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        石斛西洋參景天姜膠囊安全性及緩解體力疲勞功能研究

        2019-12-27 05:53:08朱雪峰李世芬張成香
        農(nóng)產(chǎn)品加工 2019年24期
        關(guān)鍵詞:西洋參石斛乳酸

        朱雪峰 ,嚴(yán) 婷 ,李世芬 ,胡 奇 , 張成香

        (1.南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,江蘇南京 211166;2.江蘇省醫(yī)藥農(nóng)藥獸藥安全性評價(jià)與研究中心,江蘇南京 211166)

        鐵皮石斛屬蘭科石斛屬植物,新鮮或干燥莖,為藥食兩用[1],具有很好的抗衰老、抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力的功效,并且可用于腫瘤、糖尿病、慢性咽炎、胃炎、機(jī)體免疫下降等的輔助治療[2-4]。西洋參為五加科植物,根味苦、微甘、性寒,為珍貴藥材[5],現(xiàn)代研究表明,西洋參含有多種人參皂苷、維生素及微量元素等生理活性物質(zhì),具有增強(qiáng)抗疲勞能力、耐高溫能力、抗腫瘤作用、降血脂作用、抗氧化作用、免疫調(diào)節(jié)作用、改善老年高血壓患者的低舒張壓情況等功效[6-9]。紅景天為景天科紅景天屬草本或亞灌木植物[10],具有增強(qiáng)人體免疫力、抗衰老、抗輻射、保護(hù)心腦血管等功效[11-13]。干姜為姜科植物姜的干燥根莖,是常用的藥食同源中藥材,化學(xué)成分主要包括揮發(fā)油和姜辣素類成分,具有極好的藥用價(jià)值。目前為止,對鐵皮石斛、西洋參、紅景天和干姜的單一組分或2種組分聯(lián)合的研究報(bào)道較多[1-12],但未見對這4種藥材配伍混合物的研究報(bào)道,試驗(yàn)以這4味藥材提取物和輔料按照一定的工藝混合制成的膠囊為受試物進(jìn)行安全性毒理學(xué)和功能研究,以期為石斛西洋參景天姜膠囊口服的安全性和功能性提供數(shù)據(jù)支持。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 受試物

        石斛西洋參景天姜膠囊,該膠囊內(nèi)容物主要包括鐵皮石斛、西洋參、紅景天、干姜提取物及輔料。于陰涼避光處保存,供試驗(yàn)備用。人體推薦攝入量為2.4 g/人/日。

        1.1.2 試驗(yàn)動物及飼料

        急毒試驗(yàn)用動物為健康成年SPF級ICR小鼠20只,雌雄各半,南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動物中心提供;微核試驗(yàn)和小鼠精子畸形試驗(yàn)選用清潔級ICR健康小鼠,揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供;30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)用動物為SPF級健康離乳SD大鼠80只、功能試驗(yàn)用動物為SPF級CI/F1代健康雄性小鼠160只,雌雄各半,上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供,試驗(yàn)動物在屏障系統(tǒng)中飼養(yǎng);輻照鼠用滅菌飼料,江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司提供。

        1.1.3 儀器、菌株和試劑

        T-1000型電子天平、JJ-100型電子天平、離心機(jī)、OLYMPUS型顯微鏡、日立7100型全自動生化分析儀、SIEMENS ADVIA 2120i型血液分析儀、離心機(jī)、水浴鍋、多功能酶標(biāo)儀、BIOSEN C_Line GP+葡萄糖/乳酸分析儀、游泳箱(大小約50 cm×50 cm×40 cm)。鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102 來源于 Molecular Toxicology,Inc.;S-9來源于江蘇齊氏生物科技有限公司;血漿尿素試劑盒、肝糖原試劑盒,南京建成生物工程研究所提供。

        1.2 方法

        1.2.1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

        用最大耐受量法開展小鼠急性毒性試驗(yàn),設(shè)計(jì)劑量為 15 000 mg/kg·bw。

        1.2.2 Ames試驗(yàn)方法

        采用標(biāo)準(zhǔn)平板摻入法,選鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97,TA98,TA100,TA102,經(jīng)鑒定合格后開展試驗(yàn)。在加與不加S-9的情況下以5 000,1 000,200,40,8 μg/皿劑量進(jìn)行試驗(yàn),每個(gè)劑量3個(gè)平皿。同時(shí)設(shè)陽性、陰性對照組。以上試驗(yàn)過程重復(fù)1次。

        1.2.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

        25~30 g的ICR清潔級小鼠50只,雌雄各半,按體重隨機(jī)分為5個(gè)組,每組10只。設(shè)1 250,2 500,5 000 mg/kg·bw 3個(gè)劑量組、陰性對照組(無菌水,20 mL/kg·bw灌胃) 和陽性對照組(環(huán)磷酰胺,40 mg/kg·bw腹腔注射)。采用30 h給受試物法,2次給樣間隔24 h,第2次給樣6 h后處死動物,取小鼠胸骨骨髓常規(guī)制片、鏡檢,計(jì)數(shù)1 000個(gè)骨髓嗜多染紅細(xì)胞(PCE) /每支動物,計(jì)算微核發(fā)生率。計(jì)數(shù)200個(gè)嗜多染紅細(xì)胞時(shí)所觀察到的成熟紅細(xì)胞數(shù)(NCE) /每只動物,計(jì)算PCE/NCE。

        1.2.4 小鼠精子畸形試驗(yàn)

        ICR清潔級雄性小鼠25只,分為5組,每組5 只。設(shè) 1 250,2 500,5 000 mg/kg·bw 3 個(gè)劑量組、陰性對照組(無菌水,20 mL/kg·bw灌胃) 和陽性對照組(環(huán)磷酰胺,40 mg/kg·bw腹腔注射)。給樣每天1次,連續(xù)5 d。于第1次給樣后的第35天處死動物,取兩側(cè)附睪精子濾液制片、鏡檢。每只動物計(jì)數(shù)1 000個(gè)精子(結(jié)構(gòu)完整),計(jì)算精子畸形發(fā)生率。

        1.2.5 反復(fù)染毒試驗(yàn)方法

        SPF級健康離乳SD大鼠80只,雌雄各40只,分為4組,每組20只。按人體推薦劑量的30,65,100 倍設(shè) 3 個(gè)劑量組 (1.2,2.6,4.0 g/kg·bw/d),另設(shè)一個(gè)空白對照組0 g/kg·bw/d,連續(xù)給樣30 d。每周測1次動物體重和2次食物攝入量,計(jì)算食物利用率。30 d后,隔夜禁食,麻醉,取血測其血液學(xué)指標(biāo)和血液生化指標(biāo),摘取肝、腎、脾、睪丸和卵巢稱重,計(jì)算臟體比。選取對照組和高劑量組肝、脾、腎、胃、十二指腸、睪丸和卵巢制作病理切片進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

        1.2.6 緩解體力疲勞功能試驗(yàn)方法

        以0.20,0.40,1.20 g/kg·bw/d 3個(gè)劑量經(jīng)口給予小鼠1個(gè)月,測小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間、血漿尿素水平、肝糖原儲備量及血乳酸值。若負(fù)重游泳試驗(yàn)結(jié)果陽性,且血乳酸、血漿尿素、肝糖原3項(xiàng)生化指標(biāo)中任2項(xiàng)指標(biāo)陽性,即可判定該受試樣品具有緩解體力疲勞作用。

        (1) 負(fù)重游泳時(shí)間。最后一次給小鼠受試物30 min后,置于游泳箱中游泳,水深約35 cm,水溫25±1℃,鼠尾根部負(fù)荷5%體重的鉛絲。記錄小鼠自游泳開始至死亡的時(shí)間,作為小鼠負(fù)重游泳時(shí)間。末次給小鼠受試物30 min后,在溫度為30℃的水中不負(fù)重游泳90 min,休息60 min后立即眼眶采血。血液離心后,吸取20 μL血漿,用二乙酰一肟法測定血漿尿素值。

        (2) 血漿尿素水平。最后一次給動物受試物30 min后,處死取肝臟,稱取75 mg,加堿溶液0.225 mL,煮沸20 min,配成1%肝勻漿液,取1%肝勻漿液0.1 mL,加2 mL蒽酮試劑,煮沸5 min,冷卻后于波長620 nm處比色測定,計(jì)算肝糖原含量。

        (3) 肝糖原儲備量及血乳酸值。末次給動物受試物30 min后眼眶靜脈采血。不負(fù)重游泳(水溫30℃)10 min后停止,立即眼眶靜脈采血,休息20 min后再采血,測定動物血乳酸含量。葡萄糖/乳酸分析儀測定乳酸方法:取血10 μL并轉(zhuǎn)移到反應(yīng)試管中,蓋緊蓋子振蕩混勻,從分析儀上讀數(shù)。

        血乳酸曲線下面積用下式表示:

        血乳酸曲線下面積=1/2×(游泳前血乳酸值+游泳后0 min的血乳酸值)×10+1/2×(游泳后0 min的血乳酸值+游泳后休息20 min的血乳酸值)×20.

        1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        微核試驗(yàn)結(jié)果采用Poisson分布U檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)和小鼠功能試驗(yàn)對各試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),滿足方差齊要求的數(shù)據(jù)資料用單因素方差分析方法中多個(gè)試驗(yàn)組與一個(gè)對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理;對方差不齊的數(shù)據(jù)資料采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

        動物未觀察到異常,MTD大于15 000 mg/kg·bw,無毒級。

        2.2 Ames試驗(yàn)結(jié)果

        各劑量組的回變菌落數(shù)均未超過陰性對照組的2倍,受試物對鼠傷寒沙門氏菌 TA97,TA98,TA100,TA102這4株試驗(yàn)菌株,在加與不加S-9時(shí),均未見有致基因突變作用。

        2.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果

        小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果見表1。

        表1 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果

        由表1可見,各劑量組微核率與陰性對照組比較無顯著性差異 (p>0.05)。受試物各劑量組的PCE/NCE比值與對照組的差異均在對照組20%以內(nèi),受試物對骨髓細(xì)胞增殖沒有抑制作用。說明受試物對小鼠骨髓細(xì)胞(骨髓多染細(xì)胞)無誘發(fā)微核作用。

        2.4小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果

        小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果見表2。

        表2 小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果

        由表2可見,各劑量組精子畸形率與陰性對照組比較,無顯著性差異(p>0.05),受試物對小鼠精子畸形率未產(chǎn)生影響。

        2.5 30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

        各組大鼠未見明顯異常表現(xiàn)和行為,未觀察到中毒體征和死亡。雌、雄性大鼠各劑量組各觀察點(diǎn)的體重、食物利用率、血液學(xué)、血生化、臟器絕對質(zhì)量及相對質(zhì)量與0 g/kg·bw/d組比較,均無異常。

        大體解剖學(xué)檢查各劑量組的肝、腎、脾、胃、十二指腸、睪丸、卵巢等未見異常改變;鏡檢結(jié)果顯示,空白對照組和高劑量組除了各有1例輕度肝脂肪變性外,無其他異常改變。因大鼠自然群體中有一定概率的肝脂肪會發(fā)生變性,結(jié)合空白對照組和高劑量組均有1例,故試驗(yàn)中肝脂肪變性被判斷為非受試物引起。

        2.6 緩解體力疲勞功能試驗(yàn)

        0.40,1.20 g/kg·bw/d組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間長于0 g/kg·bw/d組;各組血漿尿素水平與0 g/kg·bw/d組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05);而各組的肝糖原儲備量高于0g/kg·bw/d組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);0.40,1.20 g/kg·bw/d 組小鼠游泳后血乳酸曲線下面積值低于0 g/kg·bw/d組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p<0.05)。

        表3 小鼠緩解體力疲勞功能試驗(yàn)結(jié)果(x±s)

        3 結(jié)論

        為探討石斛西洋參景天姜膠囊的食用安全性和緩解體力疲勞功能,研究從急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)、30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)、遺傳毒性試驗(yàn)和小鼠緩解體力疲勞功能試驗(yàn)4個(gè)角度開展。結(jié)果表明,石斛西洋參景天姜膠囊對小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)的MTD大于15 000 mg/kg·bw,屬無毒級。遺傳毒性試驗(yàn)中,Ames試驗(yàn)、小鼠微核試驗(yàn)和精子畸形試驗(yàn)均未檢測到致突變作用。30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)以1.2,2.6,4.0 g/kg·bw/d的劑量給予大鼠30 d,各項(xiàng)指標(biāo)均未檢測到毒性作用。小鼠功能試驗(yàn)結(jié)果表明,石斛西洋參景天姜膠囊具有緩解體力疲勞作用。即試驗(yàn)條件下,石斛西洋參景天姜膠囊安全性良好,具有緩解體力疲勞功能。

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