吳 晶，吉偉超，吳維霖，王 輝，鐘佳寧

(1.贛南醫(yī)學(xué)院 a. 2017級(jí)碩士研究生；b. 2017級(jí)臨床醫(yī)學(xué)本科生；c. 科研中心；d.心腦血管疾病防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2. 贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科，江西 贛州 341000)

視網(wǎng)膜的發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜和動(dòng)態(tài)的過程，從胚胎期多能視網(wǎng)膜祖細(xì)胞按一定的時(shí)間順序依次產(chǎn)生所有視網(wǎng)膜細(xì)胞，不僅受到遺傳的精密調(diào)控，也受到表觀修飾的調(diào)控。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(Retinal ganglion cell，RGC)不可逆性凋亡，是青光眼疾病致盲的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)，在青光眼發(fā)病過程中，RGC凋亡早期出現(xiàn)許多基因轉(zhuǎn)錄水平的改變[1]。探究RGC凋亡的機(jī)制以及尋找RGC再生可能是青光眼疾病治療的新趨勢。

5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5hmC)是DNA去甲基化的常見模式，是近年來表觀修飾研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。5hmC主要通過Tets甲基胞嘧啶雙加氧酶(Ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase, Tet)催化5-甲基胞嘧啶(5-methyl cytosine, 5mC)產(chǎn)生。Tets是一類依賴于酮戊二酸和Fe2+起催化作用的雙加氧酶，包括Tet1、Tet2和Tet3[2]。Tet1、Tet2和Tet3具有不同的表達(dá)模式，Tet1和Tet2在小鼠胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)以及ES細(xì)胞中高度表達(dá)，而Tet3在小鼠卵母細(xì)胞和受精卵中高度表達(dá)[2-4]。研究發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜組織中Tets蛋白的表達(dá)模式和胚胎干細(xì)胞中不同。胚胎干細(xì)胞中Tet1、Tet2呈現(xiàn)高水平表達(dá)和Tet3低水平表達(dá)，然而，我們發(fā)現(xiàn)無論是出生后2周或者2個(gè)月的小鼠視網(wǎng)膜組織中，Tet3蛋白含量最高。此外，5hmC的表達(dá)也具有典型的組織特異性，其中腦組織的水平最高[5-6]。5hmC的累積與基因表達(dá)呈正相關(guān)，在神經(jīng)元分化、神經(jīng)的發(fā)育和疾病中發(fā)揮重要作用[7-8]。Weng等[9]研究報(bào)道，5hmC及Tets在中樞神經(jīng)再生中表現(xiàn)出潛在的價(jià)值，DNA去甲基化可能是神經(jīng)系統(tǒng)軸突再生的一個(gè)靶點(diǎn)。然而，5hmC及Tets在視網(wǎng)膜發(fā)育過程中的表達(dá)和功能研究較少。

我們假設(shè)5hmC及Tets的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)對(duì)視網(wǎng)膜的發(fā)育成熟過程至關(guān)重要，可能參與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活的調(diào)控。因此，通過探究小鼠視網(wǎng)膜成熟過程中5hmC的表達(dá)和調(diào)控情況，闡明去甲基化機(jī)制在視網(wǎng)膜疾病的調(diào)控作用，為找到視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡的機(jī)制以及視網(wǎng)膜相關(guān)疾病的認(rèn)識(shí)和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本實(shí)驗(yàn)使用的動(dòng)物雄性野生型C57BL/6J(WT)小鼠來自贛南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心，小鼠維持在我們的動(dòng)物設(shè)施中繁殖和飼養(yǎng)，環(huán)境條件：23 ℃和室溫，12 h光照和黑暗，自由進(jìn)食和飲水。本研究中進(jìn)行的所有動(dòng)物程序均符合ARVO關(guān)于眼科和視力研究中動(dòng)物使用的聲明。

1.1.2主要試劑和儀器Tet1鼠單克隆抗體(GeneTex，美國)，Tet3兔單克隆抗體(GeneTex，美國)，Brn3a鼠單克隆抗體(Santa Cruz，美國)，5hmC兔單克隆抗體(R&D，美國)，5mC兔單克隆抗體 (R&D，美國)，兔抗鼠單克隆抗體(Abcam，美國)，羊抗兔多克隆抗體(Abcam，美國)，AF488mm羊抗鼠綠色熒光IgG (Jackson Immuno Research，美國)，AF594mm羊抗兔紅色熒光IgG (Jackson Immuno Research，美國)，DAPI (Invitrogen，美國)，檸檬酸鹽緩沖溶液(Solarbio，美國)，牛血清 (Solarbio，美國), RIPA緩沖液(Solarbio，美國)， TRIzol(Invitrogen，美國)， RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(Themo，美國)；顯微手術(shù)器械(上海醫(yī)用器械廠)，解剖顯微鏡 (Leica Microsystems Wetzlar GmbH，德國)，冰凍切片機(jī)(Thermo Fisher，美國)，防脫載玻片(Leica，德國)，免疫組化筆PEN-0002(福州邁新生物技術(shù))，激光共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss Jena，德國), 蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)， 蛋白質(zhì)印跡成像儀(GE AI600, 美國)， ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，美國)。

1.2方法

1.2.1視網(wǎng)膜組織制備小鼠處死后取小鼠眼球置于4%PFA室溫固定1 h。1×PBS(pH7.3)洗滌3次，每次10 min，置于解剖顯微鏡下分離視網(wǎng)膜。依次剪去角膜、鞏膜，取出前段和玻璃體制作眼罩。然后將眼罩依次放于10%、20%和30%蔗糖沉底脫水。取出沉底的樣品包埋在OCT中，做好標(biāo)記儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱。在低溫恒溫器上以12 μm厚度切割視網(wǎng)膜組織，選取包含視神經(jīng)切面切片置于65 ℃烘干過夜，置-20 ℃保存。

1.2.2熒光實(shí)時(shí)定量PCR 使用TRIzol試劑從視網(wǎng)膜樣品中提取總RNA，然后使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒根據(jù)制造商的方案合成cDNA，使用SYBR?Green染料, 在Q7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，使用2-△△CT來統(tǒng)計(jì)相對(duì)表達(dá)量。小鼠轉(zhuǎn)錄物的引物序列見表1。

表1 小鼠轉(zhuǎn)錄物的引物序列

1.2.3蛋白免疫印跡小鼠處死后取小鼠視網(wǎng)膜，液氮速凍。每20 mg組織加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液200 μL提取視網(wǎng)膜總蛋白。然后使用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)裂解物并轉(zhuǎn)移到NC膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。取出一抗(Tet1鼠單克隆抗體和Tet3兔單克隆抗體)以最適抗體比例稀釋使用，4 ℃冰箱過夜。在0.1%Triton X-100, 1×PBS(pH7.3)中進(jìn)行3次10 min洗滌。在室溫下進(jìn)行二抗孵育1 h(1∶5 000稀釋)。在0.1%Triton X-100, 1×PBS(pH7.3)中進(jìn)行3次10 min洗滌，滴加化學(xué)發(fā)光液后置于蛋白質(zhì)印跡成像儀檢測蛋白質(zhì)表達(dá)水平。β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參對(duì)照。

1.2.4冰凍切片免疫熒光取出切片烘干30 min，使用檸檬酸鹽緩沖溶液按使用說明進(jìn)行抗原修復(fù)。免疫組化筆標(biāo)記之后，用0.1%Triton X-100, 1×PBS(pH7.3)稀釋獲得的2%正常牛血清白蛋白在室溫下封閉非特異性結(jié)合30 min。取出一抗抗Brn3a，抗5hmC和抗5mC并以最適抗體(brn3a鼠單克隆抗體，5hmC兔單克隆抗體，5mC兔單克隆抗體稀釋比例均為1∶200)稀釋度使用，4 ℃冰箱孵育過夜。在0.1%Triton X-100, 1×PBS(pH7.3)中進(jìn)行6次10 min洗滌。在室溫下避光進(jìn)行二抗孵育1 h(AF 488 mm羊抗鼠綠色熒光IgG，AF 594 mm羊抗兔紅色熒光IgG均按照1∶1 000稀釋)。在0.1%Triton X-100, 1×PBS(pH7.3)中進(jìn)行6次10 min洗滌。1 μg·mL-1DAPI染細(xì)胞核5 min后，在0.1%Triton X-100,1×PBS(pH7.3)中進(jìn)行3次5 min洗滌，甘油封片后使用蔡司共聚焦顯微鏡拍片。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法GraphPad Prism 7.0用于統(tǒng)計(jì)分析和作圖，兩樣本比較使用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié) 果

2.1 5hmC在成熟小鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)我們選擇出生后2周的小鼠和生后2月的小鼠，觀察小鼠視網(wǎng)膜成熟過程中5hmC表達(dá)的情況。我們發(fā)現(xiàn)5hmC在2周小鼠視網(wǎng)膜主要表達(dá)在GCL層，而2月小鼠視網(wǎng)膜各層細(xì)胞(GCL、INL和ONL)均有5hmC表達(dá)(圖1)。此外，5hmC和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(Bra3a標(biāo)記)存在共定位表達(dá)(圖2)。我們?cè)诟弑稊?shù)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)5hmC的表達(dá)主要位于細(xì)胞核內(nèi)靠近細(xì)胞核的周邊部染色質(zhì)(圖3)。因此，5hmC參與小鼠視網(wǎng)膜成熟的過程，可能參與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的調(diào)控。

2.2小鼠成熟過程中Tet蛋白表達(dá)情況我們進(jìn)一步觀察小鼠成熟過程中Tets蛋白的表達(dá)情況，分別取2周齡野生型的小鼠以及出生后2月齡的小鼠視網(wǎng)膜組織，使用qRT-PCR技術(shù)分別檢測視網(wǎng)膜中Tet1、Tet2和Tet3的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)，無論是2周還是2月小鼠視網(wǎng)膜組織中，Tet3的表達(dá)最高，而Tet1的表達(dá)最低(圖4a)。此外，Tet1和Tet2蛋白在2月表達(dá)較2周減少，Tet3蛋白則在2月時(shí)候表達(dá)較2周高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.189,P<0.05)(圖4b)。而我們進(jìn)一步使用蛋白免疫印跡法檢測2周和2月齡小鼠視網(wǎng)膜Tet蛋白的表達(dá)情況，Tet1 蛋白隨著小鼠視網(wǎng)膜成熟表達(dá)降低(t=7.127,P<0.05)，而Tet3的表達(dá)無明顯改變(圖4c)。因此，Tet3是視網(wǎng)膜成熟過程中的主要調(diào)控蛋白，可能介導(dǎo)5hmC參與視網(wǎng)膜的成熟過程。

圖1 5hmC 分別在2周和2月小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(Ganglion cell layer,GCL)、內(nèi)核層(Inter nuclear layer,INL)和外核層(Outer nuclear layer,ONL)細(xì)胞的表達(dá)情況

圖2 2月齡小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和5hmC的表達(dá)共定位

圖3 5hmC在2月齡小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞核定位分布

圖4 Tet1、Tet2和Tet3蛋白分別在小鼠視網(wǎng)膜2周和2月時(shí)候的表達(dá)情況

2.3 5hmC及Tet3在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡過程中的變化我們通過夾傷視神經(jīng)模擬視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的過程來進(jìn)一步探討視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡過程中5hmC及Tet3的變化。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，視神經(jīng)傷(Optic nerve crush, ONC)的第5～7天是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡最明顯的時(shí)候。我們使用免疫熒光技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，相較正常組，夾傷第7天小鼠視網(wǎng)膜5hmC的表達(dá)下降(圖5)。我們進(jìn)一步通過qRT-PCR和蛋白免疫印跡技術(shù)檢測正常組和夾傷第7天小鼠視網(wǎng)膜Tet3的表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)夾傷第7天，Tet3的表達(dá)降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.18,P<0.05)(圖6)。因此，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的過程伴有5hmC及Tet3的降低，5hmC及Tet3可能是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡過程中的標(biāo)志物。

圖5 小鼠視網(wǎng)膜5hmC在視神經(jīng)夾傷第7天(onc7)和對(duì)照組(con)的表達(dá)情況

圖6 小鼠視神經(jīng)夾傷第7天和對(duì)照組視網(wǎng)膜中Tet3蛋白的表達(dá)情況

3 討 論

5hmC是近年來新發(fā)現(xiàn)的DNA表觀遺傳修飾，參與許多生物學(xué)過程，在去甲基化修飾中發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，5hmC是一種獨(dú)立的表觀遺傳標(biāo)記，在極早期的胚胎發(fā)育過程中就已經(jīng)建立[10]。5hmC的富集與轉(zhuǎn)錄激活或者基因的高表達(dá)有關(guān)[11],與細(xì)胞分化、生長發(fā)育、衰老和神經(jīng)發(fā)育等密切相關(guān)[7-8,12]。

視網(wǎng)膜的發(fā)育是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，從胚胎期到出生，由胚胎的神經(jīng)管依次分化發(fā)育成感光細(xì)胞、雙極細(xì)胞、無長突細(xì)胞及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，構(gòu)成精細(xì)而復(fù)雜的視覺傳導(dǎo)通路。睜眼后一周左右(P14～P21)是視網(wǎng)膜的成熟的主要過程，伴有大量的形態(tài)和功能的改變[13]。Perera A等[14]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠出生睜眼后(P14)到出生后一周(P21)視網(wǎng)膜5hmC水平增加。該研究還發(fā)現(xiàn)5hmC的增加還伴隨著與視網(wǎng)膜的神經(jīng)元功能的有關(guān)的基因表達(dá)升高[14]，說明5hmC可能參與小鼠視網(wǎng)膜的成熟相關(guān)基因的調(diào)控。然而，不同于前者的檢測技術(shù)和檢測時(shí)間，我們通過免疫熒光技術(shù)觀察出生后2周和2月小鼠視網(wǎng)膜組織中5hmC的表達(dá)變化，我們發(fā)現(xiàn)相比于2周的小鼠視網(wǎng)膜組織，2月的小鼠視網(wǎng)膜組織5hmC在視網(wǎng)膜各層細(xì)胞(GCL、INL和ONL)均表達(dá)(圖1)。而且，5hmC主要表達(dá)位于細(xì)胞核的異染色質(zhì)部位(圖2)，這也解釋了5hmC主要參與基因的調(diào)控表達(dá)。此外，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)RGC(Brn3a標(biāo)記[15])與5hmC存在表達(dá)的共定位，無論是2周還是2月小鼠視網(wǎng)膜組織都在RGC出現(xiàn)穩(wěn)定的表達(dá)。5hmC可能是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞成熟的表觀標(biāo)記物，參與RGC的調(diào)控。Loh YE等[16]研究發(fā)現(xiàn)中樞性軸索切斷術(shù)后出現(xiàn)廣泛的5hmC及一些再生相關(guān)基因(RAGs)改變，5hmC參與介導(dǎo)哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中的軸突再生。Wahlin等[17]發(fā)現(xiàn)在視網(wǎng)膜發(fā)育期間，視網(wǎng)膜神經(jīng)元的5mC/5hmC調(diào)控與經(jīng)典的半胱天冬酶依賴性細(xì)胞凋亡以及半胱天冬酶-3非依賴性細(xì)胞死亡相關(guān)，可能參與視網(wǎng)膜細(xì)胞的程序性死亡的發(fā)生或進(jìn)展過程。我們的研究也發(fā)現(xiàn)伴隨RGC細(xì)胞的凋亡，出現(xiàn)5hmC及Tet3的表達(dá)下降，而且Tet3在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的過程變化是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，可能參與RGC凋亡的調(diào)控過程(圖3)。

小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育過程中Tets的表達(dá)模式不同于胚胎干細(xì)胞。我們發(fā)現(xiàn)無論是出生后2周或者2個(gè)月的小鼠視網(wǎng)膜組織中，Tet3蛋白含量最高，Tet2次之，Tet1最低(圖4a)。此外，Tets蛋白在哺乳動(dòng)物的發(fā)育中具有不同的功能。Tet1具有CXXC鋅指結(jié)構(gòu)域，不僅識(shí)別未修飾的胞嘧啶，還識(shí)別5mC和5hmC,與高CpG含量的基因組中的區(qū)域結(jié)合[18]。Rudenko A等[19]發(fā)現(xiàn)Tet1敲除小鼠表現(xiàn)出異常的海馬抑制和記憶消退缺陷。Zhang RR等[20]研究發(fā)現(xiàn)，Tet1缺失小鼠的大腦中發(fā)現(xiàn)了海馬神經(jīng)受損和認(rèn)知功能的各種缺陷。我們也在Tet1-/-敲除小鼠視網(wǎng)膜組織發(fā)現(xiàn)5hmC的表達(dá)下降，表現(xiàn)為免疫熒光5hmC表達(dá)變暗。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)小鼠ES細(xì)胞中Tet1的消耗可伴有5hmC部分降低[20-21]，說明Tet1無論在ES和還是成熟的組織中的調(diào)節(jié)作用都不是單一的。

不同于Tet1蛋白，Tet3蛋白是個(gè)多變剪切體，具有3種結(jié)構(gòu)型，包括一種缺少CXXC結(jié)構(gòu)域的N末端135個(gè)氨基酸的結(jié)構(gòu)型和兩種包含CXXC結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)型[22]。Xu等[23]研究斑馬魚眼睛發(fā)現(xiàn)Tet3參與眼和神經(jīng)發(fā)育過程中基因(Pax6，Rx，Six3，Sox2，Sox9和Otx2等)表達(dá)的調(diào)節(jié)。Perera A等[14]也發(fā)現(xiàn)Tet3在眼睛的發(fā)育中可以通過直接激活5mC羥化酶調(diào)節(jié)5mC/5hmC，也可以通過CXXC結(jié)構(gòu)域與目標(biāo)基因的DNA序列結(jié)合等形式參與調(diào)節(jié)[8]。Seritrakul等[24]研究發(fā)現(xiàn)Tet2-/-和Tet3-/-突變的斑馬魚視網(wǎng)膜發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)元的終末分化受到影響，大多數(shù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞不經(jīng)歷末端形態(tài)及軸突的形成。我們發(fā)現(xiàn)，Tet3是小鼠視網(wǎng)膜成熟過程中的主要調(diào)節(jié)蛋白，在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡過程中，伴隨5hmC及Tet3的降低(圖5、圖6)，說明5hmC和Tet3可能在視網(wǎng)膜的發(fā)育以及成熟過程發(fā)揮著重要的作用，可能是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的標(biāo)志物。

綜上，Tets-5hmC 參與視網(wǎng)膜的成熟及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的調(diào)控，可能成為視網(wǎng)膜相關(guān)疾病治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。隨后，可以進(jìn)一步借助測序等技術(shù)驗(yàn)證5hmC在不同視網(wǎng)膜疾病中的差異改變，尋找疾病診斷的潛在表觀標(biāo)志物。此外，深入研究5hmC和Tet3蛋白下游作用的靶點(diǎn)和通路，可能找到青光眼等眼科疾病發(fā)生和發(fā)展的新機(jī)制。