吳迪，邴雪，王昌濤，2，*，李萌，趙丹，張佳嬋

（1.北京工商大學(xué)理學(xué)院，植物資源研究開發(fā)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100048；2.北京工商大學(xué)北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京100048）

燕麥起源于我國，目前，燕麥?zhǔn)侨蚝坦阮愞r(nóng)作物的八大糧食之一，主要種植于北半球的溫帶地區(qū)[1]。燕麥中含有豐富的蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、維生素、礦物質(zhì)、β-葡聚糖，有益于身體健康[2]。燕麥β-葡聚糖的分子結(jié)構(gòu)已經(jīng)被廣泛研究[3-7]，其是β-D-吡喃葡萄糖通過 30%的 β-（1→3）糖苷鍵和 70%的 β-（1→4）糖苷鍵連接而成的一種高分子、無分支、線性和黏性多糖。研究表明，燕麥β-葡聚糖具有較強(qiáng)的吸附小分子物質(zhì)的能力，與蛋白質(zhì)進(jìn)行競爭，可與多酚通過氫鍵、疏水相互作用等結(jié)合，形成多糖多酚復(fù)合物，為機(jī)體提供更為持久的抗氧化能力[8]。在食品方面，燕麥β-葡聚糖不僅具有顯著的降血脂作用和減肥功效，還可以作為益生元調(diào)節(jié)機(jī)體腸道菌群結(jié)構(gòu)[9]。

所謂“雙向發(fā)酵”是指采用具有一定活性成分的中藥材或藥渣作為藥性基質(zhì)來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的營養(yǎng)基質(zhì)，并把經(jīng)過優(yōu)選的菌種加入其中進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，它們構(gòu)成的發(fā)酵組合稱作藥用菌質(zhì)[10]。試驗(yàn)表明，雙向發(fā)酵具有增效擴(kuò)用及解毒持效的作用[11]。

藥食用真菌是指對(duì)疾病有治療、預(yù)防及抑制作用或具有保健功效的一類真菌，在我國傳統(tǒng)醫(yī)藥中占有重要的位置[12]。藥食用真菌的抗氧化活性研究一直是人們探究機(jī)體氧化抗氧化平衡的研究熱點(diǎn)，不少研究都表明其含有比較好的抗氧化功能[13]。近年來，藥食用真菌及其活性成分因其獨(dú)特的生物活性及安全無毒副作用而被廣泛應(yīng)用。很多醫(yī)藥公司、企業(yè)、科研院所等一直致力于藥食用菌的研究工作，研制出了一系列藥品和保健品等，并已投入生產(chǎn)[14]。

故本試驗(yàn)選用藥食用真菌與燕麥麩皮進(jìn)行雙向發(fā)酵，獲得更高產(chǎn)量的燕麥β-葡聚糖的同時(shí)利用燕麥麩皮，并對(duì)燕麥β-葡聚糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的研究，為其在食品中的應(yīng)用提供可行性參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

燕麥麩皮：張家口面粉廠；靈芝、桑黃、猴頭、紅曲霉、裂褶菌、大球蓋菇、雞樅菌、海鮮菇、黃傘、大杯傘、白玉木耳、灰樹花：中國普通微生物保藏管理中心；α-淀粉酶：上海麥克林生化科技有限公司；馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基、β-葡萄糖：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；剛果紅：上海源葉生物有限公司；NaNO3、Na2CO3、酒石酸鉀鈉、硫酸銅（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；福林酚、苯酚、濃硫酸、氯仿、正丁醇、乙醇（均為分析純）：北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T6紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；（e2695）高效凝膠色譜、2414示差檢測器：美國沃特世公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種篩選

1.3.1.1 菌種的活化

活化培養(yǎng)基均為馬鈴薯葡萄糖水液體培養(yǎng)基，70 mL培養(yǎng)基裝于250 mL容量瓶中，28℃，180 r/min。斜面中挑取菌落接種于液體培養(yǎng)基中，置于搖床，在適宜的條件下進(jìn)行菌種的活化。

1.3.1.2 菌種的純化

活化的菌種按梯度稀釋進(jìn)行鋪板，以便獲取單一菌落。

1.3.1.3 菌種的擴(kuò)培

將純化后的菌種接種到馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基，在適宜溫度的搖床中培養(yǎng)，當(dāng)OD值=0.6時(shí)，即菌種處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，此時(shí)為合適的接種濃度。

1.3.1.4 菌種的接種和發(fā)酵

燕麥麩皮與水按照1∶25（g/mL）的比例配制，作為待擴(kuò)培培養(yǎng)基，吸取已擴(kuò)培的菌液2 mL接種到200 mL培養(yǎng)基中，pH=5，28℃，180 r/min在搖床中發(fā)酵。

1.3.1.5 檢測β-葡聚糖

每隔24小時(shí)，取發(fā)酵液，高溫高壓滅菌失活后12 000/min離心20 min，取上清液，用剛果紅法進(jìn)行β-葡聚糖含量的測定。

1.3.2 工藝優(yōu)化

對(duì)篩選出的黃傘、大杯傘、灰樹花3種真菌分別與燕麥麩皮進(jìn)行雙向發(fā)酵，隨后進(jìn)行工藝優(yōu)化的探究，進(jìn)行單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)。以β-葡聚糖含量作為指標(biāo)，以發(fā)酵時(shí)間、pH值、發(fā)酵溫度和燕麥麩皮與水混合的料液比作為影響因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)。

1.3.3 燕麥β-葡聚糖的純化

將未經(jīng)發(fā)酵的燕麥麩皮與水的混合液、黃傘與燕麥麩皮雙向發(fā)酵的發(fā)酵液、灰樹花與燕麥麩皮雙向發(fā)酵的發(fā)酵液、大杯傘與燕麥麩皮雙向發(fā)酵的發(fā)酵液通過去蛋白、去淀粉和醇沉，得到較純的燕麥β-葡聚糖。

純化的步驟：

1）將未經(jīng)發(fā)酵的燕麥麩皮水提液及加入3種真菌的發(fā)酵液，在12 000 r/min的條件下進(jìn)行離心，10分鐘后，取上清液。

2）在取出的上清液中加入適量的耐高溫α-淀粉酶，12 000 r/min條件下進(jìn)行離心，10分鐘后，取上清液進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

3）在上清液中加入乙醇，含量達(dá)60%，放入4℃冰箱靜置保存過夜，取出后離心，取沉淀。

4）重復(fù)步驟（3），將沉淀收集起來進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

5）在得到的沉淀中加入適量的去離子水進(jìn)行復(fù)溶，冷凍干燥后即可得到較純的燕麥β-葡聚糖。

1.3.4 高效凝膠色譜法測定β-葡聚糖分子量

高效凝膠色譜法：流動(dòng)相：0.15 mol/L NaNO3；凝膠柱：水溶性SB-803HQ、水溶性線性SB-806HQ；保護(hù)柱：SB-G；檢測器：激光多角度檢測器Wyatt DAWN HELEOS-II、示差檢測器Wyatt Optilab VEX；泵：LC-20AD；恒溫箱：CTO-20A。

用流動(dòng)相配制濃度1 mg/mL β-葡聚糖溶液，在室溫下溶解30 min后進(jìn)樣，通過軟件ASTRA5.3.4.13得到樣品分子量。

1.3.5 β-葡聚糖及發(fā)酵液蛋白含量測定

將4種純化的β-葡聚糖用去離子水配制成1 g/L的溶液，并與純化之前的4種溶液一同進(jìn)行蛋白含量測定，采用福林酚法。

稱取 10 g Na2CO3、2 g NaOH、0.25 g酒石酸鉀鈉溶于500 mL去離子水中為A，0.5 g硫酸銅溶于100 mL去離子水為B，A與B按50∶1的體積比配制為試劑甲。取福林酚（sigma company）與去離子水1∶1的體積比配制成試劑乙。不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行測試?yán)L制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在1 mL樣品溶液中加入5 mL試劑甲迅速混合放入25℃水浴10 min。逐管加入0.5 mL試劑乙，立即混合，25℃水浴反應(yīng)30分鐘后在700 nm處測吸光度。

1.3.6 β-葡聚糖及發(fā)酵液總糖含量測定

將4種純化的β-葡聚糖用去離子水配制成1 g/L的溶液，并與純化之前的4種溶液一同進(jìn)行總糖含量測定，采用苯酚硫酸法。

準(zhǔn)確稱取無水葡萄糖100 mg，置于100 mL容量瓶中，用去離子水進(jìn)行定容，得到濃度1 g/L葡萄糖溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。取10 g苯酚，加去離子水190 mL得到濃度為5%苯酚溶液，職于棕色瓶中避光。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精確稱取濃度為1 g/L葡萄糖溶液1、2、3、4、5 mL，加入 50 mL 容量瓶進(jìn)行定容，準(zhǔn)確吸取2 mL該系列溶液，以去離子水做空白對(duì)照，分別置于試管中，進(jìn)行比色反應(yīng)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測定：取樣品溶液2 mL放入試管中，以2 mL去離子水做為空白對(duì)照，加1 mL濃度為5%的苯酚溶液進(jìn)行混勻；加入5 mL的濃硫酸，混勻，5 min后，封管在沸水浴中反應(yīng)1 h；取出后冷卻至室溫，在490 nm波長處測吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選

剛果紅法測β-葡聚糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.003 8x+0.006 5，R2=0.998 48。12種真菌進(jìn)行雙向發(fā)酵的燕麥麩皮水溶液的β-葡聚糖含量隨時(shí)間的變化見圖1。

圖1 12種真菌雙向發(fā)酵后β-葡聚糖含量Fig.1 Content of β-glucan after bidirectional fermentation of 12 fungi

其中黃傘、大杯傘、灰樹花3種真菌在生長過程中β-葡聚糖就釋放出來，黃傘、大杯傘在48 h達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，β-葡聚糖的含量分別穩(wěn)定在 287、220 μg/mL 左右，β-葡聚糖總含量為未進(jìn)行雙向發(fā)酵的燕麥麩皮水溶液中的含量的近三倍和兩倍?；覙浠偤吭?2 h達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，β-葡聚糖的含量穩(wěn)定在184 μg/mL左右，β-葡聚糖總含量為未進(jìn)行雙向發(fā)酵的燕麥麩皮水溶液中的β-葡聚糖含量的近三倍。大球蓋菇經(jīng)發(fā)酵后β-葡聚糖總含量比未發(fā)酵的燕麥麩皮水溶液中的β-葡聚糖含量高，但其數(shù)據(jù)不穩(wěn)定。其余8種真菌在雙向發(fā)酵過程中β-葡聚糖被利用分解，最終含量比未發(fā)酵燕麥麩皮水溶液中的β-葡聚糖含量低。故篩選出黃傘、大杯傘、灰樹花3種真菌進(jìn)行雙向發(fā)酵以達(dá)到增加β-葡聚糖含量的目的，作為后續(xù)β-葡聚糖純化以及功效評(píng)價(jià)試驗(yàn)的試驗(yàn)對(duì)象。

2.2 工藝優(yōu)化

2.2.1 黃傘燕麥雙向發(fā)酵提取β-葡聚糖工藝優(yōu)化

2.2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 不同發(fā)酵條件對(duì)黃傘與燕麥麩皮水溶液發(fā)酵中β-葡聚糖含量的影響Table 1 Effects of different fermentation conditions on the content of β-glucan in Pholiota adiposa-oat bran aqueous solution

保持 pH=5、發(fā)酵溫度為 28℃、料液比為1∶25（g/mL），時(shí)間選取24、48、72 h，由試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳發(fā)酵時(shí)間為48 h。

保持發(fā)酵時(shí)間為48 h，發(fā)酵溫度為28℃，料液比為 1 ∶25（g/mL），選取 pH 值為 4、5、6，由試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳發(fā)酵pH值為5。

保持發(fā)酵時(shí)間為 48h，pH=5，料液比為 1∶25（g/mL），發(fā)酵溫度選取25、28、37℃，由試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳發(fā)酵溫度為28℃。

保持發(fā)酵時(shí)間為48 h，發(fā)酵溫度為28℃，pH值為5，料液比選取為 1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL），雖然結(jié)果為料液比為1∶15（g/mL）時(shí)β-葡聚糖含量最高，但考慮原料的利用率選為最佳發(fā)酵料液比為1∶20（g/mL）。

2.2.1.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

單因素試驗(yàn)表明，料液比選取 1∶20（g/mL）、時(shí)間48 h、pH=5、溫度28℃為黃傘與燕麥麩皮的最佳發(fā)酵條件。設(shè)計(jì)如下正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水平表見表2，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表-黃傘、燕麥麩皮發(fā)酵Table 2 Table of orthogonal test factor-fermentation of Pholiota adiposa and oat bran

由表3可知，4個(gè)因素對(duì)β-葡聚糖得率均有影響，影響大小為D＞B＞C＞A，即發(fā)酵時(shí)間、料液比（g/mL）、pH值和發(fā)酵溫度；確定最佳提取工藝組合為A2B1C2D2，即發(fā)酵溫度 28 ℃、料液比 1 ∶20（g/mL）、pH=5、發(fā)酵時(shí)間48 h。用正交最佳組合進(jìn)行驗(yàn)證，得到β-葡聚糖得率在289 μg/mL左右，與正交試驗(yàn)結(jié)果相似，故選取此組合為最佳組合。

表3 正交試驗(yàn)方案與結(jié)果-黃傘、燕麥麩皮發(fā)酵Table 3 Protocol and results of orthogonal test-fermentaion of Pholiota adiposa and oat bran

2.2.2 大杯傘燕麥雙向發(fā)酵提取β-葡聚糖工藝優(yōu)化

2.2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

不同發(fā)酵條件對(duì)大杯傘與燕麥麩皮水溶液發(fā)酵中β-葡聚糖含量的影響試驗(yàn)結(jié)果見表4。

保持 pH=5、發(fā)酵溫度為 28℃、料液比為 1∶25（g/mL），時(shí)間選取24、48、72 h，由試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳發(fā)酵時(shí)間為48 h。

表4 不同發(fā)酵條件對(duì)大杯傘與燕麥麩皮水溶液發(fā)酵中β-葡聚糖含量的影響Table 4 Effects of different fermentation conditions on the content of β-glucan in Clitocybe maxima-oat bran aqueous solution

保持發(fā)酵時(shí)間為48 h，發(fā)酵溫度為28℃，料液比為 1 ∶25（g/mL），選取 pH 值為 4、5、6，由試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳發(fā)酵pH值為5。

保持發(fā)酵時(shí)間為 48h，pH=5，料液比為 1∶25（g/mL），發(fā)酵溫度選取25、28、37℃，由試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳發(fā)酵溫度為28℃。

保持發(fā)酵時(shí)間為48 h，發(fā)酵溫度為28℃，pH值為5，料液比選取為 1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL），雖然結(jié)果為料液比為1∶15（g/mL）時(shí)β-葡聚糖含量最高，但考慮原料的利用率選為最佳發(fā)酵料液比為1∶25（g/mL）。

2.2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

單因素試驗(yàn)表明，料液比選取 1∶25（g/mL）、時(shí)間48 h、pH=5、溫度28℃為大杯傘與燕麥麩皮的最佳發(fā)酵條件。后設(shè)計(jì)如下正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水平表見表5，結(jié)果見表6。

表5 正交試驗(yàn)因素水平表-大杯傘、燕麥麩皮發(fā)酵Table 5 Table of orthogonal test factor-fermentaion of Clitocybe maxima and oat bran

由表6可知，4個(gè)因素對(duì)β-葡聚糖得率均有影響，影響大小為B＞C＞A＞D，即分別為料液比、pH值、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間；確定最佳提取工藝組合為A2B2C2D2，即發(fā)酵溫度 28 ℃、料液比 1 ∶25（g/mL）、pH=5、發(fā)酵時(shí)間48 h。用正交最佳組合進(jìn)行試驗(yàn)，得到β-葡聚糖得率在237 μg/mL左右，低于正交試驗(yàn)組合A1B2C2D2，故選正交試驗(yàn)組合A1B2C2D2為最佳組合。

表6 正交試驗(yàn)方案與結(jié)果-大杯傘、燕麥麩皮發(fā)酵Table 6 Protocol and results of orthogonal test-fermentaion of Clitocybe maxima and oat bran

2.2.3 灰樹花燕麥雙向發(fā)酵提取β-葡聚糖工藝優(yōu)化

2.2.3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

不同發(fā)酵條件對(duì)灰樹花與燕麥麩皮發(fā)酵液β-葡聚糖含量的影響試驗(yàn)結(jié)果見表7。

表7 不同發(fā)酵條件對(duì)灰樹花與燕麥麩皮發(fā)酵液β-葡聚糖含量的影響Table 7 Effects of different fermentation conditions on the content of β-Glucan in Ramalina-oat bran aqueous solution

保持 pH=5、發(fā)酵溫度為 28℃、料液比為 1∶25（g/mL），時(shí)間選取24、48、72 h，試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳發(fā)酵時(shí)間為72 h。

保持發(fā)酵時(shí)間為48 h，發(fā)酵溫度為28℃，料液比為 1 ∶25（g/mL），選取 pH 值為 4、5、6，試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳發(fā)酵pH值為5。

保持發(fā)酵時(shí)間為 48h，pH=5，料液比為 1∶25（g/mL），發(fā)酵溫度選取25、28、37℃，試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳發(fā)酵溫度為25℃。

保持發(fā)酵時(shí)間為48 h，發(fā)酵溫度為28℃，pH值為5，料液比選取為 1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL），雖然料液比為1∶15（g/mL）時(shí)β-葡聚糖含量最高，但考慮原料的利用率選為最佳發(fā)酵料液比為1∶20（g/mL）。

2.2.3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

通過單因素試驗(yàn)表明料液比選取1：20（g/mL）、時(shí)間48 h、pH=5、溫度28℃為灰樹花與燕麥麩皮的最佳發(fā)酵條件。后設(shè)計(jì)如下正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水平表見表8，結(jié)果見表9。

表8 正交試驗(yàn)因素水平表-灰樹花、燕麥麩皮發(fā)酵Table 8 Table of orthogonal test factor-fermentaion of Ramalina and oat bran

表9 正交試驗(yàn)方案與結(jié)果-灰樹花、燕麥麩皮發(fā)酵Table 9 Protocol and results of orthogonal test-fermentaion of Ramalina and oat bran

由表9可知，4個(gè)因素對(duì)β-葡聚糖得率均有影響，影響大小為C＞B＞D＞A，即分別為pH值、料液比、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度；確定最佳提取工藝組合為A2B1C2D2，即提取溫度 25℃、料液比 1 ∶20（g/mL）、pH=5、提取時(shí)間72 h。用正交最佳組合進(jìn)行試驗(yàn)，得到β-葡聚糖得率在192.58 μg/mL左右，與正交試驗(yàn)結(jié)果類似，故選擇此組合為最佳組合。

2.3 燕麥β-葡聚糖的純化

2.3.1 淀粉的去除

提取過程中，由于溫度的升高，淀粉在提取液中糊化，與β-葡聚糖一起被提取出來，故要去除淀粉。本試驗(yàn)用α-淀粉酶在80℃下反應(yīng)，以達(dá)到除去淀粉的目的，試驗(yàn)結(jié)果見表10。

表10 α-淀粉酶水解4種燕麥麩皮發(fā)酵液的效果Table 10 Effect of α-amylase hydrolyzed starch of four oat bran fermentation broth

考慮到資源和淀粉清除率，在去除純燕麥麩皮提取液時(shí)α-淀粉酶加量為1%，反應(yīng)時(shí)間30 min。黃傘燕麥麩皮發(fā)酵液α-淀粉酶加酶量為0.8%，反應(yīng)時(shí)間30 min。大杯傘燕麥麩皮發(fā)酵液α-淀粉酶加酶量為1%，反應(yīng)時(shí)間30 min?；覙浠ㄑ帑滬熎ぐl(fā)酵液α-淀粉酶加酶量為1%，反應(yīng)時(shí)間30 min。

2.3.2 蛋白的去除

sevage法去蛋白，硫酸銅法測蛋白含量。3個(gè)條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別為sevage試劑中氯仿與正丁醇體積比 6 ∶1、5 ∶1、4 ∶1、3 ∶1、2 ∶1，sevage試劑的添加量為總體積的 1/6、1/5、1/4、1/3、1/2 及沖洗次數(shù) 1、2、3、4。以去蛋白前后的吸光度差值作為參考。

1）sevage試劑中氯仿與正丁醇的比例的影響

控制sevage試劑的添加量為1/2，沖洗次數(shù)為2，sevage試劑中氯仿與正丁醇的比例的影響見圖2。

圖2 氯仿與正丁醇比例對(duì)不同發(fā)酵液蛋白清除率的影響Fig.2 Effect of the ratio of trichloromethane to n-butanol on the protein clearance rate of different fermentation broth

如圖所示，sevage試劑中氯仿與正丁醇體積比為4∶1時(shí)，蛋白質(zhì)的清除率達(dá)到穩(wěn)定，未經(jīng)發(fā)酵的燕麥麩皮水提液蛋白質(zhì)清除率在16.5%左右，黃傘燕麥發(fā)酵液的蛋白質(zhì)清除率在18.75%左右，大杯傘燕麥發(fā)酵液蛋白質(zhì)清除率在21%左右，灰樹花燕麥發(fā)酵液的蛋白質(zhì)清除率在19.3%左右。

2）sevage試劑的添加量的影響

控制sevage試劑中氯仿與正丁醇體積比為4∶1，沖洗次數(shù)為2，sevage試劑的添加量的影響見圖3。

圖3 sevage試劑添加比例對(duì)不同發(fā)酵液蛋白清除率的影響Fig.3 Effect of the addition ratio of sevag reagent on the protein clearance rate of different fermentation broth

如圖所示，sevage試劑的添加量為總體積的1/2時(shí)，蛋白質(zhì)的清除率達(dá)到穩(wěn)定，未經(jīng)發(fā)酵的燕麥麩皮水提液蛋白質(zhì)清除率在16.65%左右，黃傘燕麥發(fā)酵液的蛋白質(zhì)清除率在18.8%左右，大杯傘燕麥發(fā)酵液蛋白質(zhì)清除率在21%左右，灰樹花燕麥發(fā)酵液的蛋白質(zhì)清除率在18.8%左右。

3）沖洗次數(shù)的影響

控制sevage試劑中氯仿與正丁醇體積比為4∶1，sevage試劑的添加量為1/2，沖洗次數(shù)的影響如圖4。

如圖所示，沖洗次數(shù)為2次時(shí)，蛋白質(zhì)的清除率達(dá)到穩(wěn)定，未經(jīng)發(fā)酵的燕麥麩皮水提液蛋白質(zhì)清除率在16.65%左右，黃傘燕麥發(fā)酵液的蛋白質(zhì)清除率在18%左右，大杯傘燕麥發(fā)酵液蛋白質(zhì)清除率在18%左右，灰樹花燕麥發(fā)酵液的蛋白質(zhì)清除率在19%左右。

圖4 沖洗次數(shù)對(duì)不同發(fā)酵液蛋白清除率的影響Fig.4 Effect of the flushes frequency on the protein clearance rate of fermentation broth

2.3.3 醇沉的條件選擇

乙醇濃度對(duì)提取液中的多糖沉淀性質(zhì)有很大的影響，這種影響大部分取決于多糖的相對(duì)分子質(zhì)量和分子的結(jié)構(gòu)等。多糖分子量越大，沉淀所需的乙醇濃度就越小，并且乙醇的濃度越高，糖得率就越高，相應(yīng)的β-葡聚糖的得率也就越高，結(jié)果見表11。

表11 乙醇濃度對(duì)4種發(fā)酵液β-葡聚糖得率的影響Table 11 Effect of Ethanol concentration on β-Glucan yield of four fermentation broth

由表可知，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到60%的時(shí)候，β-葡聚糖已完全沉淀，乙醇的濃度升高，β-葡聚糖的得率僅有可忽略不計(jì)的增長，故在純化時(shí)，選擇濃度為60%進(jìn)行醇沉。

2.4 β-葡聚糖分子量測定

用高效凝膠色譜法測得的3種β-葡聚糖的分子量，結(jié)果見圖5。

未經(jīng)發(fā)酵的燕麥麩皮水提液純化出的燕麥β-葡聚糖的平均分子量為9.697×105。黃傘燕麥發(fā)酵純化出的β-葡聚糖的平均分子量為1.188×105，大杯傘麥發(fā)酵純化出的β-葡聚糖的平均分子量為2.279×105，灰樹花燕麥發(fā)酵純化出的β-葡聚糖的平均分子量3.516×105，平均分子量大小相比較經(jīng)雙向發(fā)酵的燕麥β-葡聚糖分子量大小明顯小于未經(jīng)發(fā)酵的燕麥β-葡聚糖。

2.5 發(fā)酵液中總糖、蛋白質(zhì)含量測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=6.27x+0.258 4，R2=0.988 0。總糖測定結(jié)果見圖6。

圖5 不同發(fā)酵液中純化的β-葡聚糖分子量Fig.5 Molecular mass of different fermentation broth

圖6 發(fā)酵液總糖含量測定Fig.6 Content of total sugar of the fermentation broth

由圖6可知，雙向發(fā)酵后發(fā)酵液內(nèi)總糖的含量比未經(jīng)發(fā)酵的燕麥水提液含量高。未經(jīng)發(fā)酵的燕麥水提液的總糖含量為11.375 g/L，黃傘燕麥發(fā)酵液總糖含量為18.05 g/L；大杯傘燕麥發(fā)酵液總糖含量為20.31 g/L，增加量最多；灰樹花燕麥發(fā)酵液總糖含量為16.82 g/L。經(jīng)過純化之后的β-葡聚糖因去過淀粉并用乙醇沉淀之后，去除了大部分的糖所以總糖含量相對(duì)較少。未經(jīng)發(fā)酵的燕麥β-葡聚糖1 g/L溶液的總糖含量為0.628 g/L；黃傘燕麥發(fā)酵β-葡聚糖1 g/L溶液的總糖含量為0.798 g/L，；大杯傘燕麥發(fā)酵β-葡聚糖1 g/L溶液的總糖含量為0.825 g/L；灰樹花燕麥發(fā)酵β-葡聚糖1 g/L溶液的總糖含量為0.704 g/L。

蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果見圖7。

圖7 發(fā)酵液及發(fā)酵純化后燕麥β葡聚糖蛋白質(zhì)含量測定Fig.7 Content of the protein of the fermentation broth and the purified oat-β-Glucan

燕麥麩皮水提液與3種發(fā)酵液因未經(jīng)過純化而相對(duì)蛋白質(zhì)含量較高，且發(fā)酵后的蛋白質(zhì)含量比水提液高，與未發(fā)酵水提液相比，灰樹花燕麥發(fā)酵液增加蛋白質(zhì)的含量更加顯著，且隨著濃度逐漸升高蛋白質(zhì)含量呈逐漸升高的趨勢，其次是大杯傘燕麥發(fā)酵液、黃傘燕麥發(fā)酵液。4種β-葡聚糖的水溶液因經(jīng)過純化去蛋白而含量較少，但依舊存在，是因?yàn)榈鞍酌笇⒌鞍追纸獬尚》肿与?，分子量小且溶于水，所以在純化時(shí)不宜沉淀下來，仍可以檢測出，與未發(fā)酵燕麥β-葡聚糖相比，黃傘燕麥β-葡聚糖蛋白含量最高，其次是灰樹花燕麥β-葡聚糖、大杯傘燕麥β-葡聚糖。

3 結(jié)論

1）利用剛果紅法，從12種藥食用真菌中篩選出雙向發(fā)酵后能使β-葡聚糖總量增加最大的3種真菌，即黃傘、大杯傘、灰樹花，其發(fā)酵穩(wěn)定后發(fā)酵液中所含β-葡聚糖為未進(jìn)行雙向發(fā)酵的燕麥水溶液中的β-葡聚糖含量的近2倍～3倍。

2）用1%的耐高溫α-淀粉酶在80℃去除淀粉30 min最為適宜，用seveg法除蛋白時(shí)sevage試劑中氯仿與正丁醇的比例為4∶1，sevage試劑的添加量為1/2，沖洗次數(shù)為2次時(shí)蛋白質(zhì)的清除率達(dá)到穩(wěn)定，當(dāng)乙醇濃度在60%時(shí)能將β-葡聚糖幾乎完全沉淀下來，醇沉2次效果更好。

3）經(jīng)雙向發(fā)酵的燕麥β-葡聚糖平均分子量明顯小于未經(jīng)發(fā)酵的燕麥β-葡聚糖?？偺羌暗鞍踪|(zhì)含量發(fā)酵后比未經(jīng)發(fā)酵的含量均升高。與未發(fā)酵水提液相比，灰樹花燕麥發(fā)酵液增加蛋白質(zhì)的含量更加顯著，且隨著濃度逐漸升高蛋白質(zhì)含量呈逐漸升高的趨勢，其次為大杯傘燕麥發(fā)酵液、黃傘燕麥發(fā)酵液。與未經(jīng)發(fā)酵的燕麥水提液相比，大杯傘燕麥發(fā)酵液總糖增加量最多，其次為黃傘燕麥發(fā)酵液、灰樹花燕麥發(fā)酵液。