fā)生在EGFR激酶的ATP結(jié)合環(huán)內(nèi)，通過改變蛋白結(jié)構(gòu)等導致EGFR-TKIs耐藥。有文獻表明[22]，阿法替尼在體外成功地克服了G724S介導的奧希替尼的抗性。為明確該突變的具體影響，還需要對耐藥機制開展更多更深入的研究。

除了上訴罕見突變，V802F[17]、P794S[19]、F795C[23]、L747P[24]、G719A、S768I[25]、V834L、C620W、H870R、P596L[26]等其他罕見突變也有相關(guān)文獻報道。

1.2 T790M減少或缺失

Le等[26]的研究發(fā)現(xiàn)了T790M缺失與保留的病例中耐藥機制的不同。當突變?nèi)笔r，耐藥機制主要表現(xiàn)為非EGFR依賴通路；而在突變保留的病例中，耐藥性則主要表現(xiàn)為EGFR三級突變或旁路信號通路激活。Niederst等[7]提出當T790M突變?nèi)笔r，第一代EGFR-TKIs可能將重新發(fā)揮療效。而Oxnard等[27]則認為T790M突變?nèi)笔Р⒉灰馕吨俅螌Φ谝淮鶨GFR-TKIs敏感，而可能是競爭性耐藥突變的過度生長所致。另外，還指出耐藥時間與耐藥機制的相關(guān)：早期耐藥往往與T790M缺失有關(guān)，晚期耐藥與EGFR三級突變有關(guān)。研究指出T790M缺失時往往中位生存期偏短。當T790M突變?nèi)笔也话橛衅溆嗤蛔儠r，細胞毒藥物可能是一種治療方式。

1.3 EGFR擴增

EGFR擴增機制除了耐藥后EGFR-ex19del等位基因拷貝數(shù)增加外，還有EGFR野生型等位基因的擴增。Kim等[28]的研究發(fā)現(xiàn)在奧希替尼治療后的腫瘤組織中EGF mRNA的表達增加8倍，而且在H1975細胞中EGF表達水平約為親本細胞的4.5倍，并對奧希替尼產(chǎn)生耐藥性。上述結(jié)果提示臨床工作者在治療期間且患者知情時，可動態(tài)檢測EGF的變化，以便及時了解是否出現(xiàn)耐藥性、調(diào)整治療方案。

2 EGFR非相關(guān)性耐藥機制及治療策略研究進展

2.1 MET和HER 2擴增

Papadimitrakopoulou等[9]在2018年發(fā)表的文獻中指出，MET擴增是奧希替尼二線治療后第二種常見的耐藥機制，占比19%，HER2擴增占比5%；而在FLAURA研究[8]中，MET和HER2擴增分別占耐藥機制的15%、2%。體內(nèi)外實驗顯示克唑替尼、曲妥珠單抗T-DM1單藥或聯(lián)合奧希替尼；奧希替尼與MET抑制劑PF02341066或SGX523聯(lián)合；卡馬替尼和阿法替尼聯(lián)合使用均在一定程度上對抑制MET擴增有效[29-32]。另外，2019年在AACR年會上公布的Ⅰb期TATTON研究[33]的2個研究隊列的中期結(jié)果顯示，奧希替尼聯(lián)合沃利替尼在經(jīng)第三代EGFR-TKIs治療出現(xiàn)MET擴增的EGFR突變型NSCLC患者中顯示出可接受的安全性和初步的抗腫瘤療效。針對此聯(lián)合方案的Ⅱ期SAVANNAH臨床研究正在進行。研究[34]表明曲妥珠單抗對攜帶HER2突變的肺癌患者療效不大，但阿法替尼聯(lián)合西妥昔單抗可延緩HER2擴增導致的疾病進展。

2.2 RAS突變、BRAF突變

RAS/RAF/MEK/ERK是EGFR重要的下游通路之一，其發(fā)生突變或異常激活均可以導致EGFR-TKIs耐藥。Eberlein等[35]對奧希替尼耐藥的PC9和/或NCI-H1975細胞系進行耐藥機制檢測，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)母細胞瘤RAS病毒癌基因同源物(neuroblastoma RAS viral oncogene homolog,NRAS)E63K突變，野生型NRAS及鼠類肉瘤病毒癌基因(Kirsten rat Aarcoma viral oncogene homolog,KRAS)拷貝數(shù)的增加；同時發(fā)現(xiàn)奧希替尼與selumetinib (MEK抑制劑) 聯(lián)合使用可以延緩或防止耐藥性的發(fā)生。FLAURA研究[8]中顯示BRAF突變占耐藥機制的3%。研究[36]發(fā)現(xiàn)奧希替尼耐藥后，BRAF V600E抑制劑Enorafenib (LGX818) 與奧希替尼聯(lián)合使用可抑制耐藥細胞的集落形成，但LGX818單藥療效較差。

2.3 PIK3CA突變、PTEN缺失

AURA和FLAURA研究均已證實PIK3CA突變是奧希替尼的耐藥機制之一，已知的耐藥突變大致包括：E545K、E453K、E542K、R88Q、N345K、E418K和H1047R，其中以E545K最具代表性，發(fā)生頻率為4%[8-9, 26-27, 37-38]。PIK3CA突變可與HER2、MET以及EGFR等突變同時出現(xiàn)，但當同時存在時患者的PFS縮短，是較差的預后因素。PTEN基因可以負向調(diào)控PI3K/AKT信號通路，當其功能喪失時可通過增加PIP-3[磷脂酰肌醇-(3，4，5)-三磷酸]，導致AKT過度激活，最終產(chǎn)生耐藥性。To等[39]的實驗提示羅格列酮-氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR γ)激動劑可以增加PTEN的表達并抑制AKT的激活、誘導PTEN缺失的細胞自噬，從而對吉非替尼增敏。根據(jù)以上研究，推測PPARγ激動劑可以減少第三代EGER-TKI耐藥的發(fā)生。

2.4 FGFR信號通路

Kim等[28]對奧希替尼耐藥的患者腫瘤組織進行檢測，觀察到局部的FGFR1擴增和堿性成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF2) mRNA的表達增加；同樣，在建立的相應的HCC4006AR1-2細胞(747～749氨基酸缺失且對奧希替尼耐藥性的NSCLC細胞)中，也發(fā)現(xiàn)FGFR1和FGF2mRNA表達水平高于親本細胞；此外，這些細胞表現(xiàn)出對選擇性FGFR1抑制劑 (PD173074和BGJ398) 的敏感，然而，F(xiàn)GF2的補充劑在EGFR突變的NSCLC細胞中則對奧希替尼具有耐藥性。

2.5 細胞表型轉(zhuǎn)化及治療策略研究進展

2.5.1 細胞類型轉(zhuǎn)化 Lee等[40]在21例晚期EGFR突變型肺腺癌中選取符合條件的4例患者，并對其在不同時間點獲取的腫瘤組織進行測序，結(jié)果表明視網(wǎng)膜母細胞瘤基因(retinoblastomal,RB1)和p53的完全失活與小細胞肺癌的轉(zhuǎn)化相關(guān)，并在克隆早期即以分化出來，且載脂蛋白Bm RNA編輯酶突變，催化多肽樣誘導在小細胞轉(zhuǎn)化分支中為常見突變。Ham等[41]的病例報道中兩名非吸煙、奧希替尼治療后肺腺癌轉(zhuǎn)化為小細胞肺癌的女性患者，在經(jīng)過依托泊苷聯(lián)合卡鉑的治療后，腫瘤明顯縮小。但基因測序顯示這兩名患者并沒有出現(xiàn)RB1的丟失。這一發(fā)現(xiàn)與之前的結(jié)論相左，提示我們需要進一步的研究來更好地理解此種耐藥機制。Roca等[42]匯總了肺腺癌患者經(jīng)EGFR-TKIs治療后出現(xiàn)肺鱗癌轉(zhuǎn)化的病例，分析顯示至肺鱗癌發(fā)病的中位時間為11.5個月，而診斷鱗癌后中位生存期為3.5個月。至今尚未有治療轉(zhuǎn)化鱗癌有效的報道。

2.5.2 上皮間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT) EMT已被多個研究證實為EGFR-TKIs的耐藥機制之一，分子層面主要為上皮細胞連接蛋白E-cadherin等的減少或消失、間質(zhì)標記物波形蛋白等的增加。EMT使得TKIs耐藥的機制大致為[43]：1)腫瘤微環(huán)境通過釋放TGF-β、細胞因子等介導EMT效應導致耐藥；2)信號通路介導EMT效應導致耐藥，如：SRC信號通路、Notch信號通路、Hedgehog信號通路、Hippo信號通路、IGF1R信號通路等；3)表觀遺傳調(diào)控EMT導致耐藥，如：DNA甲基化、組蛋白翻譯后修飾等。Weng等[44]研究發(fā)現(xiàn)JMF3086(組蛋白脫乙?；负?-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶雙重抑制劑)可以逆轉(zhuǎn)EMT恢復奧希替尼的敏感性。此外，一些細胞毒劑，如：順鉑、吉西他濱、依托泊苷、長春瑞濱對間充質(zhì)表型的細胞敏感。

2.6 細胞周期基因改變及治療策略研究進展

AURA3和FLAURA研究均已表明細胞周期基因的改變是奧希替尼耐藥機制中的一種，其發(fā)生的頻率分別為11%、12%，包括CCND1/2、CCNE1、CDK4/6擴增以及CDKN2A的丟失。研究[26]顯示當細胞周期基因改變時，PFS更短，對比為4.4個月vs18.8個月。

2.7 致癌基因融合及治療策略研究進展

AURA3、FLAURA研究表明致癌基因融合可能是第三代抑制劑奧希替尼的耐藥機制，分別為：FGFR3-TACC3基因融合、NTRK1-TPM3基因融合、RET-ERC1基因融合、SPTBN1-ALK基因融合。另外已報道的致癌基因融合還包括[27,45]：CCDC6-RET、NCOA4-RET、TRIM24-RET、GOPC-ROS1、AGAP3-BRAF、ARMC10-BRAF、DOCK4-BRAF、Eps15-BRAF、GHR-BRAF、AGK-BRAF、ESYT2-BRAF、SALL2-BRAF、PLEKHA7-ALK、EML4-ALK、EGFR-FGFR1等。Piotrowska等[46]的研究顯示奧希替尼與BLU-667(Ret抑制劑)聯(lián)合使用可以在一定程度上克服CCDC6-RET融合帶來的耐藥性。Offifin等[47]指出當出現(xiàn)EML4-ALK基因融合時，奧希替尼與克唑替尼聯(lián)合使用可以延緩疾病的進展。

2.8 BIM缺失多態(tài)性及治療策略研究進展

Bcl-2樣蛋白11簡稱BIM，是Bcl-2蛋白家族中的一種。研究表明低表達水平的BIM可使突變的肺癌細胞降低對EGFR-TKIs的敏感性，而BIM蛋白缺失多態(tài)性則可導致奧希替尼耐藥。研究者[48]在PC-9細胞系中已證實組蛋白去乙酰化酶抑制劑-vorinostat與奧希替尼聯(lián)合使用可以治療此耐藥機制。目前正在開展多種Bcl-2小分子抑制劑的研究，如[49]：ABT-199(venotclax)、ABT-737、ABT-263(navitoclax)。

2.9 AURKA的激活及治療策略研究進展

極光激酶是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，是控制細胞周期的重要酶，可分為A、B、C三種類型，其中AURKA可促進DNA修復、細胞遷移及侵入，從而導致腫瘤的發(fā)生及進展。AURKA可以被其上游非洲爪蟾驅(qū)動類似的蛋白2(Xenopus kinesin-like protein 2,XKLP2)的靶向蛋白(targeting protein for XKLP2,TPX2)的過表達激活，進一步導致EGFR-TKIs耐藥。Shah等[50]的研究指出,無論體內(nèi)外，AURKA抑制劑與奧希替尼聯(lián)合使用均可以誘導細胞凋亡，協(xié)同抑制獲得性耐藥細胞的生長。進一步的探索表明，聯(lián)合用藥的有效機制可能為獲得性耐藥細胞通過將促凋亡機制的控制從單獨的EGFR轉(zhuǎn)移到EGFR和AURKA，進而來逃避EGFR的抑制。這一發(fā)現(xiàn)提示TPX2或許可以作為EGFR-TKIs和AURKA抑制劑聯(lián)合治療EGFR突變型肺腺癌患者療效的生物標志物。

2.10 Src通路激活與整合素及治療策略研究進展

Ichihara等[51]用PC-9/BRc1細胞系進行研究，結(jié)果表明，Src家族激酶(SFK)基因中的YES1的擴增可導致奧希替尼的耐藥性；且發(fā)現(xiàn)同時抑制SFK/FAK和EGFR可能是一種有效的治療EGFR突變肺癌的策略。在尋求最佳治療方式時顯示，奧希替尼與達沙替尼的聯(lián)合治療在抑制腫瘤生長方面是最有效的。Seguin等[52]發(fā)現(xiàn)整合素αvβ3可通過形成整合素-kras復合物導致EGFR-TKIs耐藥，但目前整合素相關(guān)治療仍在實驗中。

2.11 AXL的激活及治療策略研究進展

AXL是一種受體酪氨酸激酶，研究表明活化的AXL與EGFR、HER3在誘導奧希替尼耐藥性方面存在相關(guān)性。在EGFR突變的NSLCL細胞中，通過激活AXL-AKT軸，下調(diào)SPRY4使得對奧希替尼產(chǎn)生耐藥性，但是這一通路的確切機制尚不清楚。但研究[53]證實AXL抑制劑與奧希替尼在治療初始或耐受階段聯(lián)合使用可增加腫瘤細胞對EGFR-TKIs的敏感性，從而減少腫瘤大小并延緩腫瘤的生長。

2.12 氧化供能途徑的改變及治療策略研究進展

在癌癥中存在Warburg效應，即大多數(shù)癌癥類型表現(xiàn)出增強的糖酵解。然而，目前學術(shù)界認為癌癥細胞中的糖酵解不僅僅是一種通過ATP產(chǎn)生額外能量的機制，而是獲得關(guān)鍵細胞成分所必需的途徑。研究表明，奧希替尼可以有效抑制敏感細胞中的糖酵解，然而當腫瘤細胞對奧希替尼產(chǎn)生耐藥時則會通過氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OxPhos)途徑獲取能量，此時細胞對OxPhos抑制劑的敏感性增加。體外實驗證實[54]，OxPhos抑制劑與奧希替尼聯(lián)合使用可以延緩或阻止耐藥性的發(fā)生。但進一步的體內(nèi)實驗則宣告失敗，這提示腫瘤微環(huán)境可能在這一過程發(fā)揮作用。

2.13 EPHA2過表達氧化供能途徑的改變及治療策略研究進展

EPHA2屬于受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)中最大的家族，EPH RTK與其配體結(jié)合后，能夠激活多種下游信號通路，包括RAS/MAPK、PI3K/AKT和RHO/RAC。EPHA2在EGFR突變型肺癌中高表達，并在EGFR-TKIs產(chǎn)生獲得性耐藥的EGFRL858R+T790M突變型細胞中進一步過表達，從而促進腫瘤的生長。EPHA2的小分子抑制劑ALW-Ⅱ-41-27能夠有效降低奧希替尼耐藥細胞的存活率。這一實驗[55]結(jié)果提示EPHA2可能成為TKI耐藥腫瘤的有效治療靶點。

3 總 結(jié)

第三代EGFR-TKIs的耐藥機制已有所研究，但仍存在大量未知的耐藥問題，研究表明耐藥機制因用藥時機的不同而有所差異。雖然目前針對各種耐藥機制已有臨床及臨床前相關(guān)藥物研究，但因其具體療效尚不清楚，導致患者耐藥后下一步的治療也尚無標準方案。因此探討更加合理的用藥時機、尋找更多的潛在耐藥機制仍是未來腫瘤醫(yī)學的主要研究方向，以期為患者制定出更加個性化、合理化的治療策略。

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