王姍姍 劉小嬌 胡赟 靳玉龍 白婷 朱明霞 張玉紅

摘要 γ-氨基丁酸（GABA）由于功能多樣，日益受到人們的關注。簡述了植物中GABA代謝途徑及植物富集GABA的方法與作用機理。植物中GABA合成主要包括GABA支路和多胺降解途徑，分解代謝則是在GABA-T和SSADH的催化作用下生成琥珀酸。植物主要通過調節(jié)植物體內GABA的合成-分解代謝實現(xiàn)GABA累積。GABA富集方式主要為浸泡、發(fā)芽，并通過鹽脅迫、缺氧脅迫、冷脅迫、熱脅迫、高壓、超聲等手段的聯(lián)合使用進一步增加富集量。GABA富集機制包括增加底物含量，如谷氨酸;增強GABA合成關鍵限速酶活性，如通過調節(jié)內環(huán)境pH或Ca2+濃度，增強GAD活性;改變細胞內區(qū)室劃分，增強底物和酶的相互作用;抑制GABA分解代謝。

關鍵詞 γ-氨基丁酸;代謝途徑;脅迫處理;發(fā)芽;富集機制

中圖分類號 Q946文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2020）24-0009-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.24.003

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Metabolism and Enrichment Mechanism of γaminobutyric Acid in Plants

WANG Shanshan， LIU Xiaojiao， HU Yun et al

（Institute of Food Science & Technology， Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences，Lhasa，Tibet 850000）

Abstract Because of the various functions， γaminobutyric acid has attracted increasing attention. The GABA metabolic pathway in plants and the method and mechanism of GABA enrichment in plants were briefly described.The synthesis of GABA contained two pathways， GABA shunt and polyamine degradation. The catabolism of GABA to succinic acid was catalyzed by GABAT and SSADH. The enrichment of GABA was mainly based on regulating the synthesis and catabolism of GABA in plants. The methods contained soak and germination， the more accumulation of GABA could be obtained by the additional processing ，such as salt stress， hypoxia stress， cold stress， heat stress， high pressure， and ultrasound. The mechanism of GABA enrichment included： increasing substrate content， such as glutamic acid;enhancing the ratelimiting enzyme activitiy of GABA synthesis， such as enhancing GAD activity by adjusting the internal environmental pH or Ca2+ concentration;changing the compartmentalization of cells to enhance the interaction between substrates and enzymes;inhibiting the catabolism of GABA.

Key words γaminobutyric acid;Metabolic pathway;Stress treatment;Germination;Enrichment mechanism

γ-氨基丁酸（GABA）是一種廣泛存在于植物、動物及微生物的四碳非蛋白質氨基酸[1]。GABA作為一種哺乳動物神經系統(tǒng)的神經遞質，在維持心理健康方面發(fā)揮著重要作用。臨床研究表明，GABA具有降壓、降脂、降血糖、抗癌、利尿、鎮(zhèn)定等功能[2]。GABA同樣可以通過改善氧化應激反應，減少高脂飲食小鼠的肥胖概率[3]。由于GABA的功能多樣性，商場中存在部分富含GABA的產品，如發(fā)芽糙米，但種類較為單一，難以滿足消費者需求。

GABA 在植物中具有多種功效，可調節(jié)植物機體pH，促進代謝生長發(fā)育，提供三羧酸循環(huán)旁路的代謝產物，抵御逆境等，當植物體受到外界脅迫如熱刺激、冷凍、機械損傷、鹽脅迫、缺氧、浸泡和酸化等逆境脅迫或植物激素作用時，植物體內 GAD 酶被激活而引起酶活力的增強，導致GABA富集[4]。GABA存在于多種作物，如谷物（糙米、大麥等）、豆類（大豆、綠豆等）、蔬菜（馬鈴薯、番茄等）、堅果等[5]。不同的作物中，GABA含量各不相同，為2～700 nmol/g[6]。提升食品中GABA含量越加受到人們的關注，了解植物中GABA的代謝及富集機制，有利于高GABA含量產品生產工藝的確定，豐富高GABA產品種類，滿足消費者需求。

1 植物中GABA代謝途徑

植物中GABA代謝途徑主要包括GABA支路和多胺降解途徑。目前對于植物GABA富集的研究主要集中在GABA支路，對于多胺降解富集GABA缺乏系統(tǒng)研究。

1.1 GABA支路

植物中，GABA支路是指由谷氨酸脫羧酶（GAD）催化谷氨酸形成GABA和CO2，然后GABA通過GABA轉氨酶（GABA-T）催化形成琥珀酸半醛（SSA），隨后SSA由琥珀酸半醛脫氫酶（SSADH）氧化生成琥珀酸進入檸檬酸循環(huán)（TCA循環(huán)）[7]。

植物GAD基因于1993年首次由Baum等[8]在矮牽牛中分離定義，隨后在很多物種中發(fā)現(xiàn)了其同源序列，如擬南芥、水稻、玉米等。不同于動物和細菌中的GAD結構，植物中的GAD通常在C-末端具有一個Ca2+/CaM結合域（CaMBD）。低pH和正常生理條件下CaMBD結合Ca2+/CaM均可導致GABA的富集，因此GAD通過CaMBD結合或缺失Ca2+/CaM進行活性調控，Ca2+/CaM缺失抑制GAD活性，結合Ca2+/CaM則消除抑制作用[9]。擬南芥基因組包括5個編碼GAD的基因，其中GAD1、GAD2和GAD4 C-末端包含有CaMBD，而GAD3和GAD5 C-末端不具有CaMBD，其蛋白產物GAD3和GAD5的活性不受Ca2+調控[10]。擬南芥中，GAD1基因主要在根中表達，GAD2基因在所有的器官中均有表達，GAD4和GAD5基因在花中表達，GAD3和GAD4基因在幼嫩的葉片、萼片、心皮及不成熟的果實中有表達[11-14]。

不同的GAD基因在不同的生長時期和生長條件下，其表達水平各不相同。擬南芥中普遍表達的GAD2基因在衰老過程中和高鹽條件下表達上調，在缺氧條件下表達下調，而GAD1基因表達水平不受缺氧條件影響。這表明不同的生長條件和脅迫方式對GAD基因的調控不同，如GAD基因在冷脅迫條件下表達上調，在缺氧條件下表達下調[15]。

植物中，GABA最初主要在細胞質中積累，然后轉運到線粒體中。GABA的分解代謝為TCA循環(huán)和電子傳遞鏈提供了底物，因此可以作為有用的代謝底物，在脅迫條件下提供能量和碳架[16]。GABA代謝的關鍵是通過GABA轉氨酶（GABA-T）轉化為琥珀酸半醛（SSA）。根據結構的不同，GABA-T可以分為GABA-TK和GABA-TP 2種類型。GABA-TK以α-酮戊二酸為氨基受體生成谷氨酸，GABA-TP以丙酮酸為氨基受體生成丙氨酸，GABA-TP同樣具有GABA-TG活性，即以乙醛酸為氨基受體生成甘氨酸[17]。GABA-TK存在于細菌、酵母、真菌、動物中，而GABA-TK和GABA-TP在植物中均有發(fā)現(xiàn)，雖然僅分離出了GABA-TP，如番茄中同時存在GABA-TK和GABA-TP[18]。雖然之前的研究表明GABA-TK的活性小于GABA-TP，但Akihiro等[19]研究發(fā)現(xiàn)番茄破色期后，GABA-TK的活性顯著高于GABA-TP。在番茄果實發(fā)育過程中，GABA含量與GABA-TK活性呈顯著負相關。在番茄中共分離鑒定出3個GABA-T基因，分別為SlGABA-T1、SlGABA-T2和SlGABA-T3[20]。在擬南芥中只分離出一個GABA-T基因——POP2。

GABA分解代謝的最后一步是SSA通過以NAD+為輔酶的SSA脫氫酶（SSADH）氧化為琥珀酸，進入TCA循環(huán)，將GABA支路與呼吸代謝結合起來。SSA同樣可以被位于胞漿和葉綠體的SSA還原酶（SSR）還原為γ-羥基丁酸（GHB），也被稱為GHB脫氫酶（GHBDH）。SSADH的活性與線粒體內的能量狀態(tài)相關。在脅迫條件下NAD+∶NADH比值較低，SSADH活性受到抑制，導致SSA累積，進而抑制GABA-T的活性和GABA的分解代謝，促進GABA的累積[21]。脅迫條件能促進SSA還原生成GHB，通過SSA的解毒作用適應脅迫環(huán)境。在番茄中共分離出1個SSADH基因（SlSSADH）和2個SSR基因（SlSSR1和SlSSR2）[19]。SlSSADH在番茄果實的整個生育期具有表達，且與GABA含量無相關性。SlSSR1在成熟期的表達水平略高于破色期，而SlSSR2在破色期的表達水平略高[22]。

1.2 多胺降解途徑

關于GABA代謝途徑的研究主要集中于GABA支路（谷氨酸通路），研究發(fā)現(xiàn)，在脅迫條件下，GABA可以通過多胺途徑進行合成。如多胺降解途徑對于發(fā)芽過程中GABA富集的貢獻率高達39%[23]。

植物中的多胺主要包括腐胺、精胺和亞精胺。腐胺可以由鳥氨酸通過鳥氨酸脫羧酶（ODC）催化生成，或由精氨酸通過精氨酸脫羧酶（ADC）催化生成。多胺降解主要通過氧化反應，如腐胺通過二胺氧化酶（DAO）催化生成4-氨基丁醛，而精胺和亞精胺則由多胺氧化酶（PAO）催化。4-氨基丁醛通過氨基醛脫氫酶（AMADH）催化生成GABA，在GABA-T和SSADH的催化作用下進入TCA循環(huán)，實現(xiàn)GABA的降解代謝[24]。

DAO和PAO均屬于胺類氧化酶，其中DAO可以氧化腐胺、精胺和亞精胺，分布于豆科等雙子葉植物;PAO可以氧化精胺和亞精胺，分布于禾谷類等單子葉植物[25]。DAO的2個亞基中均含有Cu2+，因此Cu2+處理可導致DAO活性顯著提高，而EDTA處理可導致DAO活性的降低，如以EDTA處理豇豆出生葉片，可降低80%的DAO活力[26]。PAO以黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）為輔酶，導致奎叮因可強烈抑制PAO活性。

AMADH屬于醛脫氫酶，最早發(fā)現(xiàn)于豆科和禾本科，它以NAD+為輔酶，在多胺降解途徑中催化4-氨基丁醛脫氫生成GABA[27]。不同物種中AMADH的結構各不相同，如豌豆中的AMADH是230 kDa的四聚體，而燕麥中的AMADH則是55 kDa的單聚體結構，表明AMADH的亞基結構并非其酶活所必須[28-29]。

2 植物富集GABA的方法及作用機理

根據植物中GABA的合成代謝機理，通常通過生物脅迫（染病和蟲害）及非生物脅迫（鹽、低氧、干旱、熱激、冷激等）促進GABA富集。通過籽粒中內源酶激活，提升籽粒的GABA含量及其他營養(yǎng)成分是常用的食品處理方式，主要包括浸泡、發(fā)芽及高壓、超聲、脈沖電場等新型加工方式。通過聯(lián)合其他的處理同樣可以提升GABA含量，如改變浸泡條件，包括添加外源谷氨酸、赤霉素、Ca2+、調節(jié)浸泡液pH等。

2.1 鹽脅迫

鹽脅迫條件下，植物體不但通過增加脯氨酸、有機酸、可溶性糖等多種滲透調節(jié)物質的含量，提高SOD、CAT等抗氧化酶的活性以抵抗鹽的滲透脅迫，還啟動GABA代謝來提高植物體耐鹽性。以NaCl對發(fā)芽小麥進行鹽脅迫處理，發(fā)現(xiàn)5個品種小麥的gad基因表達上調，但品種間存在差異，品種Um Qayes 的GAD表達量最多，GABA積累最多[30]。鹽脅迫主要通過Ca2+濃度增加，通過調控Ca2+/CaM結合域結合Ca2+，提升GAD活性，進而導致GABA富集。

2.2 低氧脅迫

低氧條件下，植物電子傳遞鏈被抑制，TCA循環(huán)受到抑制，糖類代謝主要通過糖酵解途徑，生成丙氨酸，進而累積乙酸和乳酸，導致細胞質酸化，pH降低，而GABA合成詞的關鍵限速酶GAD在酸性條件下激活，促進了GABA合成。低氧條件下，有氧呼吸作用受到抑制，導致NAD+∶NADH比值較低，SSADH活性受到抑制導致SSA累積，進而抑制GABA-T活性和GABA分解代謝，促進GABA累積。常用的低氧脅迫條件包括浸泡和CO2處理。以20%CO2對采摘后的草莓進行缺氧處理，GAD活性無顯著變化，但GABA-T活性顯著降低，導致GABA降解代謝率下降，進而實現(xiàn)GABA的富集。對發(fā)芽期間的蠶豆進行缺氧處理，結果表明，蠶豆胚中的Glu和多胺含量顯著增加，GAD和DAO被激活，GABA 含量達到16 mg/g，是對照組的8.26倍，且多胺降解途徑的貢獻約為30%[31]。

2.3 溫度脅迫

植物體的溫度脅迫包括低溫脅迫和高溫脅迫。低溫脅迫包括冷害和凍害，其中凍害會使細胞內產生較大的冰晶體，對細胞膜系統(tǒng)具有顯著的損害作用，使Ca2+、H+等深入細胞質激活細胞中的Ca2+/CaM結合域，提高鈣調蛋白表達水平，從而激活谷氨酸脫羧酶（GAD）活性催化L-谷氨酸降解形成 GABA，促進 GABA 積累。細胞膜系統(tǒng)的損害同樣可以打破區(qū)域化的阻礙作用，使谷氨酸和GAD的相互作用更加完善。對萌發(fā)大豆進行凍融培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，經過凍融培養(yǎng)的大豆新芽中 GAD、DAO 活性提高，GABA含量增加，達2.34 mg/g，是未進行凍融培養(yǎng)嫩芽的7.21倍[32]。高溫脅迫是指環(huán)境溫度高于植物正常生長溫度所造成的一種植物應激現(xiàn)象，主要有短時間處理即熱激和長時間處理即干燥。擬南芥突植株在42 ℃熱激0.5 h，GABA開始富集，熱激2 h，GABA含量得到顯著性增加[33]。干燥大豆籽粒經浸泡、冷凍及解凍處理后，GABA含量達1.9 mg/g，較未處理大豆籽粒增加26倍[34]。小麥行粒發(fā)芽3 h于120 ℃蒸汽下熱激處理30 s 可使其GABA含量提高16.24%[35]?？Х榷?0 ℃干燥至含水量為43%時其GABA含量最高，隨后即迅速下降;40 ℃干燥，含水量為39%時，GABA含量最高，40 ℃干燥條件下的最高GABA含量低于30 ℃干燥條件下的最高GABA含量[36]。Suzuki等[37]分別以40 ℃干燥20 h和70 ℃干燥7 h 處理蕎麥葉，發(fā)現(xiàn)低溫長時間干燥的蕎麥葉中GABA含量顯著高于高溫短時間干燥，因此干燥溫度和時間對于GABA具有顯著影響，在食品加工過程中應提高關注。

2.4 發(fā)芽處理

發(fā)芽過程是一個典型的生理活化過程。谷物中含有大量的酶，以結合態(tài)的方式儲存于谷物干谷粒中。在適宜的溫度條件下，當谷粒中的水分增加到一定程度時，許多處于休眠狀態(tài)的酶被激活，由結合態(tài)轉變成游離態(tài)，從而發(fā)生酶解作用。發(fā)芽過程中，內源酶被激活，物質代謝速率加快，蛋白質水解導致GABA支路的關鍵反應底物L-谷氨酸含量增加，進而導致GABA富集。

Ohtsubo 等[38]研究發(fā)現(xiàn)糙米中GABA含量96 h的發(fā)芽過程中不斷大幅度上升，GABA 的含量從60.4 mg/kg 上升至1 490 mg/kg。為提升GABA的富集效率，針對GABA合成及降解的代謝機制，通過調節(jié)酶活、底物濃度進一步提升GABA含量。Ohtsubo 等[38]發(fā)現(xiàn)發(fā)芽期間用谷氨酸和殼聚糖混合液浸泡糙米能進一步提高 GABA 的含量，并且發(fā)芽后 GABA 含量增加了13倍。

2.5 新型加工方式

高壓、脈沖電場、超聲波等新型加工方式在不影響原有營養(yǎng)成分、加工特性、結構特點的條件下造成GABA的富集，更符合現(xiàn)代人健康、安全兼具功能性的要求[39]。Kim等[40]通過發(fā)芽和高壓協(xié)同處理，可顯著增強糙米GABA的富集，高壓發(fā)芽2 d（30 MPa，48 h）的種子GABA含量最高，可達1 212.1 mg/kg。Dellarosa等[41]研究發(fā)現(xiàn)脈沖電場處理可通過三羧酸循環(huán)影響谷氨酸和GABA含量，其中脈沖電場強度為250 V/cm時可顯著提高GABA富集量。超聲前處理水稻，同樣可提升發(fā)芽稻米GABA富集水平，GABA含量隨處理時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，15 min達到峰值[42]。高壓造成GABA富集的可能機制包括：①通過改變GAD三級結構和構象，提升GAD活性;②GAD結合Ca2+可促進其活性，高壓可能通過Ca離子通道的結構改變，提升細胞內Ca2+含量，激活GAD，促進GABA合成;③酸性或高H+濃度條件下，GAD被激活，高壓通過細胞器破裂，增強H+釋放，降低細胞內pH，提升GAD活性;④高壓可以通過激活纖維素酶或機械作用，破壞細胞結構，促進GAD與底物L-谷氨酸之間的相互作用，進而導致GABA富集[39]。超聲和脈沖電場雖然可以導致GABA的富集，但其作用機制鮮有涉及。針對超聲處理的作用機制，推測主要包括破碎、腐蝕、毛細效應、聲孔效應、剪切應力和細胞結構的摧毀。脈沖電場主要是通過其電穿孔效應，影響膜傳導作用，增加底物與酶的相互作用，進而促進GABA富集。針對脈沖電場處理因素的設計需綜合考慮脈沖強度、脈沖時間及脈沖類型等。

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