宋昳星，郭冬梅

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000)

膝骨關(guān)節(jié)炎是一種以疼痛為早期表現(xiàn)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，可以出現(xiàn)關(guān)節(jié)僵硬、腫脹以及屈伸功能異常，并最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)變形、行走功能喪失的慢性退行性疾病。該病的發(fā)病機(jī)制尚不明確，其中年齡、運(yùn)動(dòng)習(xí)慣、體質(zhì)量以及遺傳等因素均與其發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[1]，而軟骨的退行性改變是該病發(fā)生的核心所在，且炎癥細(xì)胞因子損傷機(jī)制逐漸受到重視[2]。炎癥細(xì)胞因子主要包括腫瘤壞死因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、白細(xì)胞介素以及一氧化氮等，目前對(duì)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)的研究最多，前者主要由單核吞噬細(xì)胞產(chǎn)生，對(duì)軟骨細(xì)胞具有較強(qiáng)的分解作用，可抑制軟骨基質(zhì)合成[3]；后者在正常生理狀態(tài)下主要以基質(zhì)蛋白酶原的形式存在，但在膝骨關(guān)節(jié)炎患者中，其被過(guò)度激活，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞外基質(zhì)蛋白分解酶過(guò)度激活，從而加速了軟骨的分解和代謝，加速軟骨損傷[4]。目前西醫(yī)多以對(duì)癥治療為主，早期主要以患者教育、功能鍛煉為主，中期主要以鎮(zhèn)痛、消炎為主，后期則主要以關(guān)節(jié)腔注射藥物、腔鏡手術(shù)為主[5-6]。中醫(yī)將本病歸為“痹證”“筋痹”“骨痹”的范疇，治療上有方藥內(nèi)治、方藥外治以及針灸治療等方法，其中針灸療法作為中醫(yī)外治的主要方法，具有操作簡(jiǎn)單、療效確切、價(jià)廉的特點(diǎn)，非常適合本病的早期治療[7]，但作用機(jī)制不明確。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，觀察了溫針灸對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎SD大鼠行為學(xué)以及軟骨中TNF-α和MMP-3的影響，旨在為該病的臨床治療提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠90只，體質(zhì)量200～250 g，由山東中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，合格證號(hào)：SCXK(魯)2014-0025。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)溫度保持在(22±2)℃，濕度(60±10)%，敏感周期為12 h。自由攝水，標(biāo)準(zhǔn)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2主要試劑和儀器 水合氯醛(廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20160223-3)；蘇木精染料(天津化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20160305-6)；甲醛(北京普博欣科技有限公司，批號(hào)：20150105-6)；二甲苯(天津化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20160316-1)；TNF-α試劑盒(美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)，購(gòu)自北京定國(guó)化學(xué)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：LOT#035M1523V)；MMP-3試劑盒(美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)，購(gòu)自北京定國(guó)化學(xué)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：LOT#113M3652V)；離心機(jī)(德國(guó)制造，型號(hào)：5810R)；石蠟包埋機(jī)(浙江金華益迪制造，型號(hào)：YD62)；切片機(jī)(美國(guó)制造，型號(hào)：RM2235)；760日立全自動(dòng)生化儀(日本制造)；放射免疫測(cè)量?jī)x(中國(guó)制造，型號(hào)：SN-682)。

1.3分組、造模及干預(yù) 將喂養(yǎng)1周后SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和針灸組，每組30只。模型組和針灸組大鼠參照文獻(xiàn)[8]采取關(guān)節(jié)腔注射木瓜酶法復(fù)制右膝關(guān)節(jié)炎模型，并于造模后第4周測(cè)量左右膝關(guān)節(jié)厚度，若右膝關(guān)節(jié)較左側(cè)腫脹大于20%，則視為造模成功。本實(shí)驗(yàn)中大鼠全部造模成功。然后針灸組給予溫針灸治療，選取血海、陽(yáng)陵泉、內(nèi)膝眼為主穴，穴位位置參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[9]。血海位于右后肢髕骨底與髕骨內(nèi)側(cè)連線上方約0.8 cm處；陽(yáng)陵泉位于腓骨頭下方凹陷處；內(nèi)膝眼位于后肢髕骨下方，髕骨韌帶內(nèi)側(cè)凹陷處。針刺前，大鼠板固定后進(jìn)行穴位定位，采用太和牌0.22 mm×0.25 mm一次性針灸針，每穴刺入3～5 mm，采用平補(bǔ)平瀉手法上下提插5次后，于針柄處粘貼一蠶豆大艾柱后點(diǎn)燃，持續(xù)10 min，連續(xù)針灸2周。正常組和模型組大鼠不給予任何干預(yù)。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1大鼠行為學(xué)表現(xiàn) 干預(yù)前后采用改良版Lequesne MG量表評(píng)估大鼠行為學(xué)表現(xiàn)，主要評(píng)估內(nèi)容包括大鼠局部疼痛度、步態(tài)、關(guān)節(jié)腫脹情況以及關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍。疼痛程度：無(wú)疼痛記0分；患肢出現(xiàn)收縮記1分；患肢收縮同時(shí)伴有輕度全身反應(yīng)記2分；患肢聚類(lèi)收縮，伴有全身顫抖甚至掙扎記3分。步態(tài)：大鼠正常行走記0分；輕度跛行，觸地有力記1分；患肢參與行走，但跛行明顯記2分；患肢不能參與行走記3分。關(guān)節(jié)腫脹程度：無(wú)腫脹記0分；輕度腫脹，骨性標(biāo)記線變淺記1分；重度腫脹，骨性標(biāo)記線消失記2分。關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍：90°以上且無(wú)明顯疼痛反應(yīng)記0分；45°～90°且無(wú)明顯疼痛反應(yīng)記1分；15°～45°且無(wú)明顯疼痛反應(yīng)記2分；<15°且無(wú)明顯疼痛反應(yīng)記3分。

1.4.2大鼠軟骨組織中TNF-α和MMP-3含量實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)采用空氣栓塞法將所有大鼠處死后固定于手術(shù)臺(tái)，將右后肢伸直以固定膝關(guān)節(jié)，備皮后剝離皮膚及皮下組織，暴露膝關(guān)節(jié)后，使用眼科剪與小刀片切取膝關(guān)節(jié)面軟骨約20 mg，生理鹽水沖洗干凈后分為2份，一份標(biāo)本放置于4%的甲醛中固定進(jìn)行HE染色切片；另一份放置于1.5 mL試管中加入5 mL生理鹽水，離心取上層清液，按照TNF-α和MMP-3試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用放射免疫法檢測(cè)TNF-α和MMP-3含量。

2 結(jié) 果

2.13組大鼠干預(yù)前后Lequesne MG評(píng)分比較干預(yù)前，模型組和針灸組Lequesne MG評(píng)分均顯著高于正常組(P均<0.05)。干預(yù)結(jié)束后，模型組和針灸組評(píng)分均顯著下降(P均<0.05)，且針灸組評(píng)分明顯低于模型組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠干預(yù)前后Lequesne MG評(píng)分比較分)

注：①與正常組比較，P<0.05；②與干預(yù)前比較，P<0.05；③與模型組比較，P<0.05。

2.23組大鼠膝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)表現(xiàn) 正常組大鼠膝關(guān)節(jié)組織未發(fā)現(xiàn)病理改變，關(guān)節(jié)軟骨表面光滑完整，各層軟骨細(xì)胞排列緊密有序，見(jiàn)圖1；模型組大鼠膝關(guān)節(jié)面粗糙不平，部分地方出現(xiàn)病理性裂隙，中間可見(jiàn)壞死性軟骨組織，周?chē)梢?jiàn)增生細(xì)胞及炎癥細(xì)胞，見(jiàn)圖2；針灸組大鼠膝關(guān)節(jié)病變范圍小于模型組，其水腫程度、炎癥浸潤(rùn)及壞死程度均輕于模型組，少數(shù)壞死組織區(qū)內(nèi)可見(jiàn)新生的軟骨細(xì)胞和纖維組織，見(jiàn)圖3。

圖1 正常組大鼠膝關(guān)節(jié)組織鏡下表現(xiàn)

圖2 模型組大鼠膝關(guān)節(jié)組織鏡下表現(xiàn)

圖3 針灸組大鼠膝關(guān)節(jié)組織鏡下表現(xiàn)

2.33組大鼠膝關(guān)節(jié)組織中TNF-α、MMP-3含量比較 模型組及針灸組大鼠膝關(guān)節(jié)組織中TNF-α、MMP-3含量均明顯高于正常組(P均<0.05)，但針灸組TNF-α、MMP-3含量均明顯低于模型組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 3組大鼠膝關(guān)節(jié)組織中TNF-α、MMP-3含量比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

3 討 論

目前膝骨關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物模型有很多，然而由于膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，多種因素均參與其中，故現(xiàn)有的動(dòng)物模型均很難模擬膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病全過(guò)程，只是模擬了其中的一點(diǎn)或者一段過(guò)程[10]。木瓜蛋白酶可以使軟骨基質(zhì)中的多種蛋白進(jìn)行分解，使蛋白多糖從軟骨基質(zhì)中丟失，激活骨關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)，造成類(lèi)骨關(guān)節(jié)炎的病理狀態(tài)，故木瓜蛋白酶造模是目前常用的膝骨關(guān)節(jié)炎造模法之一，且成功率較高[11-12]。本研究也采用該法造模，結(jié)果均造模成功。

中醫(yī)認(rèn)為膝骨關(guān)節(jié)炎病因主要為肝腎不足，氣血虧虛，適逢外感風(fēng)寒或跌打損傷等，導(dǎo)致局部經(jīng)絡(luò)不通，不通則痛，故在治療上宜滋補(bǔ)肝腎、溫經(jīng)通絡(luò)[13]。《黃帝內(nèi)經(jīng)》中有云“腧穴所在，主治所及”，故本研究中取血海、陽(yáng)陵泉、內(nèi)膝眼三穴以疏通局部經(jīng)絡(luò)，恢復(fù)關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境平衡。血海為足太陰脾經(jīng)之穴，具有滋補(bǔ)脾腎、益氣活血之功效，為“治血要穴”，臨床上常用來(lái)疏通局部經(jīng)絡(luò)，濡養(yǎng)關(guān)節(jié)，達(dá)到通則不痛、榮則不痛的目的；陽(yáng)陵泉屬于足少陽(yáng)膽經(jīng)，為八會(huì)穴之一的“筋會(huì)”，“膝為筋之府”，故選取此治筋穴以治骨?。粌?nèi)膝眼為治療骨痹之經(jīng)驗(yàn)用穴，常配合外膝眼進(jìn)行透刺，但因大鼠膝關(guān)節(jié)較小難以操作，故單用此穴以促進(jìn)膝關(guān)節(jié)周?chē)鷼庋倪\(yùn)行。《素問(wèn)·痹論》中有“痛者，寒氣多也”，提示疼痛的發(fā)生多與寒氣侵蝕有關(guān)。而溫針灸是一種將針刺和艾灸結(jié)合的治療方法，具有溫經(jīng)散寒、通絡(luò)止痛的雙重作用，因此常被用來(lái)治療膝骨關(guān)節(jié)炎[14-16]。本研究結(jié)果顯示，干預(yù)結(jié)束后，模型組和針灸組Lequesne MG評(píng)分顯著下降，且針灸組明顯低于模型組。進(jìn)一步病理觀察發(fā)現(xiàn)，正常組大鼠膝關(guān)節(jié)組織未發(fā)現(xiàn)病理改變；模型組大鼠膝關(guān)節(jié)中可見(jiàn)廣泛的病理性改變；針灸組大鼠膝關(guān)節(jié)病變范圍少于模型組，且水腫程度、炎癥浸潤(rùn)及壞死程度均輕于模型組，少數(shù)壞死組織區(qū)內(nèi)可見(jiàn)新生的軟骨細(xì)胞和纖維組織。上述結(jié)果提示溫針灸不僅可改善膝骨關(guān)節(jié)炎的臨床癥狀，而且可減輕骨關(guān)節(jié)病理改變，這與文獻(xiàn)[17]報(bào)道相一致。

細(xì)胞因子在人體中是一種免疫調(diào)節(jié)因子，在人體各項(xiàng)功能中發(fā)揮著重要作用。在膝骨關(guān)節(jié)炎中，軟骨細(xì)胞異常分泌了多種細(xì)胞炎癥因子，這些因子被釋放至細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)代謝平衡被打破，抑制軟骨細(xì)胞生成的同時(shí)加速了軟骨細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)果顯示，模型組及針灸組軟骨組織中TNF-α、MMP-3含量均明顯高于正常組，但針灸組TNF-α、MMP-3含量均明顯低于模型組。提示溫針灸可能通過(guò)降低軟骨細(xì)胞中TNF-α、MMP-3含量，從而起到治療本病的作用。

綜上所述，溫針灸可以改善膝骨關(guān)節(jié)炎SD大鼠軟骨形態(tài)，具有改善軟骨退變和保護(hù)軟骨的作用，可能是通過(guò)降低軟骨細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、MMP-3含量來(lái)實(shí)現(xiàn)的。然而本次實(shí)驗(yàn)僅僅測(cè)定了實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的TNF-α、MMP-3含量，未能對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，溫針灸治療膝骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

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