王新明，呂長(zhǎng)鑫，*，蘆宇，紀(jì)秀鳳，巴俊文，李思逸，王維民，趙玉梅

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧錦州121013；2.大連中超食品有限公司，遼寧大連116400；3.朝陽(yáng)本色有機(jī)食品有限公司，遼寧朝陽(yáng)122000）

紅樹莓（red respberry）又稱托盤、懸鉤子、覆盆子和紅馬林等，為薔薇科懸鉤子屬多年生落葉小灌木型果樹[1]。果實(shí)色澤艷麗、干爽多汁、風(fēng)味獨(dú)特，富含水楊酸、鞣花酸、黃酮和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等多種保健成分[2]，被譽(yù)為“黃金水果”，并被列為“第三代水果”[3]。近年來(lái)，我國(guó)紅樹莓加工業(yè)是一種迅速崛起的新興產(chǎn)業(yè)，主要集中于飲料、果酒和罐頭制品的加工。隨著紅樹莓可食用部分的生產(chǎn)加工，大量紅樹莓籽作為加工副產(chǎn)物尚未得到有效利用[4-5]。研究表明，紅樹莓籽約占紅樹莓鮮果的10%，籽中含有油脂、花青素、多酚和黃酮等有益成分[6]。紅樹莓籽中油脂含量較高且紅樹莓籽油中不飽和脂肪酸和人體必需脂肪酸含量豐富，主要為亞油酸和亞麻酸，具有抗氧化、消炎和預(yù)防疾病等功能[7]。故將紅樹莓籽油開(kāi)發(fā)為營(yíng)養(yǎng)保健產(chǎn)品，將會(huì)有廣泛應(yīng)用前景。植物油脂提取方法較多，如索氏抽提法、有機(jī)溶劑萃取、超聲波法、微波法和超臨界CO2萃取等，這些提取方法操作繁瑣且存在有機(jī)溶劑殘留，故存在一定缺陷。水酶法是利用蛋白酶、果膠酶和纖維素酶等來(lái)破壞油料種子的脂蛋白和細(xì)胞壁，使油脂從植物細(xì)胞中釋放出來(lái)[8]。水酶法具有工藝簡(jiǎn)單、條件溫和、無(wú)溶劑殘留和綠色安全等特點(diǎn)[9]。因此，本研究擬采用響應(yīng)面優(yōu)化水酶法提取紅樹莓籽油的工藝，以期為提取紅樹莓籽油的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅樹莓籽：大連中超食品有限公司；Alcalase2.4 L堿性蛋白酶（酶活力2.4AU-A/g）（生物制劑）：諾維信生物技術(shù)公司；氫氧化鈉、檸檬酸鈉（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Centrifuge5804R冷凍離心機(jī)：德國(guó)艾本德股份公司；GT-100震動(dòng)球磨儀：北京格瑞德曼有限公司；SHA-2冷凍水浴恒振蕩器：金壇市瑞華儀器有限公司；DHG-9070A電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PL303型電子天平、FiveEasy Plus pH計(jì)：上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 工藝流程

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 操作要點(diǎn)

去除紅樹莓籽中雜質(zhì)、洗凈、恒溫干燥后，粉碎過(guò)60目篩，稱取一定質(zhì)量紅樹莓籽置于錐形瓶中，加入一定體積蒸餾水，45℃預(yù)熱1 h，調(diào)節(jié)pH值后加入堿性蛋白酶，一定溫度酶解反應(yīng)后90℃水浴滅酶10 min，6 000 r/min條件下離心10 min，收集上層油脂干燥至恒重，得到紅樹莓籽油。

1.4.2 紅樹莓籽油提取得率計(jì)算

紅樹莓籽油提取得率按下式計(jì)算：

式中：W為樹莓籽油提取得率，%；m1為錐形瓶和瓶?jī)?nèi)紅樹莓籽油質(zhì)量，g；m2為錐形瓶質(zhì)量，g；m為紅樹莓籽粉質(zhì)量，g。

1.4.3 紅樹莓籽油提取單因素試驗(yàn)

1.4.3.1 酶添加量對(duì)紅樹莓籽油提取得率影響

分別稱取5份過(guò)篩紅樹莓籽粉30 g于250 mL錐形瓶中，在料液比 1 ∶5（g/mL）、pH 8.0、酶解時(shí)間 4 h、酶解溫度45℃的條件下，分別考察堿性蛋白酶添加量為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%時(shí)對(duì)紅樹莓籽油提取得率的影響。

1.4.3.2 料液比對(duì)紅樹莓籽油提取得率影響

分別稱取5份過(guò)篩紅樹莓籽粉30 g于250 mL錐形瓶中，在酶添加量1.5%、pH 8.0、酶解時(shí)間4 h、酶解溫度 45℃條件下，分別考察料液比為 1∶3、1∶4、1∶5、1 ∶6、1 ∶7（g/mL）對(duì)紅樹莓籽油提取得率的影響。

1.4.3.3 酶解pH值對(duì)紅樹莓籽油提取得率影響

分別稱取5份過(guò)篩紅樹莓籽粉30 g于250 mL錐形瓶中，在料液比1∶5（g/mL）、酶添加量1.5%、酶解時(shí)間4 h、酶解溫度45℃條件下，分別考察酶解pH值為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 時(shí)對(duì)紅樹莓籽油提取得率的影響。

1.4.3.4 酶解時(shí)間對(duì)紅樹莓籽油提取得率影響

分別稱取5份過(guò)篩紅樹莓籽粉30 g于250 mL錐形瓶中，在料液比1∶5（g/mL）、酶添加量1.5%、pH 8.0、酶解溫度45℃的條件下，分別考察酶解時(shí)間為2、3、4、5、6 h時(shí)對(duì)紅樹莓籽油提取得率的影響。

1.4.4 紅樹莓籽油提取響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Design Expert 8.0.6.1軟件的Box-Behnken設(shè)計(jì)，以紅樹莓籽油提取得率（Y）為響應(yīng)值，酶添加量（A）、料液比（B）、酶解 pH 值（C）及酶解時(shí)間（D）為因素，因素水平表見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 酶添加量對(duì)紅樹莓籽油提取得率影響分析

堿性蛋白酶添加量對(duì)紅樹莓籽油提取得率影響如圖1所示。

圖1 酶添加量對(duì)紅樹莓籽油提取得率的影響Fig.1 Effects of enzyme dosage on the extraction rate of red raspberry seed oil

酶添加量為0.5%～2.0%時(shí)，提取率逐漸增加，這是因?yàn)榈鞍酌笇?duì)脂蛋白等復(fù)合體具有降解作用，酶與底物作用進(jìn)入脂質(zhì)體內(nèi)，對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)一步破壞，并對(duì)脂蛋白進(jìn)行分解，增加紅樹莓籽油料組織內(nèi)油脂流動(dòng)性，從而有利于油脂釋放[10]；酶添加量為2.0%時(shí)，提取得率最高；酶添加量大于2.0%后，提取得率略微下降，這是由于隨著酶添加量增加，酶與紅樹莓籽內(nèi)蛋白結(jié)合達(dá)飽和狀態(tài)，酶作用受限，且酶作為一種蛋白質(zhì)，對(duì)油脂有吸附作用，導(dǎo)致紅樹莓籽油提取得率下降[11]。因此，選擇適宜酶添加量為2.0%。

2.1.2 料液比對(duì)紅樹莓籽油提取得率影響分析

料液比對(duì)紅樹莓籽油提取得率影響如圖2所示。

料液比為 1 ∶3（g/mL）～1 ∶6（g/mL）時(shí)，提取得率逐漸增加，是因?yàn)檫m量水作為提取油脂過(guò)程中反應(yīng)介質(zhì)，對(duì)酶解反應(yīng)具有促進(jìn)作用[12]，且料液比過(guò)小，底物濃度較大，不利于酶對(duì)底物作用；料液比為1∶6（g/mL）時(shí)提取得率最高；料液比高于1∶6（g/mL）時(shí)，提取得率下降，由于料液比過(guò)大，底物濃度和酶濃度均較低，降低了酶反應(yīng)速度[13]。因此，選擇適宜料液比為1∶6（g/mL）。

圖2 料液比對(duì)紅樹莓籽油提取得率的影響Fig.2 Effects of solid-liquid ratio on the extraction rate of red raspberry seed oil

2.1.3 酶解pH值對(duì)紅樹莓籽油提取得率影響分析

酶解pH值對(duì)紅樹莓籽油提取得率影響如圖3所示。

圖3 pH值對(duì)紅樹莓籽油提取得率的影響Fig.3 EffectofpHvalueonextractionrateofredraspberryseedoil

pH 6～8時(shí)，提取得率逐漸增加；pH 8時(shí)，提取得率最高，這是因?yàn)锳lcalase2.4 L堿性蛋白酶最適pH值接近8，此條件下酶活高，酶對(duì)底物作用效果明顯，紅樹莓籽油提取得率最高[14]；當(dāng)pH值高于8時(shí)，提取得率逐漸下降。因此，選擇適宜提取pH值為8。

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)紅樹莓籽油提取得率影響分析

酶解時(shí)間對(duì)紅樹莓籽油提取得率影響如圖4所示。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)紅樹莓籽油提取得率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on extraction rate of red raspberry seed oil

酶解時(shí)間為2 h～4 h時(shí)，提取得率逐漸增加；酶解時(shí)間為4 h時(shí)提取得率最高，是因在適宜酶解時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)被破壞，酶解作用完全，提取得率最高；酶解時(shí)間大于4 h時(shí)，紅樹莓籽油提取得率趨于穩(wěn)定，由于反應(yīng)達(dá)到一定時(shí)間時(shí)底物減少，提取得率趨于恒定，且酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)增加能耗，對(duì)油品質(zhì)也有不利影響[15]。因此，選擇適宜酶解時(shí)間為4 h。

2.2 紅樹莓籽油提取響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面模型建立及顯著性分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)模型優(yōu)化紅樹莓籽油提取工藝，以紅樹莓籽油提取得率（Y）為響應(yīng)值，考察酶添加量（A）、料液比（B）、酶解 pH值（C）和酶解時(shí)間（D）對(duì)紅樹莓籽油提取得率的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Arrangement and corresponding results of Box-Behnken experimental design

對(duì)表2中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=6.27-0.019A+0.1B+0.11C-0.051D-0.033AB-0.32AC-0.017AD+0.31BC+0.097BD+0.28CD-0.52A2-0.62B2-0.93C2-0.23D2。該模型方差分析見(jiàn)表3，模型 p＜0.000 1，失擬項(xiàng) p=0.465 2＞0.05，模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明可用此模型對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)；R2=0.911 3，說(shuō)明該回歸方程擬合度較好；CV=4.67%，說(shuō)明其置信度較高；信噪比RSN=10.401，模型可調(diào)整確定系數(shù)R2Adj=0.825 5，說(shuō)明數(shù)據(jù)有較高可靠性。由F值可知，4個(gè)考察因素對(duì)紅樹莓籽油提取率影響依次為：C＞B＞D＞A。模型中 A2、B2、C2對(duì)紅樹莓籽油提取率影響極顯著，AC、BC、CD、D2影響顯著，其余項(xiàng)為不顯著。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance for the established regression model

續(xù)表3 方差分析表Continue table 3 Analysis of variance for the established regression model

2.2.2 響應(yīng)面各因素間交互作用分析

圖5～圖10為不同變量交互作用對(duì)提取得率影響的響應(yīng)面圖。在固定酶添加量（A）、料液比（B）、酶解pH值（C）和酶解時(shí)間（D）其中兩因素的條件下，紅樹莓籽油提取得率分別隨著各因素的增加而增加，達(dá)到最大值后隨各因素的增加而降低。響應(yīng)面圖可以直觀反映各變量對(duì)響應(yīng)值的影響，等高線圖形狀可以反映出各因素間交互作用強(qiáng)弱。在三維空間響應(yīng)面圖中，其曲面坡度陡峭表明對(duì)紅樹莓籽油提取得率影響顯著，反之平緩則不顯著。等高線圖中，其線性呈橢圓或趨向橢圓，表明對(duì)紅樹莓籽油提取得率影響顯著，呈圓形則不顯著。并且橢圓排列越密集，說(shuō)明在兩因素變化時(shí)，對(duì)響應(yīng)值影響越大，越接近橢圓形區(qū)域中心，紅樹莓籽油提取得率越高，越遠(yuǎn)離橢圓形區(qū)域中心，紅樹莓籽油提取得率越低[16]。

圖5 酶添加量與pH值對(duì)紅樹莓籽油提取得率的影響Fig.5 Effect of enzyme dosage and pH value on extraction rate of red raspberry seed oil

圖5a～圖5b為確定料液比和酶解時(shí)間基礎(chǔ)上，考量酶添加量與酶解pH值對(duì)紅樹莓油提取得率影響關(guān)系。圖5a表明，當(dāng)酶解pH值不變時(shí)，隨著酶添加量增加，紅樹莓油提取得率先增加后降低；同理，當(dāng)酶添加量不變時(shí)，紅樹莓油提取得率隨酶解pH值變化有類似趨勢(shì)。酶添加量與酶解pH值對(duì)紅樹莓油提取得率影響顯著，曲面較陡。其交互作用等高線圖呈橢圓形，響應(yīng)面圖陡峭，且P＜0.05說(shuō)明兩因素交互作用影響顯著。

圖6 料液比與pH值對(duì)紅樹莓籽油提取得率的影響Fig.6 Effect of solid-liquid ratio and pH value on extraction rate of red raspberry seed oil

圖6a～圖6b為確定酶添加量和酶解時(shí)間基礎(chǔ)上，考量料液比與酶解pH值對(duì)紅樹莓籽油提取得率影響程度。圖6a表明，當(dāng)酶解pH值不變時(shí)，隨著料液比增加，紅樹莓籽油提取得率先增加后降低；同理，當(dāng)料液比不變時(shí)，紅樹莓籽油提取得率隨酶解pH值變化有類似趨勢(shì)。原因可能是隨料液比增加，水作為提取劑，將紅樹莓籽中易溶于水的物質(zhì)提取出來(lái)，從而不利于紅樹莓籽油的提?。浑S酶解pH值增大，使堿性蛋白酶活性逐漸降低，不利于紅樹莓籽油溶出。酶添加量與酶解時(shí)間響應(yīng)面圖曲面較陡，等高線圖呈橢圓形，且P＜0.05說(shuō)明兩因素交互作用影響顯著。

圖7 pH值與提取時(shí)間對(duì)紅樹莓籽油提取得率的影響Fig.7 Effect of pH value and extraction time on extraction rate of red raspberry seed oil

圖7a～圖7b為固定酶添加量和料液比時(shí)，酶解時(shí)間與酶解pH值對(duì)紅樹莓油提取得率的影響。圖7a表明，當(dāng)酶解pH值不變時(shí)，隨著料液比增加，紅樹莓油提取得率先增加后降低；同理，當(dāng)酶解時(shí)間不變時(shí)，紅樹莓油提取得率隨酶解pH值的變化有類似趨勢(shì)。酶解時(shí)間對(duì)紅樹莓籽油提取得率影響不太顯著，曲面較平緩；酶解pH值對(duì)紅樹莓籽油提取得率影響顯著，曲面較陡；兩因素交互作用等高線圖呈橢圓形，響應(yīng)面圖較陡峭，且P＜0.05說(shuō)明兩因素交互作用影響顯著。

圖8 酶添加量與料液比對(duì)紅樹莓籽油提取得率的影響Fig.8 Effect of enzyme dosage and solid-liquid ratio on extraction rate of red raspberry seed oil

圖9 酶添加量與提取時(shí)間對(duì)紅樹莓籽油提取得率的影響Fig.9 Effect of enzyme dosage and enzymolysis time on extraction rate of red raspberry seed oil

圖8等高線圖相對(duì)偏圓，響應(yīng)面圖較陡，但P=0.797 4＞0.05，為不顯著；圖9～圖10中各因素交互作用等高線圖近似圓形，響應(yīng)面圖曲線較平緩，且P＞0.05說(shuō)明各因素交互作用不顯著；結(jié)合P值可知各因素對(duì)紅樹莓籽油提取得率影響依次為：AC＞BC＞CD＞BD＞AB＞AD，其中 AC、BC、CD 交互作用顯著，BD、AB、AD交互作用不顯著。由圖5～圖10可知，當(dāng)其它因素取零水平時(shí)，隨著酶添加量、料液比、酶解pH值和酶解時(shí)間單一變量增大，紅樹莓籽油提取得率呈先升高后降低趨勢(shì)，故在選擇各因素參數(shù)范圍內(nèi)均存在極值，可對(duì)紅樹莓籽油提取最佳工藝進(jìn)行預(yù)測(cè)。

圖10 料液比與提取時(shí)間對(duì)紅樹莓籽油提取得率的影響Fig.10 Effect of solid-liquid ratio and enzymolysis time on extraction rate of red raspberry seed oil

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果分析

由回歸方程求解得出紅樹莓籽油提取最佳工藝條件為料液比1∶5.46（g/mL）、酶添加量1.9%、提取時(shí)間3.88 h、pH 7.28，預(yù)測(cè)紅樹莓籽油提取得率在此工藝條件下為6.27%。為驗(yàn)證響應(yīng)面法優(yōu)化工藝結(jié)果可靠性，進(jìn)行3組平行驗(yàn)證試驗(yàn)，考慮實(shí)際操作條件，將預(yù)測(cè)最優(yōu)工藝參數(shù)調(diào)整為料液比1∶5.5（g/mL）、酶添加量1.9%、提取時(shí)間3.9 h、pH 7.3，結(jié)果顯示紅樹莓籽油提取得率的平均值6.25%，與預(yù)測(cè)值相差0.31%，證明結(jié)果可信度較高，可有效對(duì)水酶法提取紅樹莓籽油工藝進(jìn)行優(yōu)化及分析預(yù)測(cè)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)選取加工副產(chǎn)物紅樹莓籽為原料，利用水酶法提取紅樹莓籽油。通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)確定水酶法提取紅樹莓籽油最佳工藝條件為：料液比1 ∶5.5（g/mL）、酶添加量 1.9%、提取時(shí)間 3.9 h、pH 7.3，紅樹莓籽油提取得率預(yù)測(cè)值6.27%，實(shí)際值6.25%，響應(yīng)面模型與實(shí)際擬合良好，在實(shí)際應(yīng)用中具有一定參考價(jià)值。