張錦麗，吳杭捷，郭 偉

(浙江省醫(yī)療健康集團(tuán)杭州醫(yī)院 重癥監(jiān)護(hù)室，浙江 杭州 310021)

重癥肺炎是呼吸內(nèi)科常見的社區(qū)獲得性感染，病情嚴(yán)重，發(fā)展迅速，病程長(zhǎng)[1]。重癥肺炎患者死亡率較高，為20%～50%[2]。Th17/Treg動(dòng)態(tài)平衡與炎癥的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系[3-5]。microRNAs (miRNAs)是一種長(zhǎng)度為21～24個(gè)核苷酸的小型非編碼RNA[6]，miR-155在炎癥介導(dǎo)的相關(guān)疾病中的作用被相繼報(bào)道[7-8]。本研究檢測(cè)重癥肺炎患者miR-155水平，結(jié)合Th17/Treg動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)對(duì)miR-155保護(hù)肺組織的機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 一般資料 選取浙江省醫(yī)療健康集團(tuán)杭州醫(yī)院2018年3月—2019 年3月收治的重癥肺炎患者32例，其中男18例，女14例，平均年齡(61.09±7.72)歲，均符合重癥肺炎相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。以同期健康體檢者32例為健康對(duì)照組，其中男17例，女15例，平均年齡(62.11±7.08)歲。2組研究對(duì)象平均年齡、性別比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。所選研究對(duì)象均簽署知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料 選取成年健康Sprague-Dawley(SD)大鼠39只，6～8周齡，體質(zhì)量200～250 g，雌雄不限，購于北京華埠康生物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0275]。SPF系統(tǒng)內(nèi)分籠飼養(yǎng)，12 h循環(huán)光照，室溫(23.0±1.0)℃，濕度50%～60%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。miR-155模擬物(miR155-Mimics)購自廣州銳博生物科技有限公司，F(xiàn)ITC-Foxp3 (鼠8512477180 ，人71577640)、PE-Cy5.5-CD4 (鼠8511004181，人35004280)、PE-IL-17A (鼠8512717781，人12717842)、PE-CD25 (鼠51-0259- 41，人25-0259-42)、PE-Cy5 IgG1(共用PA5-75428)均購自eBioscience公司，IL-17A(鼠1311702， 人512315)、IL-6(鼠1310602， 人430501)、IL-10(鼠1311002， 人501420)等ELISA檢測(cè)試劑盒購自達(dá)科為生物科技有限公司。

1.3 大鼠肺炎模型建立及給藥方法 參照文獻(xiàn)[10]，培養(yǎng)肺炎克雷伯菌(武漢淼靈生物科技有限公司)制備成混懸菌液備用。將大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分成3組，每組13只，分別為對(duì)照組、模型組(重癥肺炎模型)和miR-155組。模型組和miR-155組大鼠麻醉后，以仰臥姿態(tài)固定在操作臺(tái)上，將舌頭固定在口外，聲門顯露，插入氣管約0.5 cm，拔出導(dǎo)絲。0.4 mL的肺炎克雷伯菌液(含菌量1.2×1010CFU/mL)經(jīng)導(dǎo)管注射至大鼠氣管，確保菌液全部進(jìn)入。當(dāng)大鼠出現(xiàn)呼吸急促、喘息、哮鳴音、躁動(dòng)、口唇、耳紫紺等癥狀時(shí)為造模成功[11]。對(duì)照組腹腔注射等體積的無菌生理鹽水。造模前24 h，miR-155組氣管穿刺注入miR-155模擬物40 μg，對(duì)照組和模型組腹腔注射等量無菌生理鹽水。造模成功后24 h，各組大鼠腹主動(dòng)脈采血5 mL(1 mL抗凝全血，其余抗凝離心后取血清)，并剖開胸腔取肺組織，部分于4%多聚甲醛中固定，剩余組織凍存于液氮中。

1.4 miR-155檢測(cè) 提取血清中總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過qRT-PCR檢測(cè)miR-155水平，上海生工生物工程(上海)股份有限公司協(xié)助完成引物設(shè)計(jì)和合成，嚴(yán)格按照SYBR Green PCR 混合試劑盒(德國Qiagen)說明書操作。miR-155正向和反向引物分別是：5’-UUAALUGGUAAUUGUCAUACGGGU-3’和5’-CCCUAUGACAAUUACCAUUAA UU-3’，內(nèi)參為U6，采用2-△△ct法進(jìn)行定量計(jì)算，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Th17和Treg細(xì)胞比例測(cè)定 采用FC500 MCL流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。分別采集重癥肺炎組和健康對(duì)照組研究對(duì)象3 mL抗凝血，F(xiàn)icoll 法分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞，懸液于2個(gè)流式管中，第 1 管中加入 PERCP標(biāo)記的CD4抗體，第2管中加入PERCP標(biāo)記的CD4、FITC標(biāo)記的CD25，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌離心后室溫避光孵育IL-17A 破膜劑A液15 min，清洗。加入IL-17A 破膜劑B液及IL-17A 抗體，通過IgG1做同型對(duì)照，室溫下避光孵育30 min，清洗重懸等待上機(jī)。以相同操作孵育Foxp3對(duì)應(yīng)的抗體，上機(jī)設(shè)門后分別分析CD4-CD25-Foxp3-/CD4-(Th17細(xì)胞)和CD4+IL-17+/CD4+(Treg細(xì)胞)在外周血中的比例。另取大鼠肺組織的單個(gè)核細(xì)胞，調(diào)整至1×106個(gè)/mL，步驟同上。

1.6 ELISA IL-17A、IL-6、IL-10水平檢測(cè) 采用ELISA法。取各組外周血3 mL，EDTA抗凝后3 000 r(有效離心半徑10 cm)，4 ℃下離心10 min，取上層血清。加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(100 μL /孔)至相應(yīng)孔中，封孔、室溫下孵育120 min后洗板5次。加入生物素化抗體工作液(100 μL/孔)，密封室溫孵育60 min，洗板。加入酶結(jié)合物工作液(100 μL /孔)，密封室溫孵育20 min，洗板。100 μL /孔顯色劑顯色，密封室溫孵育20 min。加入終止液混勻檢測(cè)重癥肺炎組、健康對(duì)照組和大鼠對(duì)照組、模型組、miR-155組血清中IL-17A、IL-6和IL-10水平。

1.7 HE染色及形態(tài)學(xué)分析 各組大鼠肺組織采用4%多聚甲醛溶液固定后脫水及石蠟包埋，制成厚度約為5 μm的組織切片，行常規(guī)HE染色，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重癥肺炎患者血清中miR-155及炎癥因子水平 重癥肺炎組患者血清中miR-155水平低于健康對(duì)照組，IL-17A水平高于健康對(duì)照組，IL-10低于健康對(duì)照組，IL-6水平高于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見封三圖1。

2.2 重癥肺炎患者外周血中Th17和Treg的比例 重癥肺炎組患者外周血中Th17細(xì)胞比例高于健康對(duì)照組，Treg細(xì)胞比例低于健康對(duì)照組，Th17/Treg的比值高于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見封三圖2。

2.3 大鼠肺組織的HE染色結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示，正常組大鼠肺小葉結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔結(jié)構(gòu)完整，未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和上皮黏膜脫落現(xiàn)象；模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及出血癥狀；miR-155組大鼠炎性浸潤(rùn)減少；見封三圖3。

2.4 大鼠外周血中Th17和Treg的比例 與正常組相比，模型組大鼠Treg細(xì)胞比例降低，Th17細(xì)胞比例上升，Th17/Treg的比值上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，miR-155組大鼠Treg細(xì)胞比例上升，Th17細(xì)胞比例下降，Th17/Treg的比值下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；見封三圖4。

2.5 大鼠血清中miR-155及炎癥因子水平 與正常組大鼠血清中miR-155的相對(duì)表達(dá)量(1.00±0.13)比較，模型組大鼠miR-155的相對(duì)表達(dá)量(0.42±0.09)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.42，P=0.003)；miR-155組大鼠miR-155的相對(duì)表達(dá)量(1.03±0.16)高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.07，P<0.001)。與正常組相比，模型組重癥肺炎大鼠血清中IL-17A和IL-6水平上升， IL-10水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，miR-155組大鼠血清中IL-17A和IL-6水平下調(diào)，IL-10水平上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；見封三圖5。

3 討論

病毒性肺炎和細(xì)菌性肺炎是導(dǎo)致兒童、老年人、免疫缺陷者和全世界共病者死亡的重要原因[12-13]。肺炎初次感染時(shí)，病毒或者細(xì)菌潛伏在患者體內(nèi)多個(gè)器官中，尤其是肺部。當(dāng)機(jī)體免疫功能受到抑制后，病毒或細(xì)菌將成瀑布式暴發(fā)，與機(jī)體免疫系統(tǒng)形成對(duì)抗[14-16]，最終發(fā)展成重癥肺炎。重癥肺炎作為一種急性呼吸道感染，是常見的高死亡率疾病之一[17]。目前可用于監(jiān)測(cè)肺炎發(fā)展的特異性生物指標(biāo)尚不完善，迫切需要檢測(cè)方便和特異性高的生物指標(biāo)來監(jiān)測(cè)重癥肺炎的發(fā)生發(fā)展，以提高重癥肺炎的確診率。

miRNAs可通過介導(dǎo)RNA裂解、抑制mRNA翻譯或引起mRNA不穩(wěn)定來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。miR-155干擾免疫系統(tǒng)的B細(xì)胞、T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞功能，并在多種疾病中具有不同的表達(dá)模式[18]。本研究結(jié)果顯示，miR-155在重癥肺炎患者和大鼠模型血清中的相對(duì)表達(dá)量均明顯下降，肺部損傷明顯；當(dāng)miR-155過表達(dá)時(shí)，重癥肺炎大鼠肺部損傷減輕，炎性浸潤(rùn)減少，表明miR-155過表達(dá)對(duì)于重癥肺炎大鼠的肺部有一定的保護(hù)功效。miR-155對(duì)人肺組織的保護(hù)作用，仍需進(jìn)一步研究確定。

研究[19-20]顯示，雖然具體觸發(fā)重癥肺炎的機(jī)制尚不明確，但是炎癥反應(yīng)在重癥肺炎進(jìn)展中的地位已明確。當(dāng)初期潛伏的病毒或者細(xì)菌被激活后，宿主自身免疫調(diào)節(jié)開始發(fā)揮作用[16]，這時(shí)多種炎癥因子成瀑布式暴發(fā)，最終由局部肺炎發(fā)展成全身炎癥反應(yīng)，甚至可導(dǎo)致肺部乃至多器官的衰竭。Th17/Treg失衡是炎癥反應(yīng)的重要特征之一，有研究[21]顯示Th17/Treg平衡在肺炎患者中的重要性。本研究結(jié)果顯示，重癥肺炎患者和大鼠模型外周血中Th17細(xì)胞比例明顯增加，Treg細(xì)胞比例明顯降低。在宿主體內(nèi)，當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí)，Th17和Treg細(xì)胞顯示出相反的變化趨勢(shì)，一方面，Th17細(xì)胞主要作用是促進(jìn)炎癥反應(yīng)，這一效應(yīng)通過分泌大量的IL-17并聚集大量炎癥細(xì)胞達(dá)成[22]，此時(shí)機(jī)體內(nèi)的IL-6等其他炎性因子的表達(dá)也會(huì)增多；另一方面，Treg細(xì)胞的主要作用是負(fù)性調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，達(dá)到抑制T細(xì)胞增殖、活化的效應(yīng)，防止自身免疫疾病的發(fā)生，這一效應(yīng)主要通過分泌IL-10等炎性細(xì)胞因子而發(fā)揮免疫抑制功能。本研究結(jié)果顯示，重癥肺炎患者和大鼠模型血清中IL-17A、IL-6水平明顯上升，IL-10水平明顯下降；過表達(dá)miR-155后，重癥肺炎大鼠血清中IL-17A、IL-6水平明顯降低， IL-10水平明顯上升，這一結(jié)果與外周血中Th17/Treg的變化趨勢(shì)一致。

綜上，重癥肺炎患者血清中miR-155的表達(dá)明顯下降，過表達(dá)miR-155后重癥肺炎大鼠的肺組織損傷減少，具體的保護(hù)機(jī)制可能與恢復(fù)Th17/Treg的平衡有關(guān)。