李曉洲，史云芳，琚端，李巖，張穎

孕婦血漿中的胎兒游離DNA（cell-free fetal DNA，cffDNA）可通過高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）技術(shù)即二代測序（next-generation sequencing，NGS）技術(shù)進(jìn)行精確檢測，并應(yīng)用于胎兒染色體非整倍體疾病的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測（noninvasive prenatal testing，NIPT）。目前NIPT 技術(shù)是指胎兒染色體非整倍體異常產(chǎn)前篩查技術(shù)，主要應(yīng)用于21三體綜合征（trisomy 21 syndrome，T21）、18三體綜合征（trisomy 18 syndrome，T18）和13三體綜合征（trisomy 13 syndrome，T13）的產(chǎn)前篩查。隨著對cffDNA研究的不斷深入，其應(yīng)用范圍已擴(kuò)展至單基因遺傳性疾病、胎兒性別鑒定、胎兒Rh血型鑒定、胎兒染色體拷貝數(shù)變異（copy number variants，CNVs）等多個領(lǐng)域。而隨著NIPT臨床研究的不斷深入，尤其是對其假陽性、假陰性及檢測失敗病例的深入分析，臨床工作者對NIPT 的臨床應(yīng)用范圍亦有了新的認(rèn)識。本文就應(yīng)用孕婦血漿中cffDNA 進(jìn)行NIPT 的臨床研究進(jìn)展及其影響因素進(jìn)行綜述，為個體化、規(guī)范化應(yīng)用NIPT技術(shù)提供參考。

1 胎兒染色體非整倍體疾病篩查的意義與現(xiàn)狀

妊娠合并遺傳性疾病或出生缺陷的比例約為5%［1］。我國“健康中國2030”規(guī)劃中將“減少出生缺陷”列為工作重點內(nèi)容，而超過80%的出生缺陷疾病是由遺傳因素單獨或協(xié)同作用導(dǎo)致的［2］。胎兒染色體非整倍體異常是引起出生缺陷的最主要原因，也是引起新生兒及兒童死亡的主要原因之一［1，3］。目前對此尚缺乏有效的治療手段，且患者預(yù)后極差。孕期可通過羊膜腔穿刺、絨毛取材或臍帶血穿刺等有創(chuàng)方式獲得胎兒細(xì)胞，進(jìn)行相關(guān)疾病的產(chǎn)前診斷，但這些產(chǎn)前診斷方法均屬于有創(chuàng)性檢查且技術(shù)復(fù)雜。目前國內(nèi)外的普遍做法是先通過經(jīng)濟(jì)、簡便、無創(chuàng)的產(chǎn)前篩查手段，篩查出高風(fēng)險人群，再采用各種產(chǎn)前診斷方法進(jìn)一步明確診斷。

高齡孕婦、血清學(xué)篩查高風(fēng)險和超聲“軟指標(biāo)”異常是產(chǎn)前診斷的主要指征，但據(jù)此針對胎兒T21的檢出率為60%～80%，陽性預(yù)測值約為5%［4-6］，因此無法實現(xiàn)全面預(yù)防控制出生缺陷。與傳統(tǒng)產(chǎn)前篩查技術(shù)相比，基于cffDNA 檢測的NIPT 技術(shù)可明顯提高T21 和T18 的檢出率及陽性預(yù)測值，并顯著降低其假陽性率［7］。有文獻(xiàn)報道，采用NIPT 技術(shù)進(jìn)行T21 產(chǎn)前篩查的檢出率約為 99.7%［8］，但對 T18、T13和性染色體非整倍體（sex chromosome aneuploidies，SCA）產(chǎn)前篩查的檢出率均低于T21，分別為98.2%、99.0%和95.8%［8-9］；并且SCA 患者出生時往往無明顯臨床癥狀，短期的新生兒隨訪難以發(fā)現(xiàn)SCA，故NIPT對胎兒SCA的檢出率尚需長期隨訪數(shù)據(jù)支持。即便如此，NIPT技術(shù)已明顯提高了胎兒染色體非整倍體疾病的檢出率［4-9］，但其臨床應(yīng)用仍需規(guī)范指導(dǎo)。

2 cffDNA進(jìn)行染色體非整倍體篩查的基本原理

1997年《Lancet》上首次報道了從孕婦外周血的血漿中發(fā)現(xiàn)了cffDNA，其來自于胎兒的DNA 片段，因攜帶了胎兒的遺傳信息，可以用來檢測胎兒的遺傳性疾病，為NIPT 技術(shù)的臨床應(yīng)用開辟了新紀(jì)元［10］。機(jī)體的造血細(xì)胞和體細(xì)胞在細(xì)胞凋亡的過程中，會產(chǎn)生一些DNA 片段游離于血漿中，即游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）片段，cfDNA 基因組譜可反映個體的染色體情況。在妊娠期間，胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞和少數(shù)胎兒細(xì)胞在細(xì)胞凋亡過程中產(chǎn)生的cffDNA 也被釋放到母體血漿中［11］。cffDNA 基因譜亦可反映胎兒的染色體情況，故可以用來檢測胎兒染色體異常［12］。

2011年以來，分子生物學(xué)技術(shù)快速發(fā)展，NGS技術(shù)可對母體血漿中的cffDNA 進(jìn)行精準(zhǔn)測序及染色體定位，從而進(jìn)行胎兒染色體非整倍體的NIPT 檢測。目前，大規(guī)模并行測序（massive parallel sequencing，MPS）技術(shù)是最常用的全基因組測序方法，也是進(jìn)行 cffDNA 篩查的主要測序技術(shù)［9，13］。部分靶向測序技術(shù)也可用于檢測母體血漿中的cffDNA，如單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）測 序［14］和 染 色 體 靶 向 測 序（chromosome-targeted sequencing，CTS）［15］。基于不同測序技術(shù)的NIPT 方案，各有其優(yōu)劣勢。SNPNIPT和CTS-NIPT方案具有成本低和敏感度穩(wěn)定等優(yōu)勢，但僅能獲得目標(biāo)區(qū)域的cffDNA 片段信息［14-15］。與之相比，MPS-NIPT方案可得到全基因組的cffDNA序列信息，除可檢測胎兒整個染色體組非整倍體異常之外，也可檢測由羅氏易位以及染色體微缺失和微重復(fù)引起的染色體異常［9，13］。我國各地進(jìn)行NIPT 檢測主要采用MPS-NIPT 方法，其在北美和亞歐等許多國家亦獲得廣泛的臨床應(yīng)用［9］。

3 NIPT應(yīng)用指南

cffDNA用于NIPT檢測以來，國際學(xué)術(shù)團(tuán)體相繼發(fā)表指導(dǎo)意見和專家共識。2012年，美國婦產(chǎn)科學(xué)會 （American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG）發(fā)表《胎兒染色體非整倍體的NIPT 檢測》，指出cffDNA 對各染色體篩查的特異度和敏感度存在差異，針對21 號染色體最高，其他染色體略低［16］。2013 年，美國遺傳和基因組學(xué)會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）發(fā)表《ACMG 指南：胎兒染色體非整倍體的NIPT 篩查》，自愿檢查、知情決策、專業(yè)遺傳咨詢和明確臨床路徑是NIPT應(yīng)用的基本原則，并建議將其檢測范圍限定于T21、T18和T13，檢測對象限定于胎兒染色體非整倍體高風(fēng)險孕婦［17］。2015 年ACMG又對指南做了更新，提出在充分告知患者NIPT檢測的檢出率、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值的前提下，一般風(fēng)險孕婦也可以選擇NIPT檢測［18］。

NIPT 是一種篩查方法，而不是診斷方法。Badeau 等［19］對 NIPT 的產(chǎn)前篩查價值進(jìn)行薈萃分析顯示，NIPT 用于篩查 T21、T18 和 T13 胎兒的敏感度為95.8%～99.7%，特異度＞99%。我國衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《孕婦外周血胎兒游離DNA產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)規(guī)范》將NIPT 定位為血清學(xué)篩查的補(bǔ)充，若孕婦具有產(chǎn)前診斷指征或者存在影響NIPT 結(jié)果的因素，則為cffDNA 篩查的慎用人群或不適用人群，但工作中仍需根據(jù)不同孕婦的實際情況個體化選擇產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷方案。

4 影響NIPT檢測結(jié)果的因素

4.1 母體因素 由于NIPT 技術(shù)需要檢測孕婦血漿中的cffDNA片段，若母血中cffDNA含量低于4%，可導(dǎo)致NIPT 檢測失敗。據(jù)文獻(xiàn)報道，NIPT 檢測失敗率約為0.3%［20］。母體的一些疾病狀態(tài)可以增加母體細(xì)胞凋亡，但是胎盤細(xì)胞凋亡并不隨之增加，在孕婦血漿中這些細(xì)胞代謝產(chǎn)生的cfDNA，來自母體的cfDNA 比例增加，而cffDNA 比例相對減少，可導(dǎo)致NIPT檢測失?。?1］。有研究表明，肥胖孕婦尤其是體質(zhì)量指數(shù)（BMI）＞35 kg/m2的孕婦，血漿中cfDNA 來自母體的比例明顯增加，其原因可能與脂肪細(xì)胞壞死、凋亡增加有關(guān)；而cffDNA片段相對不足，可導(dǎo)致NIPT 檢測失敗，失敗率約為2.2%［21-22］。另外，活動性自身免疫性疾病也可以加快細(xì)胞代謝，使母體產(chǎn)生的cfDNA增加。有學(xué)者通過MPS和甲基化測序技術(shù)對系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者血漿DNA 片段的生物學(xué)特性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，SLE 患者血漿中cfDNA 含量明顯增加且表達(dá)譜系異常［23］。SLE孕婦血漿中來自母體的cfDNA比例增加，則cffDNA 片段相對不足，導(dǎo)致NIPT 檢測失?。欢鴆fDNA表達(dá)譜系異常亦可引起NIPT的假陽性結(jié)果［22-24］。此外，孕期藥物攝入也可影響血漿中cfDNA 的含量，例如孕期注射低分子肝素可使cfDNA 含量明顯增加［25］；孕婦服用降壓藥或抗生素等藥物可使cffDNA 低于4%的比例明顯增加，導(dǎo)致NIPT 檢測失?。?6］。另有研究顯示，吸煙、妊娠期合并高血壓、惡性腫瘤等因素均可導(dǎo)致NIPT 檢測失?。?2，27］。

孕婦患有淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、白血病和結(jié)直腸癌等惡性腫瘤可導(dǎo)致NIPT 檢測出現(xiàn)假陽性結(jié)果［24，27-29］。2013 年 Osborne 等［24］首次報道了母體惡性腫瘤可以導(dǎo)致NIPT的假陽性結(jié)果，分析其原因是腫瘤細(xì)胞基因組中DNA 片段存在多個重復(fù)和缺失區(qū)域，使得患者和參考DNA之間的預(yù)期比率發(fā)生偏差，導(dǎo)致檢測失敗或異常的多個染色體非整倍體。有文獻(xiàn)報道在39 例NIPT 結(jié)果提示多條染色體非整倍體異常病例中，7 例可歸因于母體的無癥狀惡性腫瘤［27］。因此，孕婦進(jìn)行 cffDNA 的 NIPT 檢測前應(yīng)注意母體惡性腫瘤的影響。也有學(xué)者據(jù)此提出，可以評估cfDNA 作為癌癥早期生物標(biāo)志物的潛力［27-29］。另外，孕婦染色體異常（主要為性染色體結(jié)構(gòu)或數(shù)目異常）、染色體嵌合異常、染色體拷貝數(shù)變異均可引起NIPT的假陽性結(jié)果。此外，對于存在器官移植或異體輸血史的孕婦，若其引入的外源細(xì)胞為染色體非整倍體，其代謝產(chǎn)生的cfDNA 片段釋放入血漿中，亦可導(dǎo)致NIPT的假陽性結(jié)果［22，27］。

4.2 胎兒因素 有文獻(xiàn)報道，雙胎妊娠可通過NIPT進(jìn)行胎兒染色體非整倍體篩查，尤其是針對T21 的篩查，但由于NIPT 檢測的cffDNA 主要來源于胎盤組織，雙胎的絨毛膜性可能影響NIPT 的檢測結(jié)果［30-31］。對于雙絨毛膜雙胎來說，NIPT 檢測可按照2 個胎兒處理；對于單絨毛膜雙胎來說，若2 個胎兒遺傳物質(zhì)相同，可按單胎處理［30］；若2個胎兒遺傳物質(zhì)不同，需按照2個胎兒處理，胎盤與胎兒之間染色體情況差異可能會造成NIPT 檢測的假陰性結(jié)果［30-31］。若雙胎其中之一因染色體非整倍體而發(fā)生胎停育可導(dǎo)致NIPT的假陽性結(jié)果，其原因可能是發(fā)生胎停育的一胎仍可不斷向母體血漿中釋放DNA片段，其影響可持續(xù)7～8 周，一般不超過12～14周［32］。尹愛華教授團(tuán)隊通過對432 例雙胎的NIPT結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，NIPT用于雙胎妊娠胎兒染色體非整倍體篩查的敏感度和特異度分別為100%和99.53%［33］。但是，NIPT在雙胎中的應(yīng)用尚缺少大樣本的臨床數(shù)據(jù)，因此對雙胎妊娠胎兒染色體非整倍體的篩查價值尚需大樣本臨床研究驗證。

局限性胎盤嵌合（confined placental mosaicism，CPM）是引起NIPT結(jié)果與胎兒染色體核型不一致的最常見原因［34］。染色體嵌合是指在一個個體內(nèi)發(fā)現(xiàn)2個及以上具有不同染色體核型的細(xì)胞系。嵌合現(xiàn)象可以在所有組織中發(fā)生，也可局限于特定組織。在妊娠期間，異常細(xì)胞系可能局限于胎盤，即CPM［35］。在NIPT檢測時，CPM會干擾其結(jié)果的準(zhǔn)確性。如果異常細(xì)胞系存在于胎盤，而正常二倍體細(xì)胞系存在于胎兒組織，可造成NIPT 的假陽性結(jié)果；反之，如果正常二倍體細(xì)胞系局限于胎盤，而胎兒存在T21、T18和T13，則可造成NIPT的假陰性結(jié)果［36］。Kypri 等［37］的前瞻性研究顯示，NIPT 檢測T21、T18、T13 和SCA 的陽性預(yù)測值分別為100%、100%、71%和57%，與CPM 發(fā)生率呈負(fù)相關(guān)，這也是進(jìn)行NIPT檢測T13和SCA假陽性率較高的原因之一。

綜上所述，通過檢測孕婦血漿中cffDNA 進(jìn)行NIPT對篩查胎兒染色體非整倍體異常（尤其是T21）具有較好的臨床價值和應(yīng)用前景，但孕婦的疾病狀態(tài)及孕期用藥情況、雙胎妊娠或妊娠過程中CPM的發(fā)生均會影響NIPT的檢測結(jié)果，因此臨床應(yīng)用時需要注意。