茅宇娟，王 歡，曾 陵，陳 虹

(1.張家港市中醫(yī)醫(yī)院 藥劑科，江蘇 張家港 215600；2.雷允上藥業(yè)集團(tuán)有限公司，江蘇 蘇州 215009；3.蘇州富士萊醫(yī)藥股份有限公司,江蘇 蘇州 215522)

薏苡仁，俗稱米仁、六谷子，又名薏仁、薏米、苡仁等，為禾本科植物薏苡Coixlacryma-jobiL. var. mayuen (Roman) Stapf的干燥成熟種仁，具有健脾、除痹、滲濕和止瀉等功效，臨床上主要用于治療水腫、濕痹拘攣、小便不利、腳氣以及脾虛瀉泄等病癥[1-2]。薏苡仁主要分布于福建、河北和遼寧等地，在我國長江以南(貴州、廣西、福建和臺灣)、泰國、越南和老撾等地均有種植[3-4]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：薏苡仁的主要活性成分包括大分子如多糖類，小分子如內(nèi)酰胺類、不飽和脂肪酸類及酯類等，具有降血糖、抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛以及提高機(jī)體免疫力等藥理活性[5-6]。薏苡仁中含多糖類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)65%～70%，其中淀粉占60%～65%，其他多糖占5%[7]。劉想[8]采用高效液相色譜法(HPLC)對純化后的薏苡仁多糖進(jìn)行了組成分析，證明薏苡仁多糖包括鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。

目前，測定多糖中單糖組成的定量方法還有很多，例如早期常用的薄層色譜法[9]、紫外分光光度法、高效液相色譜-紫外檢測法[10]等，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，現(xiàn)在的檢測方法也越來越多，例如高效液相色譜-示差檢測法[11]、高效液相體積排阻色譜法[12]、離子色譜法[13]和高效毛細(xì)管電泳法[14]等。本實驗采用HPLC聯(lián)合通用型蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)對薏苡仁多糖的單糖組成進(jìn)行測定，該方法與其他幾種方法相比，具有以下優(yōu)點：1)對于分析單糖組成復(fù)雜的多糖，該方法分離度好，靈敏度高，對于常見的單糖成分均能達(dá)到有效分離；2)供試品溶液的制備方法簡單，無須進(jìn)行柱前衍生化，即可直接進(jìn)行測定；3)色譜條件成本較低，其中色譜柱是氨基柱，相對于其他方法的毛細(xì)管柱、糖柱更經(jīng)濟(jì)；4)該方法準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、操作快捷，是一種值得大力推廣的單糖組成分析方法。

目前對薏苡仁多糖的研究主要還是集中在藥理實驗上，而對其結(jié)構(gòu)組成卻缺乏數(shù)據(jù)，本實驗采用HPLC-ELSD法對薏苡仁多糖的單糖組成進(jìn)行測定，旨在為闡明薏苡仁多糖的結(jié)構(gòu)組成奠定基礎(chǔ)，以期為構(gòu)效關(guān)系及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的分析提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

三氟乙酸(HPLC)，美國Sigma-Aldrich公司；乙腈(HPLC)，美國Merck公司；其他試劑均為分析純。D-甘露糖(批號：LG20M03)、L-阿拉伯糖(批號：LMA0L06)和巖藻糖(批號：L630014),北京百靈威科技有限公司;L-鼠李糖(批號：10158772),阿法莎(天津)化學(xué)有限公司;D-葡萄糖醛酸(批號：140648-200602),中國藥品生物制品檢定所;D-半乳糖醛酸(批號：A0404A),大連美侖生物技術(shù)有限公司;D-葡萄糖(批號：K7TFO-CN),東京化成工業(yè)株式會社;D-半乳糖(批號：10509),德國Augsburg公司;薏苡仁多糖(批號：20161212、20161214和20161218),自制。

1.2 儀器設(shè)備

Agilent 1260型高效液相色譜儀、ELSD檢測器，美國Agilent公司；R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士布奇公司；CPA224D型電子分析天平，德國賽多利斯公司；純水儀，美國密理博公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市精達(dá)儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

Supelco?APHERA NH2Polymer色譜柱(150 mm×2 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.05 mol/L醋酸銨溶液(體積比為85∶ 15)；流速為0.2 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為35 ℃；ELSD檢測條件：蒸發(fā)溫度為60 ℃，載氣流量為1.6 L/min。

1.3.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、葡萄糖醛酸(GlcA)、鼠李糖(Rha)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glc)、阿拉伯糖(Ara)和巖藻糖(Fuc)對照品50 mg，置同一50 mL量瓶中，加適量水使其溶解，并定容至刻度、搖勻，即得混合單糖對照品儲備液。

1.3.3 薏苡仁多糖的制備

稱取薏苡仁適量，搗碎，加10倍量95%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙醇回流提取2次，每次2 h，過濾，藥渣晾干至無醇味，加10倍量的水水浴提取2次，每次2 h，趁熱過濾，合并濾液，減壓濃縮，加入95%乙醇，使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)80%，4 ℃下靜置4 h，離心，沉淀減壓干燥，即得薏苡仁多糖。

1.3.4 供試品溶液的制備

精密稱取薏苡仁多糖干燥品10 mg，置安瓿瓶中，加入2 mol/L三氟乙酸5 mL，密封，于110 ℃下水解8 h，冷卻至室溫，準(zhǔn)確移取1 mL水解液，80 ℃ N2吹干，加60%(體積分?jǐn)?shù))乙腈轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中并定容至刻度，搖勻、過濾，取續(xù)濾液，即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)適用性試驗

在1.3.1項色譜條件下，Man、Gal、GlcA、Rha、GalA、Glc、Ara、Fuc 8種單糖分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)以8種單糖計均不低于4 000，如圖1所示。由圖1可知，該色譜系統(tǒng)適用性良好，可以用來準(zhǔn)確測定薏苡仁多糖中的單糖組成。

圖1 對照品溶液(a)、供試品溶液(b)的 HPLC-ELSD色譜Fig.1 HPLC-ELSD chromatogram of reference solution (a) and test solution (b)

在進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗過程中，本實驗對洗脫條件進(jìn)行了優(yōu)化。氨基柱分析多糖類成分所用流動相通常為乙腈和水按一定比例組成的混合溶液。實驗初期使用的流動相就是不同比例的乙腈-水混合溶液，但均不能達(dá)到良好的分離度，可能由于涉及的單糖種類太多，且極性過于相近，于是往水中加入緩沖鹽醋酸銨，配制成濃度為0.05 mol/L的溶液，結(jié)果8種單糖均得到良好分離，故最終確定流動相為乙腈-0.05 mol/L醋酸銨溶液，體積比85∶ 15。

本實驗還對ELSD的檢測條件進(jìn)行了優(yōu)化。通常影響測定結(jié)果的最主要參數(shù)就是蒸發(fā)溫度和載氣流量，其對信噪比影響很大。本實驗考察蒸發(fā)溫度的點分別為50、60、70和80 ℃，載氣流量分別為1.2、1.6和2.0 L/min，結(jié)合信噪比結(jié)果見圖2。由圖2可知：蒸發(fā)溫度在50 ℃時信噪比最低，60 ℃最高，70和80 ℃居中；而載氣流量對信噪比的影響則是1.6 L/min最大，故最終選擇蒸發(fā)溫度為60 ℃，載氣流量為1.6 L/min，此條件下系統(tǒng)靈敏度最高。

圖2 蒸發(fā)溫度(a)和載氣流量(b)對信噪比的影響Fig.2 Effects of evaporation temperature (a) and carrier gas flow rate (b) on signal-to-noise ratio

2.2 線性關(guān)系考察

分別精密量取1.3.2項下的儲備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得對照品系列溶液。按1.3.1節(jié)中的色譜條件進(jìn)樣測定，以對照品進(jìn)樣量的對數(shù)為橫坐標(biāo)X，單糖峰面積的對數(shù)為縱坐標(biāo)Y進(jìn)行線性回歸，結(jié)果顯示各成分線性關(guān)系良好，回歸方程見表1。由表1可知：8種單糖的回歸方程相關(guān)系數(shù)均大于0.999，在0.5～5μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，因此可以準(zhǔn)確測定8種單糖的含量。

表1 8種單糖線性關(guān)系

2.3 精密度試驗

取1.3.2節(jié)中的方法配制所得的對照品溶液(濃度為0.2 mg/mL)，在1.3.1節(jié)中的色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得8種單糖峰面積，計算得GlcA、Man、Fuc、Rha、GalA、Gal、Ara和Glc峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.15%、1.55%、1.25%、1.44%、1.58%、0.83%、1.37%和1.77%，RSD值均低于2%，表明儀器精密度良好。

2.4 重復(fù)性試驗

稱取6份同一批次的樣品(批號：20161212)，按1.3.4節(jié)中的方法制備供試品溶液的方法進(jìn)行操作，依1.3.1節(jié)中的方法色譜條件進(jìn)樣測定峰面積。結(jié)果表明：該多糖主要由7種單糖組成，分別為Glc、Rha、Gal、GlcA、Man、Fuc和Ara，其含量RSD分別為1.26%，1.44%，1.65%，1.84%、0.77%，1.17%、0.94%，表明重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取2.4節(jié)中的方法制備的同一份供試品溶液，以1.3.1節(jié)的色譜條件，分別于0、2、4、8、12和24 h 進(jìn)樣測定，結(jié)果表明：Glc、Rha、Gal、GlcA、Man、Fuc和Ara峰面積的RSD分別為1.34%、0.63%、1.78%、1.19%、0.85%、1.63%和1.54%，表明供試品在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 回收率試驗

稱取批號為20161212的薏苡仁多糖5 mg，共6份，分別精密加入一定量的Glc、Rha、Gal、GlcA、Man、Fuc和Ara對照品溶液，使加入量與供試品中含量比約為1∶ 1，分別按1.3.4節(jié)中的供試品溶液制備方法操作，并在1.3.1節(jié)中的色譜條件進(jìn)行測定，測定峰面積，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算回收率，結(jié)果見表2。由表2可知：該方法回收率良好，回收率均在97.4%～100.4%。

表2 回收率實驗結(jié)果(n=6)

2.7 樣品測定

分別取3批薏苡仁多糖，分別按1.3.4節(jié)中的供試品溶液制備方法操作，并在上述色譜條件下進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。

由表3可知：薏苡仁多糖主要由Glc組成，另外還含有少量的Gal、Fuc、Rha、GlcA、Man和Ara。本研究制備所得薏苡仁多糖組成與劉想[8]報道的結(jié)果略有不同，本研究結(jié)果比其多了GlcA和Fuc，少了木糖(Xyl)，推測原因可能是由于制備純化工藝不同，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)組成略有差異。

表3 薏苡仁多糖中單糖組成測定結(jié)果(n=3)

3 結(jié)論

建立了一種適用于測定薏苡仁多糖中單糖組成的HPLC-ELSD方法，通過色譜條件優(yōu)化，最終確立最佳色譜條件：色譜柱為Supelco?APHERA NH2Polymer色譜柱 (150 mm×2 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.05 mol/L醋酸銨溶液(體積比85∶ 15)；流速為0.2 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL； 柱溫為35 ℃；ELSD檢測條件為漂移管溫度為60 ℃，載氣流量為1.6 L/min。研究結(jié)果表明：Man、Gal、GlcA、Rha、GalA、Glc、Ara和Fuc的進(jìn)樣量對數(shù)值與峰面積對數(shù)值在一定范圍內(nèi)均呈現(xiàn)出較好的線性關(guān)系(0.991～0.999 9)，回收率均在97.4%～100.4%，RSD均小于2%。證明該測定方法準(zhǔn)確可靠，分離效果好，可用于測定薏苡仁多糖的單糖組成。