朱麗華，周蕾，羅斌，歐陽怡然，范瑞，陸恩昊，李和根，田建輝

200032 上海，上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院 腫瘤科(朱麗華、周蕾、羅斌、歐陽怡然、范瑞、陸恩昊、李和根、田建輝)；200032 上海，上海市中醫(yī)藥研究院 中醫(yī)腫瘤研究所(田建輝)

肺癌是世界范圍內(nèi)癌癥死亡率最高的惡性腫瘤，2018年全球有176萬人死于肺癌，占癌癥總死亡率的18.4%[1]。肺癌中80%左右的患者為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer， NSCLC)[2]，Ⅰ～Ⅲa期NSCLC患者首選手術(shù)治療，但總體5年生存率仍僅為23%[3]。手術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的關(guān)鍵。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTC) 被認(rèn)為是“轉(zhuǎn)移的種子”，原發(fā)腫瘤形成的CTC通過血液循環(huán)進(jìn)一步播散至遠(yuǎn)處器官，最終定植并增殖[4]。惡性腫瘤患者通常都存在凝血功能異常[5-6]，高凝狀態(tài)與腫瘤的形成、轉(zhuǎn)移等存在密切關(guān)系[7]。臨床研究發(fā)現(xiàn)血液高凝狀態(tài)可能促進(jìn)了胃癌CTC的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[8],在肝癌、肺癌中也有凝血功能障礙促進(jìn)CTC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的報道[9-10]。因此本研究將通過來自于臨床的NSCLC患者病例資料，分析CTC表達(dá)與NSCLC臨床特征及其與血小板(platelet,PLT)、凝血酶原時間(prothrombin time,PT)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time,APTT)、凝血酶時間(thrombin time,TT)、纖維蛋白原(fibrinogen,FIB)、纖維蛋白降解產(chǎn)物(fibrin degradation products,FDP)、D-二聚體(D-dimer,D-D)等凝血功能的關(guān)系，探索CTC與NSCLC凝血功能狀態(tài)、轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)

本研究依據(jù)國家衛(wèi)生部發(fā)布的《中國原發(fā)性肺癌診療規(guī)范(2015)》中原發(fā)性支氣管肺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]。肺癌分期標(biāo)準(zhǔn)采用國際肺癌研究學(xué)會(International Association for the Study of Lung Cancer，IASLC)2009年修訂的第7版TNM分期[12]。

1.2 病例來源

研究對象來源于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院(189例)、上海市胸科醫(yī)院(44例)、上海市第六人民醫(yī)院(11例)、上海市華東醫(yī)院(14例)、上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院(26例)住院或門診患者。上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院倫理委員會已批準(zhǔn)此項研究(批件號：SHDC1201611)。

1.3 一般資料

課題組納入了2016年3月至2019年3月收治的NSCLC患者284例，其中男性163例(57.4%)，女性121例(42.6%)；中位年齡63歲(范圍：28～83歲)；病理類型中，腺癌219例(77.1%)、鱗狀細(xì)胞癌46例(16.2%)、腺鱗癌5例(1.8%)、大細(xì)胞癌8例(2.8%)、其他類型6例(非小細(xì)胞2例、低分化神經(jīng)內(nèi)分泌癌2例、淋巴上皮瘤樣癌1例、肉瘤樣癌1例)；依據(jù)IASLC第七版TNM分期為Ⅰb期73例(25.7%)、Ⅱa期33例(11.6%)、Ⅱb期47例(16.5%)、Ⅲa期49例(17.3%)、Ⅲb期14例(4.9%)、Ⅳ期68例(23.9%)(表1)。

表1 非小細(xì)胞肺癌患者臨床特征分布Table 1. Clinical Characteristics of Patients with NSCLC

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.1 CTC檢測方法 所有標(biāo)本均由本院腫瘤研究所專業(yè)人員完成，雙人核對。1)采集的血液在24 h內(nèi)完成 CD45磁珠富集去除白細(xì)胞。具體操作方法參照有關(guān)文獻(xiàn)[13-14]。經(jīng)免疫磁珠陰性法富集后，開始染色體原位雜交，利用8號染色體著絲粒探針標(biāo)記細(xì)胞[15],免疫熒光染色后再進(jìn)行復(fù)染；2)CTC計數(shù)：CTC陽性標(biāo)準(zhǔn)，通過雜交信號判斷是否存在超二倍體細(xì)胞，8號染色體拷貝數(shù)為2個(綠色熒光標(biāo)記探針)，判定為正常細(xì)胞(二倍體細(xì)胞)；拷貝數(shù)為>2個，判定為腫瘤細(xì)胞(超二倍體細(xì)胞)。CTC計數(shù)≥2個，定義為CTC陽性[16]。

1.4.2 血小板及凝血功能檢查方法 由醫(yī)院檢驗科生化實驗室專業(yè)人員檢測，抽取研究病例晨空腹肘靜脈血4 mL，PLT、PT、APTT、TT、FIB、FDP、D-D通過自動血細(xì)胞分析儀及配套設(shè)備。

1.5 統(tǒng)計方法

2 結(jié) 果

2.1 CTC與NSCLC患者臨床特征的關(guān)系

CTC陽性組與陰性組在性別、年齡、有否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的構(gòu)成上無顯著差異；兩組在病理類型構(gòu)成上差異顯著，腺癌陽性率78.1%，鱗狀細(xì)胞癌陽性率60.1%，腺鱗癌40%，大細(xì)胞癌62.5%，腺癌患者的陽性率高于其他類型(P<0.05)；不同的TNM分期，CTC陽性組與陰性組構(gòu)成差異顯著(P<0.05)(表2、圖1)。

表2 非小細(xì)胞肺癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞表達(dá)與臨床特征的關(guān)系Table 2. Association of Clinicopathologic Features with CTC Expressions

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圖1 不同TNM分期CTC表達(dá)變化Figure 1. CTC Expressions in Different TNM Stages of NSCLCThe CTC positive rate was 69.9% in stage Ⅰb NSCLC, 62.5% in stage Ⅱ NSCLC, 84.1% in stage Ⅲ NSCLC and 80.9% in stage Ⅳ NSCLC. The CTC positive rates in stage Ⅲ NSCLC and stage Ⅳ NSCLC were higher than those in stage Ⅰb NSCLC or stage Ⅱ NSCLC (P=0.012).

2.2 CTC與NSCLC患者臨床特征的二元Logistic回歸分析

二元Logistic回歸模型在調(diào)整了性別、年齡、病理類型、TNM分期等因素后，發(fā)現(xiàn)TNM分期與外周血CTC陽性表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05；95%CI: 1.034～1.708)，提示隨著TNM分期增高，患者的外周血CTC陽性率顯著增加。在病理類型方面，與腺癌相比，其他病理類型的患者外周血CTC陽性率顯著降低(P<0.05，95%CI: 0.481～0.894)，提示本研究中腺癌患者外周血CTC陽性率更高(表3)。

表3 非小細(xì)胞肺癌患者臨床特征與CTC陽性表達(dá)的二元Logistic回歸模型分析Table 3. Analysis of Clinical Characteristics and CTC Levels by Binary Logistic Regression Model

2.3 CTC與血小板、凝血功能的關(guān)系

本研究中血小板、凝血功能指標(biāo)均不滿足正態(tài)分布，采用非參數(shù)檢驗。CTC陽性組與CTC陰性組之間PLT、D-D、FDP、FIB、TT、APTT差異無統(tǒng)計學(xué)意義；CTC陽性的肺癌患者的PT水平顯著低于CTC陰性肺癌患者(P<0.05)，提示PT與CTC可能存在一定聯(lián)系(表4)。

表4 CTC陽性組與CTC陰性組凝血指標(biāo)中值的比較[M (IQR)]Table 4. Coagulation Indicators of Patients with Different CTC Expressions [Median (IQR)]

2.4 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與血小板、凝血功能的關(guān)系

有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的NSCLC患者FDP、FIB、PT水平均顯著高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者(P<0.05)，TT水平均顯著低于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)(表5)。

表5 有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者與無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者凝血指標(biāo)中值的比較[M (IQR)]Table 5. Coagulation Indicators of Patients with or without Distant Metastasis [Median (IQR)]

2.5 凝血功能與CTC及轉(zhuǎn)移的相關(guān)性檢驗

經(jīng)相關(guān)性檢驗，CTC陽性表達(dá)率與PT呈負(fù)相關(guān)(r=-0.128，P<0.05)；FDP、FIB、PT與轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P<0.05)，TT與轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)(r=-0.281，P<0.05)；FIB(r=0.163，P<0.05)、PT(r=0.144，P<0.05)與TNM分期呈正相關(guān)，TT與分期呈負(fù)相關(guān)(r=-0.242，P<0.001)。

3 討 論

CTC是一種潛在的腫瘤標(biāo)志物，可以作為“液體活檢”的樣本，與傳統(tǒng)的活組織檢查相比，其具有微創(chuàng)、可反復(fù)檢測等優(yōu)點(diǎn)。研究證實CTC的存在與腫瘤早期轉(zhuǎn)移[17]、療效反應(yīng)[18]及臨床預(yù)后[19]等密切相關(guān)，并且CTC已被納入美國癌癥聯(lián)合會第八版乳腺癌分期系統(tǒng)[20]。在肺癌研究方面，有報道應(yīng)用膜過濾法檢測良性肺部疾病CTC檢出率僅5%，肺癌檢出率高達(dá)90%[21];另一項研究在可手術(shù)切除的肺癌患者中使用CellSearch技術(shù)，檢出肺靜脈中CTC陽性率為48%[22]，提示CTC檢測在肺癌中具有一定敏感性。本研究應(yīng)用免疫磁珠陰性富集法檢測多中心、較大樣本量的NSCLC患者外周血CTC，發(fā)現(xiàn)284例中有209例患者CTC檢出陽性，檢出率為73.6%。

3.1 CTC在NSCLC中的表達(dá)規(guī)律

本研究結(jié)果顯示CTC陽性率與NSCLC臨床TNM分期相關(guān)，而在不同年齡、性別的患者中差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其中Ⅰb期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者CTC陽性率分別為69.9%、62.5%、84.1%、80.9%，Ⅲ期、Ⅳ期患者的CTC陽性率顯著高于Ⅰb期、Ⅱ期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示隨著NSCLC分期越晚，CTC陽性表達(dá)率越高。秦子敏等[23]同樣應(yīng)用陰性免疫磁珠富集法檢測87例肺癌患者，發(fā)現(xiàn)Ⅲ+Ⅳ期患者CTC水平顯著高于Ⅰ+Ⅱ期患者。Zhang等[24]應(yīng)用陽性免疫磁珠富集法檢測了91例肺癌患者，Ⅲ期檢出率為25%、Ⅳ期為69.3%；本研究與國內(nèi)外文獻(xiàn)報道相符，從圖1可以看出Ⅲ期、Ⅳ期NSCLC的CTC顯著升高，進(jìn)一步說明CTC可能與肺癌發(fā)展以及嚴(yán)重程度具有密切聯(lián)系。

其次本研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌患者的CTC陽性率78.1%，高于鱗癌(60.8%)及其他非小細(xì)胞類型，排除TNM分期構(gòu)成的差異，可能與腺癌病例數(shù)(77.11%)較多有關(guān)。曾有研究發(fā)現(xiàn)CTC在表皮生長因子受體突變患者中表達(dá)更高，可能是腺癌檢出率高的原因[25]；也有報道提示，在NSCLC僅腺癌中術(shù)后CTC水平是無進(jìn)展生存(progression-free survival,PFS)的獨(dú)立預(yù)后因素[26]，但在多中心進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量后并未發(fā)現(xiàn)差異[27]。

3.2 晚期肺癌存在高凝狀態(tài)

惡性腫瘤患者通常存在凝血功能障礙[28-29]，在高凝狀態(tài)下極易形成血栓，動靜脈血栓的形成進(jìn)一步增加患者死亡風(fēng)險，且對腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤與轉(zhuǎn)移又有促進(jìn)作用。腫瘤細(xì)胞在其發(fā)生發(fā)展的過程中會通過多種途徑打破機(jī)體凝血與纖溶系統(tǒng)的平衡。首先腫瘤細(xì)胞自身能釋放促凝活性的物質(zhì)如組織因子(tissue factor，TF)、癌促凝物質(zhì)等形成凝血酶原激活物；其次炎性細(xì)胞因子如VEGF、IL-1、TNF-α等，促使纖溶酶原激活物的抑制物在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，加速血液高凝狀態(tài)的形成，共同使機(jī)體處于高凝狀態(tài)。再者腫瘤細(xì)胞會與PLT、內(nèi)皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞相互作用，PLT會釋放出ADP、5-HT、花生四烯酸、黏附蛋白分子等促進(jìn)血液凝固的活性物質(zhì)，進(jìn)一步導(dǎo)致高凝狀態(tài)的形成。

本研究分析了NSCLC患者血漿凝血功能指標(biāo)及血小板，發(fā)現(xiàn)FIB、PT、TT與臨床分期相關(guān)，F(xiàn)IB、PT與分期呈正相關(guān)，TT與分期呈負(fù)相關(guān)。多項研究證實FIB、PT的延長均與肺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)[28,30]。FIB是肝臟合成和分泌的蛋白，含量在所有的凝血因子中最高。血漿FIB水平與腫瘤的病理分期和對治療的反應(yīng)密切相關(guān)，較高的FIB水平可預(yù)測TNM及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且是肺癌的生存期(overall survival,OS)、PFS的預(yù)后危險因素[31]。本研究顯示，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者FDP、FIB延長，TT縮短，說明高凝狀態(tài)有助于促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[32]。

3.3 高凝狀態(tài)增強(qiáng)CTC抵抗能力促進(jìn)轉(zhuǎn)移

正常情況下，單個CTC從原發(fā)性腫瘤進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)后，面臨無數(shù)生存挑戰(zhàn)，例如T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的攻擊、剪切力和氧化應(yīng)激等[33]，然而高凝狀態(tài)的血液可以保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受上述風(fēng)險的侵害[34-36]，可能原因是CTC具有在早期轉(zhuǎn)移過程中啟動凝血激活的潛在作用[37]。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞、血小板和纖維蛋白等聚集形成免疫瘤栓，它可包裹原發(fā)腫瘤細(xì)胞、有助于腫瘤細(xì)胞躲避機(jī)體免疫系統(tǒng)的識別[38-39]，因此凝血系統(tǒng)激活的微環(huán)境，有利于CTC在血管內(nèi)存活，形成轉(zhuǎn)移。研究者們前期在胃癌中發(fā)現(xiàn)血液高凝狀態(tài)可能促進(jìn)了胃癌CTC的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，治療前檢測CTC指標(biāo)對預(yù)測胃癌患者的預(yù)后有重要意義；晚期不可切除胃癌患者CTC與患者高凝狀態(tài)、疾病進(jìn)展相關(guān),可能存在CTC-高凝-轉(zhuǎn)移的惡性循環(huán),積極抗凝及抗腫瘤治療可能阻斷這一惡性循環(huán),改善高凝狀態(tài)減少轉(zhuǎn)移[40]。

本研究中Ⅲb+Ⅳ期患者CTC陽性率為84.1%，顯著高于Ⅰb～Ⅲa期患者(P<0.05)，而Ⅲb+Ⅳ期患者即為N2～N3或M1的患者，即存在縱膈淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，提示有轉(zhuǎn)移的患者CTC陽性率增高。此外我們發(fā)現(xiàn)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M1)的NSCLC患者FDP、FIB延長，TT縮短，存在高凝狀態(tài)，提示高凝狀態(tài)有助于CTC的存活促進(jìn)轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者外周血中CTC指標(biāo)可準(zhǔn)確預(yù)測肺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,而機(jī)體血液處于高凝狀態(tài)下易促使肺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生[41]，影響患者預(yù)后[42]。因此凝血功能異?？赡艽龠M(jìn)NSCLC CTC的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

然而本研究不足之處在于，尚缺乏免疫細(xì)胞的檢測以充分證實免疫系統(tǒng)和凝血功能共同影響CTC轉(zhuǎn)移的作用，其次尚缺乏病例預(yù)后隨訪數(shù)據(jù)，以明確CTC對OS的影響。

綜上所述，CTC與NSCLC TNM分期相關(guān)，CTC表達(dá)陽性患者存在凝血功能異常，高凝狀態(tài)與NSCLC的轉(zhuǎn)移相關(guān)，高凝狀態(tài)可能促進(jìn)CTC的轉(zhuǎn)移。改善高凝狀態(tài)、促進(jìn)CTC清除可能是預(yù)防肺癌轉(zhuǎn)移的有效方法。

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