徐家根，顧琦欣，傅辰超

1 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，南京市口腔醫(yī)院 藥學(xué)部，南京 210008；2 南京優(yōu)科制藥有限公司，南京 210009

注射用頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉[1]用于治療由頭孢噻肟單藥耐藥、對本復(fù)方敏感的產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌引起的中、重度感染藥物。原料藥頭孢噻肟鈉其工藝引入的2-巰基苯并噻唑[2]屬于基因毒性雜質(zhì)[3]，將其作為已知特定雜質(zhì)進行控制研究。

2-巰基苯并噻唑是一種淡黃色粉末或顆粒，具有令人不愉快的氣味；熔點在173.0℃以上；難溶于水和正己烷，易溶于丙酮，可溶于乙醇，且具有紫外吸收。高效液相色譜儀中的紫外檢測器檢測靈敏度高，對于高沸點、大分子、強極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢，所以選擇液相色譜法紫外檢測器檢測注射用頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉中2-巰基苯并噻唑的限度更為準(zhǔn)確、靈敏。本方法測定的復(fù)方制劑頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉，與文獻(xiàn)中的頭孢噻肟鈉相比，成分更加復(fù)雜，在文獻(xiàn)的色譜條件下檢測時，存在干擾，見圖1。本方法能夠為檢測注射用頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉中2-巰基苯并噻唑限度提供有效控制方法[4]。

1 材 料

1.1 儀器

LC20-AT 高效液相色譜儀，含真空脫氣機、自動進樣器、二極管陣列檢測器、柱溫箱；梅特勒分析天平（xs-205）。

1.2 藥品與試劑

2-巰基苯并噻唑?qū)φ掌?（純度：97%，Sigma-Aldrich）；注射用頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉（2∶1，規(guī)格：1.5 g，批號：20190601、20190701、20190702，南京優(yōu)科制藥有限公司）；乙醇為分析純；實驗用水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 限度確認(rèn)及各溶液濃度設(shè)定依據(jù)

2-巰基苯并噻唑在世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)公布的致癌物清單中，它屬于2A 類致癌物，被視為潛在基因毒性雜質(zhì)。在《ICH M7 指導(dǎo)原則》推薦的CPDB 毒性數(shù)據(jù)庫中檢索到2-巰基苯并噻唑的半數(shù)中毒量（TD50值）為344 mg·kg-1·d-1，其主要由頭孢噻肟鈉生產(chǎn)工藝引入的基因毒雜質(zhì)，在計算限度值時需要通過頭孢噻肟鈉的限度值按比例換算。在日本參比制劑（注射用頭孢噻肟鈉，單方）說明書中，注射用頭孢噻肟鈉最大日劑量為12g，日最大劑量比本品中頭孢噻肟鈉日最大劑量高，為保證安全使用12 g 作為日最大劑量計算限度值，得到在頭孢噻肟鈉中2-巰基苯并噻唑的限度為28.6 ppm，從藥品安全性出發(fā)，將限度收緊至25 ppm。本品說明書“用法用量”項下舒巴坦最大日劑量為4 g，可得頭孢噻肟最大日劑量為8 g，故等比計算限度應(yīng)為37.5 ppm。為嚴(yán)格控制并修訂限度值為0.0035%，計算公式如下：

AI（mg·d-1）=TD50（mg·kg-1·d-1）/50000×50 kg

限度（ppm）=AI（mg·d-1）/最大日劑量（g·d-1）×103

根據(jù)“2.4”項下結(jié)果，可知2-巰基苯并噻唑定量限濃度為0.03088 μg·mL-1，為保證檢驗的重現(xiàn)性與準(zhǔn)確度，選取2-巰基苯并噻唑定量限濃度的3～5倍作為對照品溶液的濃度。因此確定對照品溶液濃度為0.15 μg·mL-1，依據(jù)限度為0.0035%，為方便稱量樣品，確定供試品溶液濃度為4.5 mg·mL-1。根據(jù)分析天平分度值要求及操作規(guī)定，本檢驗方法設(shè)計供試品取樣量為45 mg。

2.2 色譜條件

采用高效液相色譜法[4]。色譜柱：Kromasil（100-5-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-10 mmol·L-1乙酸銨（55∶45）；柱溫：30 ℃；檢測波長：320 nm；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：10 μL。

2.3 溶液配制

對照品儲備溶液：取2-巰基苯并噻唑?qū)φ掌愤m量，精密稱定，加乙醇-水（90∶10）溶解并定量稀釋制成每毫升中約含2-巰基苯并噻唑為1.0μg 儲備溶液。

對照品溶液：精密量取對照品儲備溶液1 mL，置10mL 量瓶中，加入乙醇-水（90∶10）稀釋至刻度，搖勻。

供試品溶液：取本品45 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加乙醇-水（90∶10）至刻度，搖勻。

系統(tǒng)適用性溶液：取本品45 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶中，再精密量取對照品儲備溶液1 mL，置同一10 mL 量瓶中，加入乙醇-水（90∶10）稀釋至刻度，搖勻。

空白溶劑：乙醇-水（90∶10）。

2.4 專屬性考察

取空白溶劑、系統(tǒng)適用性溶液、對照品溶液和供試品溶液各適量，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，通過比較圖2 可知，空白溶劑不干擾本品中2-巰基苯并噻唑的測定，在系統(tǒng)適用性溶液中2-巰基苯并噻唑單一出峰，其保留時間為8.140 min，峰純度為1000。對照品溶液中2-巰基苯并噻唑的保留時間為8.067 min，其理論板數(shù)為7502。為此，該方法專屬性良好，適合本品中2-巰基苯并噻唑的限度測定。

2.5 檢測限及定量限確定

取“2.3”項下對照品儲備溶液，分別用乙醇-水（90∶10）逐級稀釋后，量取10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按信噪比10∶1 計算定量限，其為0.03088 μg·mL-1；按信噪比3∶1 計算檢測限，其為0.01544μg·mL-1。

2.6 線性范圍

取“2.3”項下對照品儲備溶液適量，用乙醇-水（90∶10）稀釋制成每毫升中約含2-巰基苯并噻唑為約1μg 的溶液，精密量取該溶液0.3、0.6、1.0、1.2、1.5、2.0mL，分別置于10mL 量瓶中，用乙醇-水（90∶10）稀釋至刻度，搖勻，作為2-巰基苯并噻唑?qū)φ掌废盗腥芤骸＞芰咳「飨盗腥芤?0 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算回歸方程。見表1、表2。

表1 2-巰基苯并噻唑標(biāo)準(zhǔn)曲線制備試驗結(jié)果

表2 耐用性試驗結(jié)果

試驗結(jié)果表明，2-巰基苯并噻唑濃度在0.03088～0.2058 μg·mL-1峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系（r=0.9995）。

2.7 進樣精密度試驗

取“2.3”項下對照品溶液，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，連續(xù)進樣6 次，計算各溶液峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明，其進樣精密度為1.6%，小于4%，進樣精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗

精密稱取本品約45 mg，計6 份，采用擬定的測定方法分析。結(jié)果表明，2-巰基苯并噻唑的重復(fù)性試驗的RSD 為2.1%，方法重復(fù)性良好。

2.9 耐用性試驗

本試驗分別考察了不同柱溫、檢測波長、流速、流動相中甲醇比例對本品中2-巰基苯并噻唑限度測定的影響。由表2 可知，上述因素在一定范圍內(nèi)變化對本品中2-巰基苯并噻唑的影響不大，2-巰基苯并噻唑峰均能滿足本品雜質(zhì)限度測定的要求。

2.10 回收率試驗

取注射用頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉 （批號：20190601）90 mg，共9 份，精密稱定，分別置于20 mL量瓶中，根據(jù)“2.8”項下結(jié)果供試品中2-巰基苯并噻唑的檢出量為0.0018%，因此加標(biāo)回收率溶液需向供試品中加入對照品儲備液0.6、1.0、1.4 mL（n=3），用乙醇-水（90∶10）溶解稀釋并定容至刻度，搖勻，作為待測溶液，按照“2.2 項下”色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計算測得量。2-巰基苯并噻唑平均回收率為99.43%，均在80%～120%，平均RSD 為1.0%。

2.11 供試品測定

取3 批供試品各適量，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，計算注射用頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉中2-巰基苯并噻唑的限度。結(jié)果表明，在3 批供試品中2-巰基苯并噻唑的殘留量均小于0.0035%，符合質(zhì)檢要求。見表3。

表3 樣品中2-巰基苯并噻唑測定結(jié)果

3 討論

注射用頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉為β-內(nèi)酰胺類抗生素與β-內(nèi)酰胺酶抑制劑組成的復(fù)方制劑，具有抗菌譜廣、抗菌活性強、療效確切、不良反應(yīng)輕的特點。為保證該品質(zhì)量，采取有效的技術(shù)手段盡可能的減少基因毒性雜質(zhì)在產(chǎn)品中的殘留量。本文建立的檢測方法具有選擇性好、靈敏度高的優(yōu)點，與文獻(xiàn)報道的方法[5]比更好，本法樣品配制簡便，不需要萃取，可直接配制進樣。