蔣 緯，王嘉瑩，何 鴻

（1.遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，貴州遵義 563006；2.遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義 563000）

正安野木瓜是貴州省遵義市正安縣特色資源之一，野木瓜是木通科野木瓜屬植物的干燥莖枝[1-3]，野木瓜中有多種活性成分，特別含有大量膳食纖維。近年來，營養(yǎng)相關(guān)疾病的高發(fā)，使得消費者逐漸增加了對營養(yǎng)平衡和合理膳食的關(guān)注，而膳食纖維的攝入可有效調(diào)節(jié)人體糖脂代謝，降低膽固醇含量，對預(yù)防高血壓、心梗、糖尿病、便秘和結(jié)腸癌等都具有較好的功效。目前，國內(nèi)對薔薇科木瓜屬木瓜抗氧化活性有研究[4-6]，也有以番木瓜科番木瓜抗氧化活性開展的研究[7-9]，鮮有通過微波法、超聲堿法、雙酶法、酸堿法、超聲酶法5種方法對比野木瓜提取率的報道，也尚未見到野木瓜膳食纖維抗氧化特性的相關(guān)研究。試驗以正安野木瓜為原料，用不同方法提取野木瓜膳食纖維，并研究了其對體外抗氧化特性的影響，以期為野木瓜膳食纖維的有效成分的資源化利用、提升提高野木瓜的附加值，開發(fā)野木瓜膳食纖維功能性食品提供科學(xué)依據(jù)，同時為后續(xù)有關(guān)野木瓜的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

野木瓜，購自遵義市正安縣；α-淀粉酶5 000 U/g，上海源葉生物有限公司提供；木瓜蛋白酶（80×104U/g），北京索萊寶生物有限公司提供；無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、過氧化氫、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、六水合三氯化鐵、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯乙酸、水楊酸等，均為分析純；DPPH（1,1二苯基-2-苦基肼），上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司提供。

1.2 試驗儀器

恒溫水浴鍋，鄭州長城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；低速離心機，東旺儀器廠產(chǎn)品；TG18-WS型臺式高速離心機，長沙維爾湘鷹離心機有限公司產(chǎn)品；BPG-9140A型精密鼓風干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；FA2004N型電子天平，上海菁海儀器有限公司產(chǎn)品；SHB-Ⅲ型循環(huán)水多用真空泵，北京泰和格潤儀器有限公司產(chǎn)品；P70D20N1P-G5（SO）型格蘭仕微波爐，廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司產(chǎn)品；DFY-200C型萬能粉碎機、BL13-300H型數(shù)控超聲波清洗器，上海比朗儀器有限公司產(chǎn)品；PHS-3C型酸度計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品；TU-1810型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司產(chǎn)品；玻璃棒，燒杯，移液管等玻璃儀器若干。

1.3 試驗方法

1.3.1 野木瓜粉末的制備

將野木瓜切片后于60℃熱風干燥箱中烘干，粉碎機粉碎60目過篩收集作為原料備用。

1.3.2 野木瓜膳食纖維的制備

（1）酸堿法。采用李慧蕓等人[10]的方法并略做改動。取20 g原料按照料液比1∶25（g∶mL） 加入濃度1 mol/L的HCI溶液，用濃度10 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值1.0，在80℃下水解90 min，得到酸解液，隨后進行離心處理，離心后取上清液，抽濾后得濾餅，按照料液比1∶20（g∶mL） 加入質(zhì)量分數(shù)1.4%NaOH溶液，在75℃條件下堿解80 min，離心后得上清液和下沉淀，其中沉淀進行干燥后便為IDF，上清液進行抽濾后再經(jīng)過4倍體積的無水乙醇醇沉2 h，以轉(zhuǎn)速3 500 r/min離心20 min，沉淀干燥至恒質(zhì)量即為SDF。

（2） 雙酶法。采用賈瑋等人[7]的方法。取原料20.0 g按照料液比1∶20（g∶mL） 加入蒸餾水，用濃度1.0 mol/L的HCl和NaOH調(diào)節(jié)pH值6.0，先加400 μL酶活力為5 000 U/g的α-淀粉酶，在60℃下，酶解35 min，升溫至100℃，滅酶活10 min后冷卻，再調(diào)節(jié)pH值6.0，加400 μL酶活力為8 000 U/g的木瓜蛋白酶，在40℃條件下酶解35 min，升溫至100℃，滅酶活10 min，將酶解好的溶液進行離心，離心后沉淀直接干燥為IDF，上清液抽濾后用4倍體積的無水乙醇進行醇沉后，以轉(zhuǎn)速3 500 r/min離心20 min，離心后棄去上清液，沉淀干燥至恒質(zhì)量即為SDF。

（3） 微波輔助法。參照羅歡[11]的方法。取原料20.0 g，按照料液比1∶28（g∶mL） 加入蒸餾水，用濃度1 mol/L HCI溶液和NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值2，然后進行功率為560 W微波處理，微波時間為135 s，將提取液進行離心處理，離心后的沉淀直接進行干燥得IDF，上清液抽濾后用4倍體積的無水乙醇醇沉1 h，以轉(zhuǎn)速3 500 r/min離心20 min，沉淀干燥既得SDF。

（4） 超聲輔助堿法。參照羅歡[11]的方法略有改動。取原料20.0 g，按照料液比1∶20（g∶mL） 加入質(zhì)量分數(shù)為4%的NaOH溶液，在功率120 W，溫度55℃條件下處理80 min，將處理后的原液進行離心，沉淀直接干燥即為IDF，上清液抽濾后用4倍體積的無水乙醇醇沉2 h后，以轉(zhuǎn)速3 500 r/min離心20 min，離心后的沉淀直接進行干燥，得到SDF。

（5） 超聲波輔助酶法。稱取20 g原料，按照料液比1∶20（g∶mL） 加入蒸餾水，用濃度1.0 mol/L的HCI和NaOH調(diào)節(jié)pH值6.0，加200 μL酶活力5 000 U/g的木瓜蛋白酶，在溫度40℃、功率120 W條件下超聲波輔助酶解35 min，后升溫至100℃，滅酶活10 min，將酶解好的溶液進行離心，離心后沉淀直接干燥為IDF，上清液抽濾后用4倍體積的無水乙醇進行醇沉2 h后，以轉(zhuǎn)速3 500 r/min離心20 min，離心后棄去上清液，沉淀干燥，得到SDF。

1.3.3 抗氧化活性成分的提取

參考周小理等人[12]的研究方法，并略有改動。分別稱量提取的野木瓜膳食纖維SDF和IDF各2 g，用70%的乙醇溶液，按照料液比1∶50（g∶mL） 加入，于70℃恒溫水浴中浸提5 h，并以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心10 min，取上清液作為樣品液備用。

1.3.4 抗氧化活性成分的測定

（1） 總還原能力的測定。準確量取2.5 mL樣品液，加入2.5 mL的濃度為0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH值6.6）和2.5 mL 1%鐵氰化鉀，于50℃下水浴20 min后急速冷卻，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，后取5 mL反應(yīng)液，加入4 mL蒸餾水及0.5 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，將溶液均勻混合后反應(yīng)10 min，于波長700 nm處測定其吸光度[13]。

（2）DPPH自由基清除率的測定。參照石秀梅等人[14]的研究方法，準確稱取DPPH用無水乙醇配成儲備液（1.0×10-3mol/L）保存于冰箱中冷藏備用，使用時再將其稀釋10倍。取1.0 mL的1.0×10-4mol/L（DPPH-乙醇溶液）與3.0 mL樣品溶液混勻，在避光常溫條件下反應(yīng)30 min后，于波長517 nm處測定其吸光度。

按照下式計算DPPH自由基清除率：

式中：A1——樣品溶液；

A2——取1.0 mL體積分數(shù)為50%的乙醇溶液與3.0 mL的樣品液混合，在避光常溫條件下靜置30 min，得樣品對照組A2，于波長517 nm處測定吸光度；

A0——取1.0 mL的DPPH-乙醇溶液與3.0 mL的蒸餾水混合，在避光常溫條件下靜置30 min，于波長517 nm處測定其吸光度。

（3） 羥自由基清除能力測定。采用Fenton反應(yīng)體系模型，先取1 mL樣品液稀釋15倍，依次加入濃度為6 mmol/L水楊酸乙醇溶液2.0 mL，濃度為6 mmol/L硫酸亞鐵2.0 mL，1.0 mL稀釋的樣品液，再加入濃度為6 mmol/L過氧化氫溶液0.1 mL，在37℃恒溫條件下反應(yīng)30 min，于波長510 nm處測定吸光度。

按照下式計算羥自由基清除率：

式中：A1——樣品溶液；

A2——樣品對照組：用蒸餾水將加入H2O2步驟替換，其他不變；

A0——模型對照組：用蒸餾水作為樣品液，其他不變。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)平行測定3次，測定平均值，采用Origin 2017軟件作圖，應(yīng)用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，差異顯著性水平為p＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法對野木瓜膳食纖維提取率及色澤的影響

不同提取方法對野木瓜膳食纖維提取率及色澤的影響表1。

表1 不同提取方法對野木瓜膳食纖維提取率及色澤的影響

由表1可知，經(jīng)超聲輔助堿法提取野木瓜果皮渣IDF提取率最高，可達到59.87%，其次是雙酶法、超聲波輔助酶法、微波法分別為53.06%，52.78%，52.64%，3種方法提取率無顯著性差異（p＞0.05），酸堿法IDF提取率最低為46.15%；超聲輔助堿法的SDF的提取率最低為1.87%，超聲波輔助酶法的提取率最高可達到4.13%，雙酶法和酸堿法的SDF提取率為3.6%和3.37%。通過對所提取的IDF的色澤進行感覺評價，酸堿法和超聲波輔助堿法所提取的IDF和SDF顏色較深分別為黑紫色和黑褐色，而其余的3種方法提取的IDF黃色或淺黃色。酸、堿處理雖然都可以不同程度地提高樣品的得率，但處理后的樣品顏色變深，反復(fù)調(diào)整pH值必將引進大量的陰陽離子，給下一步的食品加工帶來不便，通過對比分析，由于酸堿法和超聲波-堿法所提取的IDF和SDF顏色較深，不利于后期的抗氧化活性成分的測定中顯色試驗的開展，也不利于后期食品加工的研究[15]。因此，酸堿法和超聲輔助堿法所提取的IDF和SDF不再進行抗氧化活性成分的測定。

2.2 不同提取方法對野木瓜膳食纖維還原能力的影響

還原能力的測定是以樣品是否為良好的電子供體為指標，還原能力大的樣品是良好的電子供體，其供應(yīng)的電子不僅能使Fe3+還原成Fe2+，同時能與自由基反應(yīng)，使自由基成為較為穩(wěn)定的物質(zhì)，從而中斷自由基連鎖反應(yīng)[16]。

不同提取方法對野木瓜膳食纖維還原能力的影響見圖1。

圖1 不同提取方法對野木瓜膳食纖維還原能力的影響

由圖1可知，微波法、雙酶法、超聲波輔助酶法3種方法中，雙酶法提取的SDF還原能力最高，吸光度達到了1.419，微波法和超聲酶法次之，分別為1.399和1.397，3種方法提取的SDF還原能力無顯著性差異（p＞0.05）；對于IDF，微波法和超聲酶法提取的IDF還原能力較高吸光度分別為1.41和1.40，雙酶法提取的IDF還原能力最低吸光度為1.389，3種方法提取的IDF還原能力差異不顯著性（p＞0.05）。

2.3 不同提取方法對野木瓜膳食纖維DPPH自由基清除率的影響

DPPH在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，被廣泛用于測定樣品對自由基的清除能力，DPPH自由基乙醇溶液為深紫色，于波長517 nm附近有強吸收峰，DPPH自由基接受受試物的電子而變成穩(wěn)定的抗磁分子，溶液顏色變淺呈黃色，吸光度變小[17]。

不同提取方法對野木瓜膳食纖維DPPH自由基清除率的影響見圖2。

由圖2可知，各種方法提取的野木瓜膳食纖維清除DPPH自由基的能力中微波法提取IDF清除能力最高，達到24.19%，超聲波輔助酶法提取IDF清除能力次之為17.74%，二者差異顯著（p＜0.05）。微波法和雙酶法提取SDF的DPPH自由基清除能力一樣，都達到12.9%，超聲波輔助酶法的最低清除能力為9.68%。

圖2 不同提取方法對野木瓜膳食纖維DPPH自由基清除率的影響

2.4 不同提取方法對野木瓜膳食纖維羥自由基清除率的影響

羥自由基是毒性最強的活性氧，可直接損壞生物膜，可與活細胞中的任何分子發(fā)生反應(yīng)而造成損傷，大量產(chǎn)生是中毒的重要特征，因此清除羥自由基是預(yù)防各種疾病的有效途徑[18]。

不同提取方法對野木瓜膳食纖維羥自由基清除率的影響見圖3。

圖3 不同提取方法對野木瓜膳食纖維羥自由基清除率的影響

由圖3可知，超聲酶法提取的IDF羥自由基清除率最高為14.96%，微波法提取的SDF羥自由基清除率最高為20.6%，不同提取方法得到的同種膳食纖維羥自由基清除率之間均存在顯著差異性（p＜0.05）。

3 結(jié)論

利用微波法、超聲波輔助堿法、雙酶法、酸堿法、超聲波輔助酶法5種方法提取野木瓜SDF和IDF，通過測定還原能力、羥自由基清除能力、DPPH自由基清除能力，研究了野木瓜SDF和IDF抗氧化特性和還原能力，確定了酸堿法和超聲輔助堿法所提取的野木瓜IDF和SDF不宜用于抗氧化活性成分的測定，可對這2種方法所提取的野木瓜IDF和SDF進行適當?shù)拿撋幚砗笤龠M行后續(xù)的抗氧化活性測定，但脫色處理在一定程度上可能會影響抗氧化性。微波法、雙酶法、超聲波輔助酶法3種方法所提取的野木瓜SDF和IDF表現(xiàn)出了不同的抗氧化能力，說明不同提取方法會對野木瓜中的IDF活性產(chǎn)生影響，綜合各因素考慮，微波法所提取的野木瓜IDF和SDF能夠較好保持其還原能力和抗氧化能力，相較其他方法，從提取時長、能耗、成本等方面都充分體現(xiàn)了其優(yōu)勢，在下一步的研究中擬重點優(yōu)化微波法的提取工藝，以期得到高提取量、高抗氧化性的野木瓜IDF和SDF，為利用地方特色資源生產(chǎn)抗衰老保健品和開發(fā)功能性食品基料添加物提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論支撐。