杜潤(rùn)峰，趙爽，劉昆侖，陳復(fù)生

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450001）

越來(lái)越多的研究表明，人類(lèi)的衰老、慢性病和退行性疾病，如癌癥、心臟病、帕金森病等，其發(fā)生、發(fā)展過(guò)程與活性氧（reactive oxygen species，ROS）有關(guān)[1]。典型的活性氧有超氧化物陰離子、過(guò)氧化氫、羥基自由基、過(guò)氧化氫自由基和次氯酸根離子；過(guò)氧亞硝酸鹽是典型的活性氮 （the reactive oxygen/nitrogen species，RNS）[2]。為了清除多余的自由基，保持人體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的平衡以及預(yù)防疾病，需要在飲食中攝入適當(dāng)?shù)目寡趸瘎??？寡趸模╝ntioxidative peptides）是目前國(guó)內(nèi)外研究較多的一種生物活性肽，具有抑制、延緩脂質(zhì)氧化，保護(hù)人體組織器官免受自由基侵害的作用。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究者從大米蛋白[3]、甘薯[4]、大麻種子[5]和玉米面筋蛋白[6]中分離純化制備得到抗氧化肽，并鑒定了其序列。

硒是人體必需的微量元素，以硒代半胱氨酸（Se－Cys）的形式存在于蛋白質(zhì)中作為硒酶的活性中心，發(fā)揮重要的抗氧化功能[7]。迄今為止，在人體基因組中至少已鑒定出25種硒蛋白，雖然多數(shù)硒蛋白的生物學(xué)功能尚未完全揭曉，但其中12種硒蛋白具有抗氧化作用[8]。因此，硒的抗氧化研究一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。

本研究以富硒糙米為原料，以抗氧化能力指數(shù)為指標(biāo)，通過(guò)酶解富硒糙米蛋白制備抗氧化肽，并采用響應(yīng)面法建立最佳制備工藝，為富硒糙米蛋白酶解物進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系研究提供依據(jù)；同時(shí)可發(fā)揮硒元素和肽兩者的功能特性，在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域有較好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

水稻（隆粳968）：安徽隆平高科種業(yè)有限公司；堿性蛋白酶（189.57 U/mg）、中性蛋白酶（107.39 U/mg）、胃蛋白酶（28.63 U/mg）和風(fēng)味酶（21.55 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司；熒光素二鈉鹽（fluorescein disodium salt，F(xiàn)L）：美國(guó) Sigma-Aldrich 試劑公司；2，2-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽 [2，2-azobis（2-methylpropionamide）-dihydrochloride，AAPH]：Adama 試劑有限公司；6-羥基-2，5，7，8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸（6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）：東京化成工業(yè)株式會(huì)社；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

恒溫恒濕培養(yǎng)箱（HWS-250）：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；礱谷機(jī)（6LN300-40X）：廣州市邦民機(jī)械設(shè)備廠；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（FW177）、電熱恒溫水浴鍋（XMTD-7000）：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)（GL-10000C）：上海安亭科學(xué)儀器廠；可見(jiàn)分光光度計(jì)（722S）：上海儀電分析儀器有限公司；六聯(lián)電動(dòng)攪拌器（JJ-6A）：常州普天儀器制造有限公司；冷凍干燥機(jī)（LGJ-25C）：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；數(shù)顯水浴恒溫振蕩器（SHZ-82）：常州博遠(yuǎn)實(shí)驗(yàn)分析儀器廠；pH計(jì)（PHS-3C）：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；熒光分析儀（Flx 800）：美國(guó)伯騰儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 富硒糙米的制備

富硒糙米參照Liu等[9]的方法制得，硒含量為6.26 μg/g。

1.2.2 糙米抗氧化肽制備工藝

富硒糙米→粉粹（過(guò)100目篩）→正己烷脫脂7 h[1 ∶3（g/mL）]→揮干→蒸餾水浸泡 12 h[1 ∶3（g/mL）]→攪拌為懸浮液→0.1 mol/L的NaOH溶液浸提2 h（懸浮液：NaOH溶液=1∶3，體積比）→離心30min（4000r/min）→上清液調(diào)pH值→離心20 min→沉淀、洗滌→冷凍干燥→富硒糙米蛋白

富硒糙米蛋白（控制一定的底物濃度）→調(diào)節(jié)pH值→攪拌（37℃，15 min）→酶解→滅酶（90℃，10 min）→離心15 min（8 000 r/min）→收集上清液（測(cè)定水解度及抗氧化能力指數(shù)）→冷凍干燥

1.2.3 水解度（degree of hydrolysis，DH）測(cè)定

DH測(cè)定采用茚三酮比色法[10，15]。

1.2.4 抗氧化能力指數(shù)（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）法

ORAC方法測(cè)定抗氧化劑的作用原理是一種經(jīng)典的通過(guò)抑制氫轉(zhuǎn)移反應(yīng)過(guò)程終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，與鐵還原抗氧化能力（ferric reducing ability of plasma，F(xiàn)RAP）、抗氧化能力（trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC） 及 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl，DPPH）等其他方法相比，ORAC法可以提供穩(wěn)定可控的自由基，與生命現(xiàn)象中的自由基具有高度的一致性[11]。ORAC測(cè)定方法參照Davalos等[12]的方法進(jìn)行改進(jìn)，簡(jiǎn)要過(guò)程如下：以FL為熒光素探針，Trolox為標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑，AAPH為自由基引發(fā)劑。所有試劑均采用75 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）進(jìn)行配制。在黑色96孔板中分別加入20 μL的磷酸鹽緩沖液（空白組），不同濃度的Trolox溶液（標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組）和待測(cè)樣品溶液（樣品組），然后加入120 μL FL溶液（最終濃度為70 nmol/L），在37℃下保溫15 min后，快速加入60μLAAPH溶液（最終濃度為12mmol/L）。采用酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為528 nm條件下測(cè)定其熒光強(qiáng)度，程序設(shè)置為每1分鐘讀數(shù)1次，共讀120 min，每次讀數(shù)前振蕩10 s。ORAC值以Trolox當(dāng)量（trolox equivalent，TE）表示，單位為 μmol TE/g。首先計(jì)算出熒光強(qiáng)度衰退曲線面積（the net area under the curve，AUC），計(jì)算公式如下：

式中：f0表示時(shí)間為0 min時(shí)的熒光強(qiáng)度，fi表示第i分鐘時(shí)的熒光強(qiáng)度。

ORAC值的計(jì)算公式如下：

式中：AUCSample、AUCBlank和 AUCTrolox分別表示待測(cè)樣品，空白組和標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑組的AUC值。

1.2.5 單因素試驗(yàn)

不同蛋白酶對(duì)富硒糙米蛋白的酶解條件如表1所示，測(cè)定酶解產(chǎn)物的DH和ORAC值，篩選出最佳蛋白酶。在此基礎(chǔ)上考查底物濃度、pH值、溫度和加酶量對(duì)DH及抗氧化活性的影響。

表1 不同蛋白酶的水解條件Table 1 Hydrolysis condition of different proteases

1.2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)了三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，確定富硒糙米蛋白酶解的最佳工藝條件。以酶解物的ORAC（Y）為考察指標(biāo)，酶解時(shí)間（X1）、溫度（X2）和加酶量（X3）為自變量，因素水平編碼表見(jiàn)表2。

表2 因素水平編碼表Table 2 Code and level of facters chosen

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果采用SPSS（V.21）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，均值比較采用Duncan’s方法；響應(yīng)面設(shè)計(jì)采用Design Expert（V.8.0.6）軟件進(jìn)行；顯著性檢驗(yàn)水平：*為顯著，P＜0.05，** 為極顯著，P＜0.01。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 蛋白酶種類(lèi)對(duì)富硒糙米抗氧化肽活性的影響

蛋白酶種類(lèi)對(duì)富硒糙米蛋白水解度及產(chǎn)物抗氧化活性的影響見(jiàn)圖1。

圖1 蛋白酶種類(lèi)對(duì)富硒糙米蛋白水解度及產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.1 Effect of enzyme species on DH and antioxidant activity of hydrolysates of Se-BR protein

蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化特性主要取決于蛋白酶的特異性、DH和釋放肽的性質(zhì)，如分子量和氨基酸組成[13]。水解度均隨時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)先升高后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。風(fēng)味酶的水解能力強(qiáng)于堿性蛋白酶和中性蛋白酶，胃蛋白酶水解能力較弱（圖1A）。

具有特定功能的活性肽往往是分子量較小的短肽，但水解度過(guò)高，必然會(huì)產(chǎn)生較多的游離氨基酸，因此，應(yīng)以糙米蛋白酶解物的抗氧化指數(shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)[14]。由圖1B可知，中性蛋白酶水解產(chǎn)物的抗氧化活性略高于堿性蛋白酶，而胃蛋白酶和風(fēng)味酶水解產(chǎn)物的抗氧化活性較低。這可能是由于胃蛋白酶主要水解含有相鄰于芳香族氨基酸或二羧基氨基酸肽鍵的多肽。中性蛋白酶水解產(chǎn)物的抗氧化活性在水解前期隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但水解時(shí)間達(dá)到120分鐘后，水解產(chǎn)物的抗氧化活性無(wú)顯著變化。因此，選用中性蛋白酶為最佳酶源制備富硒糙米抗氧化肽，且控制酶解時(shí)間為120 min。

2.1.2 pH值對(duì)富硒糙米抗氧化肽活性的影響

pH值對(duì)富硒糙米抗氧化肽活性的影響見(jiàn)圖2。

由圖2可知，中性蛋白酶的水解效率以及水解產(chǎn)物的抗氧化活性隨pH值增加呈逐漸上升趨勢(shì)，且酸性條件下均較低；當(dāng)pH值大于8.0后，DH和抗氧化活性無(wú)顯著變化，因此確定pH為8.0為中性蛋白酶的較優(yōu)條件。這可能是由于pH值影響維持酶分子空間結(jié)構(gòu)有關(guān)基團(tuán)的解離，從而影響了酶活性部位的構(gòu)象，進(jìn)而影響蛋白酶的活性。

圖2 pH值對(duì)富硒糙米蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.2 Effect of pH on DH and antioxidant activity of hydrolysates of Se-BR protein

2.1.3 底物濃度對(duì)富硒糙米抗氧化肽活性的影響

底物濃度對(duì)富硒糙米蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響見(jiàn)圖3。

圖3 底物濃度對(duì)富硒糙米蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on DH and antioxidant activity of hydrolysates of Se-BR protein

由圖3可知，富硒糙米蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化活性及水解度隨底物濃度的增加均呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì)。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?%時(shí)，富硒糙米蛋白酶解產(chǎn)物的ORAC值和水解度均達(dá)到最大值，分別為（1 111.34±10.36）μmol TE/g和（11.21±0.18）%。當(dāng)?shù)鞍诐舛容^低時(shí)，底物能與蛋白酶充分接觸，增加底物濃度能夠促進(jìn)多肽的生成，當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到飽和點(diǎn)后，繼續(xù)增加底物濃度會(huì)抑制蛋白酶的水解效率[15]。

2.1.4 加酶量對(duì)富硒糙米抗氧化肽活性的影響

加酶量對(duì)富硒糙米抗氧化肽活性的影響見(jiàn)圖4。

圖4 加酶量對(duì)富硒糙米蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on DH and antioxidant activity of hydrolysates of Se-BR protein

當(dāng)加酶量較低時(shí)，富硒糙米蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化活性和水解度隨加酶量的增加呈顯著增加的趨勢(shì)。當(dāng)加酶量大于8 000 U/g時(shí)，雖然水解度仍顯著增加，但是抗氧化活性趨于穩(wěn)定。且當(dāng)加酶量大于16 000 U/g時(shí)，抗氧化活性略有下降。張輝等[16]在超聲輔助酶解制備麥麩抗氧化肽時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著木瓜蛋白酶的增加，自由基清除能力呈先升高后降低趨勢(shì)。這可能是由于蛋白酶添加過(guò)量時(shí)，會(huì)使蛋白質(zhì)過(guò)度水解，得到分子量更小的肽段或游離氨基酸，導(dǎo)致具有抗氧化活性的多肽含量降低。

2.1.5 溫度對(duì)富硒糙米抗氧化肽活性的影響

溫度對(duì)富硒糙米抗氧化肽活性的影響見(jiàn)圖5。

圖5 溫度對(duì)富硒糙米蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on DH and antioxidant activity of hydrolysates of Se-BR protein

由圖5可知，酶解產(chǎn)物的抗氧化活性和水解度隨溫度的增加先升高后趨于平緩。這是由于溫度對(duì)酶解反應(yīng)速度的影響是雙重的，在一定的溫度范圍內(nèi)，蛋白酶的活性隨溫度的升高而增加，因此水解度會(huì)呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢(shì)。但是當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，蛋白酶會(huì)變性失活，酶解能力降低。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇中性蛋白酶水解富硒糙米蛋白。固定底物濃度為3%、pH值為8.0，選擇酶解時(shí)間、酶解溫度和加酶量為考察因素，根據(jù)Box-Behnken原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。采用Design-Expert（V.8.0.6）軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到回歸方程為：

表3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Respond surface experimental design and results

表4 回歸方程各項(xiàng)方差分析Table 4 ANOVA analysis of regression equation

由表 4可知，回歸模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.509 7），并且該模型R2=93.68%，說(shuō)明該模型的擬合度好，自變量和響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可以用于該反應(yīng)的理論推測(cè)。此外，F(xiàn)檢驗(yàn)可反映各因子的貢獻(xiàn)率，F(xiàn)值越大，表明對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響越顯著，由此可知，各因素對(duì)多肽抗氧化活性的影響順序?yàn)椋杭用噶浚緶囟龋緯r(shí)間。

三維響應(yīng)面圖可更直觀的顯示因素間交互作用對(duì)因變量的影響，并可預(yù)測(cè)各因素的最優(yōu)水平；而二維等高線圖即三維響應(yīng)面圖在底面的投影圖，其形狀表明變量間交互作用的強(qiáng)弱，橢圓等高線表明變量間的有較強(qiáng)的交互作用，而圓形等高線表明交互作用較弱[17]。圖6是酶解溫度為零水平（45℃）時(shí)，酶解時(shí)間（X1）和加酶量（X3）的響應(yīng)面圖和等高線圖。隨著加酶量的增加，ORAC值顯著增加。而酶解時(shí)間（X1）和溫度（X2）的交互作用及溫度（X2）和加酶量（X3）的交互作用對(duì)酶解產(chǎn)物的抗氧化活性無(wú)顯著性影響。

圖6 因素交互作用對(duì)富硒糙米蛋白水解產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.6 Effect of factors interaction on antioxidant activity of hydrolysates of Se-BR protein

由Design-Expert分析得最佳酶解條件為：酶解時(shí)間69 min、酶解溫度55℃、加酶量12 000 U/g。根據(jù)實(shí)際操作條件，將最佳試驗(yàn)條件設(shè)定為底物濃度3%、pH 8.0、酶解時(shí)間69 min、酶解溫度55℃、加酶量12 000 U/g。在此條件下，富硒糙米蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化能力為（1 232.57± 62.34）μmol TE/g，與預(yù)測(cè)值1 219.76 μmol TE/g相近，說(shuō)明通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化得到最佳酶解條件可靠。

2.3 富硒糙米抗氧化肽與非富硒糙米抗氧化肽的活性比較

在最佳酶解條件下對(duì)同源非富硒糙米蛋白進(jìn)行酶解，通過(guò)ORAC值測(cè)定其抗氧化活性，并以谷胱甘肽作為對(duì)照，結(jié)果如圖7所示。富硒糙米酶解物的ORAC值為（1 232.57±62.34）μmol TE/g，約為谷胱甘肽抗氧化活性的68.87%，具有較強(qiáng)的抗氧化活性；而非富硒糙米酶解物的 ORAC 值為（975.26±78.99）μmol TE/g，約為谷胱甘肽抗氧化活性的54.49%，顯著低于富硒糙米蛋白酶解物。說(shuō)明硒對(duì)肽的抗氧化能力具有協(xié)同促進(jìn)作用，但其協(xié)同作用機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。

圖7 富硒糙米酶解物與非富硒糙米酶解物的抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activity of Se-BR hydrolysate and non-Se-BR hydrolysate

3 結(jié)論

通過(guò)比較不同蛋白酶對(duì)富硒糙米蛋白質(zhì)酶解物的水解度和抗氧化能力指數(shù)，發(fā)現(xiàn)中性蛋白酶水解產(chǎn)物的抗氧化活性最強(qiáng)，其次是堿性蛋白酶。在單因素的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化富硒糙米蛋白質(zhì)的水解工藝。結(jié)果表明：富硒糙米抗氧化肽制備工藝的影響主次順序?yàn)椋杭用噶浚緶囟龋緯r(shí)間，其最優(yōu)條件為底物濃度3%，pH 8.0，酶解時(shí)間69 min，酶解溫度55℃，加酶量12 000 U/g。在此條件下ORAC值為（1 232.57±62.34）μmol TE/g，與預(yù)測(cè)值 1 219.76 μmol TE/g 相近。富硒糙米蛋白酶解物具有顯著的抗氧化活性，可以作為天然抗氧化劑來(lái)抵御氧化應(yīng)激，也可作為補(bǔ)硒的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，用于食品、醫(yī)療等領(lǐng)域。