高晨 劉輝 吳宇 姚錫宇

喉癌是頭頸部常見腫瘤之一，以鱗狀細胞癌最多見。目前其主要治療手段為手術(shù)切除配合放射治療、化學治療。早期發(fā)現(xiàn)、早期診療對于減輕喉癌的危害非常重要，可提高患者術(shù)后生存率，也有可能盡量保留喉的發(fā)音功能，減少術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生。因此，通過對喉癌的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移機制的深入研究，在其基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)特異且敏感的分子指標，并將其應(yīng)用于高發(fā)地區(qū)或人群的普查中，實現(xiàn)喉癌的二級預防，這對提高喉癌的療效有著十分重要的意義[1]。

BNIP3基因全長1 535bp，位于10q26.3上。BNIP3是Bcl-2家族中促凋亡蛋白亞類的成員之一。因BNIP3基因在不同腫瘤中表達情況存在差異（乳腺癌中BNIP3基因高表達，胰腺癌中BNIP3基因表達沉默），且有關(guān)研究又發(fā)現(xiàn)BNIP3基因的表達缺失或過表達均可促進腫瘤發(fā)生和發(fā)展[2，3]，使得對BNIP3基因的研究成為相關(guān)凋亡基因研究的熱點。

本研究擬應(yīng)用組織芯片免疫組化S-P染色技術(shù)，應(yīng)用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，觀察喉癌中BNIP3基因的表達情況，探討B(tài)NIP3基因在喉癌中的表達情況及影響因素。

1 材料與方法

1.1 研究對象病例選自2005年1月～2018年12月我院頭頸外科治療的270例喉癌患者，男198例，女72例，平均年齡50.5歲，均經(jīng)臨床和病理明確診斷，通過我院病案管理系統(tǒng)，收集整理患者臨床、病理資料，建立數(shù)據(jù)庫，所有患者術(shù)前檢查均未發(fā)現(xiàn)罹患有糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肝炎、結(jié)核等病史，無術(shù)前放、化療等治療史，取其腫瘤組織細胞檢測，設(shè)為喉癌組；另取對應(yīng)陰性切端的粘膜組織為對照組。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 ①BNIP3兔抗人多克隆抗體（工作濃度1∶200）；②二抗為即用型免疫組化Elivision plus試劑盒（鼠 /兔）（KIT 9901）。

1.2.2 儀器 ①切片機（NP-Q2）；②恒溫烤箱（XTJK200）；③冰箱（BCD-233GM型）；④普通光學顯微鏡（Olympus CX21）；⑤37.0℃恒溫孵育箱（TMC）。

1.3 結(jié)果判斷BNIP3免疫組化染色以胞漿內(nèi)出現(xiàn)特異性染色深淺來進行評分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；再將染色細胞所占百分比來打分：陽性細胞數(shù)＜10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分，兩項乘積即為該例免疫組化得分，0 分，-；1～2 分，+；3～4 分，++；5～6 分，+++。 其中-為陰性，+～++為弱陽性，+++為強陽性，乘積大于6分者歸為強陽性

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 BNIP3基因在喉癌組及對照組中的表達情況免疫組化結(jié)果示，喉癌組（270例）BNIP3基因表達陽性例數(shù)為126例，陽性率為46.7%，對照組（270例）中陽性例數(shù)220例，陽性率為81.5%。與對照組比較，喉癌組BNIP3基因表達陽性率明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=11.2，P＜0.05）。

2.2 BNIP3基因在不同浸潤深度喉癌中的表達情況免疫組化結(jié)果示淺度浸潤組（T1-2，98例）BNIP3基因表達陽性例數(shù)為66例，陽性率為67.3%，深度浸潤組（T3-4，172例）陽性例數(shù)60例，陽性率為34.9%，對照組（270例）中陽性例數(shù)220例，陽性率為81.5%。①與淺度浸潤組比較，深度浸潤組BNIP3基因表達陽性率明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；②與對照組比較，淺度浸潤組和深度浸潤組BNIP3基因表達陽性率有不同程度降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3 BNIP3基因在不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的喉癌中的表達情況免疫組化結(jié)果示無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（78例）BNIP3基因表達陽性例數(shù)為42例，陽性率為53.9%，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（192例）陽性例數(shù)為84例，陽性率為43.8%，對照組（270例）中陽性例數(shù)220例，陽性率為81.5%。①與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組比較，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組BNIP3基因表達陽性率明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；②與對照組比較，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組BNIP3基因表達陽性率有不同程度降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.4 BNIP3基因在不同TNM分期喉癌中的表達情況免疫組化結(jié)果示早期喉癌組（62例）BNIP3基因表達陽性例數(shù)為39例，陽性率為62.9%，中晚期喉癌組（208例）陽性例數(shù)為87例，陽性率為41.8%，對照組（270例）中陽性例數(shù)220例，陽性率為81.5%。①與早期喉癌組比較，中晚期喉癌組BNIP3基因表達陽性率明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；②與對照組比較，早期喉癌組和中晚期喉癌組BNIP3基因表達陽性率有不同程度的降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.5 BNIP3基因在不同分化程度喉癌中的表達情況免疫組化結(jié)果示高分化組（80例）BNIP3基因表達陽性例數(shù)為50例，陽性率為62.5%，中分化組（132例）陽性例數(shù)為63例，陽性率為47.7%，低分化組（58例）陽性例數(shù)為13例，陽性率為22.4%，對照組（270例）中陽性例數(shù)220例，陽性率為81.5%。①與高分化組比較，中分化組和低分化組BNIP3基因表達陽性率均有不同程度降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；②與中分化組比較，低分化組BNIP3基因表達陽性率顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；③與對照組比較，高分化組、中分化組及低分化組BNIP3基因表達陽性率均有不同程度降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

此外，胞漿內(nèi)的特異性染色（BNIP3）在周邊區(qū)域的癌細胞中表現(xiàn)為深染，比腫瘤中心區(qū)域和正常粘膜區(qū)域的染色深（見圖1）。

圖1 喉癌周邊區(qū)域癌細胞染色情況

3 討論

喉癌細胞中BNIP3基因表達陽性率低于粘膜組織中BNIP3基因表達陽性率說明其可能通過某些機制導致BNIP3基因表達沉默。本研究中深度浸潤組BNIP3基因表達陽性率明顯低于淺度浸潤組及對照組。表明BNIP3基因的表達可能與浸潤深度有一定聯(lián)系。

Yanmshita等[4]研究發(fā)現(xiàn)BNIP3基因的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)。本研究中：與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組比較，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組BNIP3基因表達陽性率明顯降低，說明喉癌中BNIP3基因的表達可能與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否有一定關(guān)系。

TNM分期系統(tǒng)是目前國際上最為通用的腫瘤分期系統(tǒng)，是對惡性腫瘤進行分期的標準方法。本研究中：與早期喉癌組比較，中晚期喉癌組BNIP3基因表達陽性率明顯減低；與對照組比較，早期喉癌組和中晚期喉癌BNIP3基因表達陽性率有不同程度降低。說明喉癌中BNIP3基因的表達可能與其TNM分期相關(guān)。腫瘤細胞的分化程度是指腫瘤細胞接近于正常細胞的程度。腫瘤細胞的分化程度越差，其惡性程度就越高，且容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。Abe等[5]研究發(fā)現(xiàn)：低分化胰腺癌BNIP3基因表達陽性率顯著降低。本研究亦發(fā)現(xiàn)：低分化喉癌BNIP3基因表達陽性率明顯降低。本研究中：與高分化組比較，中分化組和低分化組BNIP3基因表達陽性率均有不同程度減低；與中分化組比較，低分化組BNIP3基因表達陽性率顯著降低，這表明分化程度越低，喉癌中BNIP3基因表達降低越明顯。

缺氧是實體腫瘤發(fā)展過程中持續(xù)存在的情況。當缺氧達一定程度后，即可引起腫瘤細胞蛋白質(zhì)組的改變和/或細胞內(nèi)信號傳導過程，導致細胞受損性生長或死亡（細胞周期阻滯、細胞分化抑制、細胞凋亡等）。HIF-1是缺氧作用機制中的核心轉(zhuǎn)錄因子。BNIP3基因?qū)儆贖IF-1應(yīng)答基因之一[6]。本研究亦發(fā)現(xiàn)：胞漿內(nèi)的特異性染色（BNIP3）在周邊區(qū)域的癌細胞中表現(xiàn)為深染（該區(qū)域易發(fā)生缺氧），比腫瘤區(qū)域和正常粘膜區(qū)域的染色深。由于喉癌周邊區(qū)域極易發(fā)生缺氧[7]，考慮缺氧可導致喉癌細胞中BNIP3基因的高表達。

由本研究可知：①喉癌細胞中BNIP3基因的表達異常降低；②喉癌細胞中BNIP3基因表達隨著腫瘤浸潤深度的進展而降低得更明顯；③伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，喉癌細胞中BNIP3基因表達陽性率降低較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者明顯；④喉癌細胞中BNIP3基因表達在中晚期降低更明顯；⑤分化程度越差，喉癌細胞中BNIP3基因表達降低越明顯。總之，喉癌細胞中BNIP3基因表達與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期、腫瘤細胞分化程度有一定關(guān)系。

綜上所述，檢測BNIP3基因有望成為喉癌診治的新靶點及其預后判斷的分子標記物。為進一步明確BNIP3基因在喉癌發(fā)病中的作用機制，本研究后期或?qū)⒖紤]從細胞層面對其進行驗證。

本研究存在一定局限性，本研究為橫斷面研究，缺乏喉癌患者自身不同階段的動態(tài)資料，有待增加后期隨訪工作，行進一步研究；本研究只分析探討了幾個腫瘤病理特征與檢測指標的相關(guān)性，未對其他臨床及患者個人相關(guān)因素進行分析；且各組之間樣本量差別較大，可能會使結(jié)果產(chǎn)生一定的偏倚，有待進一步增加樣本量減小誤差。