張軼，賈方，王秋月，崔文靜，王菊勇

200032 上海，上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院 腫瘤研究所

肺癌作為嚴重威脅人類健康的主要公共衛(wèi)生問題之一,2018年全球新發(fā)病例約209萬例，死亡約180萬例，在我國肺癌的發(fā)病與死亡人數(shù)均居惡性腫瘤首位[1-2]。隨著分子診斷技術(shù)的發(fā)展，早期發(fā)現(xiàn)、診斷并接受治療已成為降低肺癌死亡率、延長患者生存期的關(guān)鍵措施。肺癌中最常見的病理類型為肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)，因其早期臨床癥狀不明顯，明確診斷時已屬中晚期，5年生存率不足17%[3-4]。因而從分子水平探尋影響LUAD發(fā)生發(fā)展及預(yù)后生存的新靶點具有重要意義。

惡性腫瘤代謝重編程的主要表現(xiàn)為有氧糖酵解,這種即使在氧氣充足的條件下仍以糖酵解為首要產(chǎn)能途徑的代謝方式在腫瘤細胞的快速生長中起著至關(guān)重要的作用。M2型丙酮酸激酶(pyruvate kinase M2,PKM2)是一種在糖酵解后期過程中起主要作用的限速酶，可催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸并釋放能量[5]，在調(diào)節(jié)細胞代謝活動和腫瘤生長中起著關(guān)鍵作用[6]。臨床研究表明，多種類型癌癥的不良預(yù)后與PKM2過表達相關(guān)，PKM2被認為是肺、胃腸道、卵巢、皮膚、腎和膽管等惡性腫瘤的潛在診斷標(biāo)志物[7-8]。有研究指出，敲除PKM2可抑制人類非小細胞肺癌的發(fā)生并促進凋亡[9]，但目前尚無針對其在LUAD中的臨床預(yù)后和生物學(xué)過程的系統(tǒng)分析。

本研究采用生物信息學(xué)的方法，聯(lián)合基因表達數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus，GEO)、癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)和人類蛋白質(zhì)表達圖譜(Human Protein Atlas，HPA)等癌癥公共數(shù)據(jù)庫，分析PKM2在LUAD中的表達情況及其潛在的臨床預(yù)后意義，為進一步探究LUAD發(fā)生的分子機制和治療靶點提供新思路。

1 資料與方法

1.1 Oncomine和TCGA數(shù)據(jù)庫提取基因數(shù)據(jù)

Oncomine數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org /resource /login.html)是一個基于GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫的生物信息學(xué)分析平臺[10]。本研究首先在Oncomine數(shù)據(jù)庫中檢索PKM2相關(guān)數(shù)據(jù)集，限定條件為：Gene:PKM2；Cancer Type: Lung Adenocarcinoma；Analysis Type: CancervsNormal Analysis； Data Type: all；Gene Summary:P<0.05，F(xiàn)OLD CHANGE>2，GENE RANK=Top 10%；Order By: Over-expression。提取數(shù)據(jù)集中關(guān)于PKM2基因的表達信息，對各基因芯片進行薈萃分析，選擇箱式圖展示結(jié)果。隨后使用基于TCGA數(shù)據(jù)庫的UALCAN平臺(http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)對PKM2在LUAD中的表達結(jié)果進行驗證。

1.2 HPA數(shù)據(jù)庫分析PKM2蛋白表達

HPA數(shù)據(jù)庫(https://www.proteinatlas.org/)利用免疫檢測技術(shù)提供了多種人類蛋白質(zhì)的組織和細胞分布信息，本研究選取PKM2抗體(CAB019421)對正常肺組織和LUAD組織進行的免疫組化實驗結(jié)果進行分析。

1.3 Kaplan-Meier Plotter在線生存分析

在Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(http://kmplot.com/analysis/)的肺癌數(shù)據(jù)集中評估PKM2表達對LUAD患者總體生存時間(overall survival ,OS)的影響，設(shè)置篩選條件如下：Gene symbol:PKM2(Affymeteix ID:201251_at)；Survival: OS；Histology: Adenocarcinoma。

1.4 LinkedOmics臨床病理特征及KEGG分析

LinkedOmics分析平臺(http://www.linkefomics.org)包含TCGA數(shù)據(jù)庫內(nèi)32種癌癥的多組數(shù)據(jù)。進入LinkFinder模塊設(shè)置目標(biāo)腫瘤為“LUAD”，目標(biāo)基因為“PKM2”。選擇Clinical數(shù)據(jù)集，獲取LUAD患者臨床信息；選擇RNAseq的數(shù)據(jù)集，獲取PKM2共表達基因，篩選P<0.001且Statistic>0.4的正相關(guān)表達基因?qū)隡etascape工具進行基因KEGG通路富集分析。

1.5 String-DB蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

String-DB網(wǎng)站(https://string-db.org/)是專門研究已知蛋白和預(yù)測蛋白之間相互作用的在線分析平臺。本研究利用該網(wǎng)站預(yù)測了與PKM2關(guān)系最為密切的10個相互作用蛋白并進行可視化PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

正常肺組織與LUAD中PKM2基因表達差異，使用配對t檢驗進行配對樣本的組間比較，使用Wilcoxon秩和檢驗進行非配對樣品的組間比較；PKM2基因表達與LUAD臨床病理相關(guān)性采用非參數(shù)檢驗；Pearson相關(guān)性檢驗篩選PKM2正相關(guān)表達基因；PKM2表達與LUAD患者OS的關(guān)系采用Kaplan-Meier模型分析。以雙側(cè)檢驗P<0.05被認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PKM2在實體腫瘤和LUAD中的表達情況

Oncomine數(shù)據(jù)庫共檢索出410個關(guān)于PKM2基因在16種惡性腫瘤中表達差異的研究，與正常組織相比，腫瘤組織中PKM2高表達數(shù)據(jù)集53個，低表達數(shù)據(jù)集5個。在肺癌中，PKM2表達上調(diào)的有4個數(shù)據(jù)集，表達下調(diào)的有0個數(shù)據(jù)集(表1)。對該數(shù)據(jù)庫內(nèi)LUAD芯片數(shù)據(jù)進一步統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，自2001年開始共有9項研究、964個樣本涉及PKM2在LUAD與正常組織中的表達，薈萃分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)的8項研究，結(jié)果顯示PKM2在LUAD中所有差異表達基因中的中位數(shù)排名為373，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，提示該基因在LUAD組織中顯著高表達(圖1)。

表1 Oncomine數(shù)據(jù)庫中PKM2在不同腫瘤中的表達情況Table 1. Expression of PKM2 Gene in Different Tumors in the Oncomine Database

圖1 PKM2基因在Oncomine數(shù)據(jù)庫中肺腺癌中的表達Figure 1. Expression of PKM2 in LUAD in the Studies Identified in the Oncomine DatabasePKM2: Pyruvate kinase M2; LUAD: Lung adenocarcinoma.

2.2 PKM2基因在各LUAD芯片中的差異表達結(jié)果

獲取Oncomine數(shù)據(jù)庫內(nèi)不同LUAD研究芯片中PKM2基因的表達數(shù)據(jù)，選取基因差異性表達排序前10%的芯片作箱式圖比較分析。結(jié)果顯示在Selamat、Hou、Beer、Landi、Selamat、Okayama、Su等7個數(shù)據(jù)集研究中，PKM2在LUAD中的表達量顯著高于正常組織，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。 利用UALCAN平臺進一步驗證TCGA數(shù)據(jù)庫中59例正常肺組織與515例LUAD組織中PKM2的差異表達情況，與正常組織相比，PKM2在LUAD組織中表達升高了1.95倍(圖3)。

圖2 Oncomine數(shù)據(jù)庫中PKM2在不同肺腺癌研究芯片中的表達(*P<0.05)Figure 2. Expression of PKM2 mRNA in LUAD Tissues in Different Studies Identified in the Oncomine Database (P<0.05)

圖3 PKM2在TCGA數(shù)據(jù)集肺腺癌患者中的表達情況Figure 3. Expression of PKM2 in LUAD Patients (TCGA)

2.3 PKM2蛋白在LUAD組織和正常組織之間的表達差異

通過HPA數(shù)據(jù)庫中的免疫組化結(jié)果對PKM2在LUAD中的蛋白表達水平進行分析，以驗證上述趨勢，結(jié)果顯示LUAD組織中PKM2蛋白免疫反應(yīng)陽性顯著強于正常肺組織(圖4)。數(shù)據(jù)分析結(jié)果皆顯示PKM2的表達增加有助于LUAD的發(fā)生，表明其在LUAD中扮演促癌基因的作用。

圖4 PKM2蛋白在正常肺組織與肺腺癌組織表達的免疫組化檢測結(jié)果Figure 4. Immunohistochemical Examination for Expression of PKM2 Protein in Normal Lung and LUAD Tissues

2.4 PKM2與LUAD患者預(yù)后的關(guān)系

為明確PKM2表達水平是否對LUAD患者預(yù)后存在影響，本研究獲取Kaplan-Meier Plotter肺癌數(shù)據(jù)庫內(nèi)探針號為201251_at的芯片數(shù)據(jù)，對PKM2高、低表達組各360例的配對樣本進行生存分析，結(jié)果表明PKM2高表達組的OS劣于低表達組，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，HR=2.56, 95%CI:1.99～3.28)，提示LUAD患者預(yù)后不良與PKM2表達水平有關(guān)(圖5)。

圖5 PKM2表達與肺腺癌患者總體生存時間的關(guān)系Figure 5. Relationship between the Expression of PKM2 and the Overall Survival of LUAD Patients

2.5 PKM2表達與LUAD臨床病理特征的關(guān)系

利用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫的LinkFinder功能檢索PKM2基因，發(fā)現(xiàn)PKM2的表達量與LUAD患者的病理分級(圖6A，P=0.011，F(xiàn)DR=0.033，n=507)呈正相關(guān)，與T分期(圖6B，P=0.006，F(xiàn)DR=0.024，n=512)和N分期(圖6C，P=0.004，F(xiàn)DR=0.023，n=501)呈顯著正相關(guān)，而與M分期(圖6D，P=0.363，F(xiàn)DR=0.544，n=371)無關(guān)。

圖6 PKM2基因的表達與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系Figure 6. Correlation between PKM2 Expression and Pathologic Characteristics in LUADA. Correlation between PKM2 expression and pathological grade; B. Correlation between PKM2 expression and T stage; C. Correlation between PKM2 expression and N stage; D. Correlation between PKM2 expression and M stage.

2.6 LUAD中PKM2潛在分子調(diào)控機制的預(yù)測

為進一步預(yù)測PKM2在LUAD惡性進程中可能參與的信號通路，本研究通過LinkedOmics數(shù)據(jù)庫獲得與PKM2表達正相關(guān)基因8 638個(圖7)，進一步篩選出78個基因?qū)隡etascape數(shù)據(jù)分析平臺進行KEGG分析，結(jié)果顯示，LUAD中PKM2正相關(guān)表達基因與糖酵解、癌癥中央碳代謝、HIF-1信號通路、磷酸戊糖途徑、內(nèi)分泌及其他因子調(diào)節(jié)的鈣重吸收、細胞凋亡、IF-17信號通路、甲狀腺激素信號通路和HTLV-1感染等有關(guān)(圖8)。

圖7 PKM2在TCGA肺腺癌數(shù)據(jù)庫中的表達相關(guān)性及正相關(guān)基因熱圖Figure 7. PKM2 Association Result Identified in TCGA Database and the Heat Map of Positively Correlated Genes

圖8 PKM2正相關(guān)基因的KEGG通路富集分析Figure 8. Enrichment Analysis of PKM2 Positively Correlated Genes by KEGG Pathway

2.7 PKM2蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

利用String網(wǎng)站繪制人源PKM2可能存在的PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖9)，結(jié)果顯示，與PKM2相互作用排名前10的蛋白分別有烯醇化酶1(enolase 1,ENO1)、烯醇化酶3(enolase 3,ENO3)、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(glucose-6-phosphateisomerase,GPI)、烯醇化酶4(enolase 4,ENO4)、烯醇化酶2(enolase 2,ENO2)、果糖二磷酸醛縮酶A(aldolase A,ALDOA)、丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase,PC)、蘋果酸酶1(malic enzyme1,ME1)、乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)。

圖9 PKM2的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Figure 9. Protein-Protein Interaction Network of PKM2

3 討 論

丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)是一種參與葡萄糖分解代謝的重要調(diào)節(jié)蛋白，哺乳動物體內(nèi)PK有4種不同的亞型，以滿足不同組織特定的能量需求[11]。PKL和PKR主要分別在肝腎組織和紅細胞中表達，PKM1大量存在于肌肉和腦中，而PKM2作為PKM1的剪接變異體已經(jīng)在胚胎細胞、成人干細胞和各種腫瘤細胞中被發(fā)現(xiàn)[12]。PKM2與癌癥的代謝重編程和炎癥反應(yīng)直接相關(guān)，肺癌、胃癌、肝癌、膽管癌、乳腺癌和前列腺癌等腫瘤細胞中僅表達PKM2，且高表達水平的PKM2對腫瘤生長和預(yù)后有著不良的影響[13]。Suzuki等[14]報道了沉默PKM2基因可抑制LUAD H1299細胞的生長和遷移，shRNA-PKM2的H1299細胞異種移植小鼠模型中移植瘤顯著縮小。因此，PKM2作為糖酵解過程的最終限速酶對肺癌的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要。

本研究首先在Oncomine數(shù)據(jù)庫中挖掘出涉及PKM2表達的數(shù)據(jù)集8個，其中7個數(shù)據(jù)集均顯示LUAD組織中PKM2mRNA水平較正常肺組織升高；再對TCGA肺癌數(shù)據(jù)庫中大樣本規(guī)范數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)PKM2基因在LUAD組織中的表達約是正常肺組織的1.95倍，與Oncomine數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果相符。隨后進一步分析了HPA數(shù)據(jù)庫中LUAD與正常肺組織采用PKM2免疫組織化學(xué)抗體的染色強度，結(jié)果顯示PKM2蛋白在正常肺組織中呈低表達或未檢出，而在LUAD組織中呈現(xiàn)明顯中等強度染色，與基因表達結(jié)果相一致。臨床病理特征分析表明，該基因與LUAD的病理分級、T分期和N分期呈正相關(guān)，與M分期無關(guān)。

盡管醫(yī)療技術(shù)的進步使LUAD的診療手段有所提高，靶向藥物和免疫療法在臨床也已廣泛應(yīng)用，但由于基因突變位點存在差異性，使得靶向藥物療效因人而異，患者5年生存率依舊較低[15]。An等[16]對73例LUAD病理標(biāo)本研究表明，與PKM2表達低的患者相比，PKM2高表達患者的總存活率和無病存活率均降低。本研究通過分析Kaplan-Meier Plotter肺癌數(shù)據(jù)庫中PKM2高、低表達各360例的LUAD患者OS發(fā)現(xiàn)，PKM2高表達組患者具有更高的病死率和更差的預(yù)后。提示PKM2可作為潛在有價值的生物標(biāo)志物監(jiān)測LUAD患者病情進展。

為了進一步探究PKM2的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及信號通路，本研究利用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫對其共表達基因行Pearson相關(guān)性分析，得到與PKM2正相關(guān)的基因8 638個，隨后將正相關(guān)基因進行KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，PKM2參與細胞凋亡、癌癥中央碳代謝、HIF-1和IF-17等多種信號通路。有研究指出PKM2能顯著增加HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性，從而增加其靶基因包括GLUT1、LDHA、ENO1和PDK1的表達，促進肺癌細胞的代謝重編程，分泌的PKM2通過激活整合素Beta1/FAK信號通路促進肺癌轉(zhuǎn)移[16-18]。此外，PKM2參與調(diào)控腫瘤細胞的代謝方式向有氧糖酵解為主的改變，導(dǎo)致乳酸生成增加，酸性腫瘤微環(huán)境有助于腫瘤免疫逃避的發(fā)生[19]，而且PKM2與人LUAD細胞程序性死亡配體1的表達水平呈正相關(guān)[20]。因此，PKM2可能通過其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)影響正相關(guān)表達基因的功能從而發(fā)揮癌基因的作用。

綜上所述，本研究通過多種生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，PKM2在LUAD表達上調(diào)并影響預(yù)后，可能在LUAD中發(fā)揮生物預(yù)測作用，為進一步探索PKM2的生物學(xué)作用和分子機制提供了理論依據(jù)。

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