葉琰

摘要 [目的]建立土壤中5種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的三重四級桿液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法。[方法]采用0.1%甲酸-乙腈溶液作為提取液，比較了PSA/C18或PEP凈化方式，然后以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀在多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）下，進(jìn)行定量與定性分析檢測。[結(jié)果]5種有機(jī)磷農(nóng)藥線性范圍均在0.01～50.00 ng/mL，相關(guān)系數(shù)均大于0.995。方法的平均回收率在82.1%～109.9%，RSD為0.48%～1.34%，方法檢出限為0.01 μg/kg。[結(jié)論]此方法靈敏度高、凈化效果好、快速、高效，可用于土壤中該類型有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的分析測定。

關(guān)鍵詞 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;有機(jī)磷農(nóng)藥;固相萃取;土壤

中圖分類號 X833文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）24-0188-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.24.053

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Determination of Organophosphorus Pesticides in Soil by UPLC Triplequadrupole Mass Spectrometery

YE Yan （Shanghai SEP Analytical Services Co.，Ltd.，Shanghai 201108）

Abstract [Objective]A method was established for the analysis of 5 organophosphorus pesticide residues in soil by triple fourpole liquid chromatographymass spectrometry.[Method]0.1% formateacetonitrile solution was used as the extraction solution.After PSA/C18 or PEP purification，the residue was detected by liquid chromatographytandem mass spectrometer under multireaction monitoring mode （MRM）.[Result]The linear range of 5 organophosphorus pesticides was 0.01-50.00 ng/mL，and the correlation coefficient was greater than 0.995.The average recovery rate of the method was 82.1%-109.9%，the RSD was 0.48%-1.34%，and the detection limit of the method was 0.01 μg/kg.[Conclusion]This method has high sensitivity，good purification effect，high speed and high efficiency，and can be used for the determination of organophosphorus pesticide residues in soil.

Key words UPLC-MS/MS;Organophosphorus pesticide;SPE;Soil

有機(jī)磷類農(nóng)藥自問世以來，因為其高效、快速、廣譜等特點，一直在農(nóng)藥中占有很重要的位置，對世界農(nóng)業(yè)的發(fā)展起了很重要的作用[1]。有機(jī)磷農(nóng)藥大都屬于磷酸酯類或硫代磷酸酯類化合物，大部分有機(jī)磷農(nóng)藥不溶于水，而溶于有機(jī)溶劑，在中性和酸性條件下穩(wěn)定，不易水解，在堿性條件下易水解而失效[2]。隨著這些有機(jī)磷類農(nóng)藥的廣泛被使用，暴露出了很多問題，如高殘留、毒性強(qiáng)等，尤其在環(huán)保意識日益增強(qiáng)的今天，其暴露的問題也引起了人們的高度重視[3]。研究表明，有機(jī)磷農(nóng)藥中毒不僅會使乙酰膽堿酯酶失活，還有可能改變?nèi)梭w內(nèi)線粒體呼吸鏈中的呼吸作用和產(chǎn)能過程中酶的活性，抑制免疫系統(tǒng)功能，導(dǎo)致組織細(xì)胞和DNA 損傷[3]。作為典型的酶毒劑，有機(jī)磷農(nóng)藥可以通過消化道攝入，也可以通過皮膚、黏膜、呼吸道吸收而引發(fā)中毒[4]。有機(jī)磷農(nóng)藥在農(nóng)作物病蟲防治領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，對人、動物和環(huán)境產(chǎn)生的危害不容忽視。目前檢測方法主要有氣相色譜法[5]、氣相色譜法-質(zhì)譜法[6]、液相色譜法[7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8]、酶抑制法[9]、電化學(xué)法[10]、免疫化學(xué)法[11]等。質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在目前儀器分析技術(shù)中使用極為廣泛，這種技術(shù)充分發(fā)揮了色譜優(yōu)良的分離能力以及質(zhì)譜準(zhǔn)確定性和定量特點，通過選擇合適的樣品前處理方法和定量手段就可以對多種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留同時進(jìn)行準(zhǔn)確地定性、定量分析，尤其是對于環(huán)境中一些低濃度、強(qiáng)極性和受熱易分解的有機(jī)磷農(nóng)藥，檢測效果較好。美國EPA 538 和EPA 600/R-04/126E建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分別測定飲用水與環(huán)境水樣中的甲胺磷和乙酰甲胺磷，我國關(guān)于5種農(nóng)藥分析主要集中在牛奶[12]、蔬菜[13]和水果[14]等食物樣品的測定，常用檢測方法多為氣相色譜法和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等，目前還未建立相關(guān)的土壤的檢測規(guī)范與標(biāo)準(zhǔn)。該試驗研究了土壤中甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧化樂果、敵百蟲、辛硫磷5種農(nóng)藥殘留分析的樣品前處理方法和質(zhì)譜檢測條件，以期為土壤中有機(jī)磷農(nóng)藥檢測標(biāo)準(zhǔn)建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)品及試劑

甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧化樂果、敵百蟲、辛硫磷，濃度100 μg/mL（國家環(huán)保標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心）;甲醇、乙腈均為HPLC級（美國Thermofisher公司）;甲酸LCMSMS級（國藥試劑公司）;超純水（美國Millipore公司）;N-丙基乙二胺（PSA，40～63 μm， 6 nm）、C18 吸附劑（德國CNW公司）;固相萃取柱：填料為二乙烯苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物（PEP，500 mg/6 mL，天津艾杰爾），C18（500 mg/6 mL，天津艾杰爾），PetiCarb/NH2（500 mg/500 mg，6 mL，天津艾杰爾）;其他未注明的試劑均為國藥分析純。

1.2 儀器設(shè)備 Xevo TQ-S micro三重四極桿質(zhì)譜儀（美國Waters公司）;色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18，2.1 mm×100 mm，粒徑為1.7 μm;超聲波清洗器、漩渦混合器、水浴氮吹儀、離心機(jī)等其他實驗室常規(guī)設(shè)備。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈-水稀釋成1 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 ℃保存，準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用水配制成濃度分別為0.01、0.05 、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00、50.00 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2.0 g土壤試樣（準(zhǔn)確至0.001 g）于50 mL離心管中，加入一定量 0.1%甲酸-乙腈提取液，加入3～5 g氯化鈉，劇烈振蕩渦旋1 min，超聲提取 30 min，每間隔10 min劇烈振蕩渦旋1 min，提取后 8 000 r/min 離心 5 min，取上清液經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后，待凈化。

固相萃取凈化：依次用10 mL 甲醇和10 mL 超純水活化固相萃取柱，保證小柱柱頭浸潤。取5 mL提取液加45 mL水混勻后，在自然重力作用下通過固相萃取柱，用真空泵抽干，待小柱干燥后用5 mL乙腈-0.1%甲酸混合溶劑以約3 mL/min 的流速洗脫小柱，收集洗脫液，35 ℃水浴氮吹至近干，準(zhǔn)確加入1 mL初始流動相，超聲或渦旋至完全溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜后，待測。

PSA/C18填料凈化：取5 mL提取液加入裝有150 mg PSA、150 mg C18的離心管中，渦旋1 min，8 000 r/min離心5 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，待測。

按同一操作方法做空白試驗。待測物含量過高時，用初始流動相適當(dāng)稀釋至線性范圍內(nèi)進(jìn)行測定。

1.5 液相色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18 （2.1 mm×100 mm，粒徑為1.7 μm）。流動相A為5 mmol/L甲酸銨-乙腈，流動相B為5 mmol/L甲酸銨-水，梯度洗脫。

1.6 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源正離子模式ESI（+）。碰撞氣為氬氣;脫溶劑氣為N2?；衔锏谋O(jiān)測離子對（m/z）、錐孔電壓、碰撞能質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件優(yōu)化

5種有機(jī)磷農(nóng)藥具有一定極性，且在堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定，因此提取劑中均加入0.1%甲酸。不同文獻(xiàn)報道的提取溶劑有所不同，該試驗分別考察了0.1%甲酸-乙腈、0.1%甲酸-水、0.1%甲酸-丙酮和0.1%甲酸-乙酸乙酯4種提取溶劑對5種有機(jī)磷農(nóng)藥的提取效率影響。試驗采用樣品加標(biāo)的方式進(jìn)行，結(jié)果表明（圖1），0.1%甲酸-水和0.1%甲酸-乙酸乙酯對辛硫磷提取效果較差，0.1%甲酸-丙酮提取效率較高，但提取的共提物較多，雜質(zhì)干擾較大。因此最終選擇0.1%甲酸-乙腈作為提取溶劑。

2.2 凈化條件優(yōu)化 試驗分別對PEP、C18、PetiCarb/NH2固相萃取柱以及150 mg PSA/150 mg C18填料凈化效果進(jìn)行比較，結(jié)果表明，C18、PetiCarb/NH2固相萃取柱回收率均不高;PEP和PSA/C18填料的凈化效果較理想，回收率在91.2%～109.6%，其中C18主要吸除脂肪等非極性雜質(zhì)，PSA 主要吸附脂肪酸、有機(jī)酸、碳水化合物等極性雜質(zhì)。因此，試驗采用150 mg PSA/150 mg C18填料對樣品進(jìn)行凈化，對于復(fù)雜基質(zhì)土壤樣品PEP固相萃取更優(yōu)。

2.3 色譜質(zhì)譜條件優(yōu)化 試驗考察了乙腈-水（甲酸）、乙腈-水、乙腈-水（甲酸銨）3種流動相體系，結(jié)果表明，當(dāng)采用乙腈-水（甲酸）作為流動相時，辛硫磷的出峰效果較好，但極性較大的氧化樂果、甲胺磷、乙酰甲胺磷的色譜峰出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的溶劑效應(yīng)，且基線噪音較大。當(dāng)采用乙腈-水作為流動相時，離子化響應(yīng)值較低。因此，采用乙腈-水（甲酸銨）作為流動相體系，為保證整個流動相體系pH穩(wěn)定，在有機(jī)相中加入甲酸銨。

將5種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液稀釋為1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，對每個化合物進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，包括母離子和子離子、毛細(xì)管電壓、脫溶劑溫度、氣體流量、錐孔電壓、碰撞能量。試驗結(jié)果表明，5種農(nóng)藥在ESI源正離子模式下均容易獲取H+，優(yōu)化各離子質(zhì)譜參數(shù)使特征碎片離子的強(qiáng)度達(dá)到最大。優(yōu)化后5種有機(jī)磷農(nóng)藥多離子反應(yīng)檢測總離子流圖如圖2所示。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

取所配制的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述色譜質(zhì)譜條件測定定量離子峰面積（Y）與濃度（X）進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果見表2。

2.5 回收率與精密度試驗 取某農(nóng)藥場地土壤樣品，添加5種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述色譜質(zhì)譜分析測定條件，分別測定7次，計算回收率和其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。從表3可以看出，5種農(nóng)藥平均回收率為82.1%～109.9%，RSD為0.48%～1.34%，表明該方法的回收率和精密度良好。

2.6 樣品定量分析 對農(nóng)藥場地土壤樣品進(jìn)行了定量分析，結(jié)果表明，甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧化樂果、辛硫磷均未檢出，敵百蟲濃度為0.5 μg/kg，加標(biāo)回收率為98.2%，能滿足土壤中甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧化樂果、辛硫磷、敵百蟲同時測定的要求。

3 結(jié)論

該研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對土壤中的甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧化樂果、辛硫磷、敵百蟲進(jìn)行同時測定。用0.1%乙腈超聲提取，以乙腈（甲酸銨）和水（甲酸銨）梯度洗脫，ACQUITY UPLC BEH C18柱分離柱，實現(xiàn)了二者的分離，正離子模式下MRM定量測定，同時有效降低基質(zhì)對目標(biāo)物質(zhì)的影響。該方法快速方便準(zhǔn)確，能滿足土壤中甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧化樂果、辛硫磷、敵百蟲同時測定的要求，為土壤中有機(jī)磷農(nóng)藥液質(zhì)檢測提供參考。

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