董 婧 李婷婷 邱志霞 陸 燕 李文艷

1.上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院藥劑科，上海 200135；2.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 210009；3.中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院，江蘇南京 210009

比阿培南屬于碳青霉烯類抗菌藥物，對(duì)革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、厭氧菌及多重耐藥菌均有效，主要用于中、重度下呼吸道、泌尿道和腹腔等部位感染的治療[1]。甲氨蝶呤通過抑制二氫葉酸還原酶，阻止癌細(xì)胞分裂，用于治療急性白血病和乳腺癌等[2]。低劑量甲氨蝶呤也用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和銀屑病等自身免疫性疾病[3]。呋塞米廣泛應(yīng)用于治療充血性心力衰竭和水腫[4]，是住院老年患者使用頻率較高的藥物之一[5]。由于比阿培南和甲氨蝶呤、呋塞米在臨床上存在聯(lián)合用藥，而目前還沒有甲氨蝶呤和呋塞米對(duì)比阿培南藥代動(dòng)力學(xué)影響的研究報(bào)道。因此，本研究通過考察比阿培南和甲氨蝶呤、呋塞米聯(lián)用后在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)可能存在的藥物相互作用，為臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑

比阿培南（江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：190111125）；甲氨蝶呤（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：16031416）；呋塞米（純度98%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；內(nèi)標(biāo)對(duì)氨基苯甲酸（PABA，純度99.5%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；穩(wěn)定劑3-（N-嗎啡啉）-丙磺酸（MOPS，純度99%，美國Sigma 公司）；乙腈（色譜純，美國Fisher 公司）；其余試劑均為市售分析純。

1.2 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀、Waters2998二極管陣列檢測器（美國Waters 公司）；XW-80A 旋渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；Thermo ST16R 高速冷凍離心機(jī)（美國賽默飛世爾科技有限公司）；XS205標(biāo)準(zhǔn)型分析天平（千分之一，瑞士Mettler Toledoo 公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD 大鼠15只，體重260～280 g，7～8周齡，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：SinoChrom ODS-AP（5 μm，4.6 mm×150 mm，大連依利特分析儀器有限公司）；流動(dòng)相：乙腈-水（3∶97，含0.1 mol/L 醋酸鈉，pH 4.5），采用等度洗脫方式；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：30 μL；紫外檢測波長：300 nm。

2.2 給藥方案與樣品采集

應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表將大鼠隨機(jī)分為比阿培南單藥組（A 組）、比阿培南和甲氨蝶呤聯(lián)合給藥組（B 組）、比阿培南和呋塞米聯(lián)合給藥組（C 組），每組5只。A 組尾靜脈注射30 mg/kg 比阿培南，B 組尾靜脈注射30 mg/kg 比阿培南和3 mg/kg 甲氨蝶呤，C 組尾靜脈注射30 mg/kg 比阿培南和30 mg/kg 呋塞米。將大鼠飼養(yǎng)于代謝籠內(nèi)，于給藥前及給藥后0.03、0.08、0.17、0.33、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8 h 眼底靜脈叢取血約0.2 mL 置于肝素鈉抗凝的采血管中，4℃下12 000 r/min（離心半徑16.1 cm）離心5 min 后取上層血漿；于給藥前及給藥后0.5、1、2、4、6、8、12、24 h 收集尿液，血漿和尿液加入等體積1 mol/L MOPS 穩(wěn)定劑后，置-80℃冰箱冷凍保存待測。

2.3 樣品處理方法

精密吸取血漿樣品200 μL，加入16 μL（200 mg/L）PABA 溶液和200 μL 30%飽和硫酸銨溶液，渦旋振蕩2 min，12 000 r/min 離心10 min，（離心半徑16.1 cm）取上清液30 μL 進(jìn)樣測定。大鼠尿液樣品用流動(dòng)相稀釋5倍后吸取200 μL，其余處理步驟同血漿樣品。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 專屬性 比阿培南和內(nèi)標(biāo)PABA 在本色譜系統(tǒng)中的保留時(shí)間分別為3.5、6.4 min，大鼠空白血漿和尿液中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾比阿培南的測定，色譜圖見圖1～2。

圖1 血漿樣品中比阿培南和內(nèi)標(biāo)PABA 高效液相色譜圖

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及最低定量下限 取空白大鼠血漿或尿液90 μL，加入比阿培南工作液10 μL，使血漿中藥物濃度分別為0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100 mg/L，使尿液中 藥物濃度分別為0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 mg/L，混勻后加入100 μL 1 mol/L MOPS 溶液，再按“2.3”項(xiàng)下操作。另按上述方法配制濃度為0.5、5.0、40 mg/L 的比阿培南血漿質(zhì)控樣品溶液和濃度為1、10、100 mg/L 的尿液質(zhì)控樣品溶液。以測得的比阿培南和內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)，比阿培南濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行權(quán)重?cái)M合后得到血漿中比阿培南回歸方程為Y=0.124X+0.009，線性范圍為0.2～100 mg/L，最低定量下限0.2 mg/L；尿液中比阿培南回歸方程為Y=0.0166X+0.014，線性范圍為0.5～200 mg/L，最低定量下限為0.5 mg/L。

圖2 尿液樣品中比阿培南和內(nèi)標(biāo)PABA 高效液相色譜圖

2.4.3 提取回收率及精密度 以質(zhì)控樣品中比阿培南測得的峰面積與相同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液直接進(jìn)樣測得的峰面積之比，計(jì)算提取回收率。比阿培南提取回收率在82.2%～85.6%，日內(nèi)和日間精密度均在10%以內(nèi)，符合生物樣品分析要求。

2.4.4 穩(wěn)定性 質(zhì)控樣品在20℃放置4 h，在-80℃放置30 d，在-80℃放置24 h 后反復(fù)凍融處理3次，考察穩(wěn)定性。結(jié)果提示，比阿培南血漿和尿液樣品在各條件下均穩(wěn)定。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

比阿培南主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)消除半衰期（t1/2）、血藥濃度-時(shí)間曲線下面積（AUC0-∞）、清除率（CL）和腎清除率（CLr）等藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)采用WinNonlin 6.3非房室模型方法計(jì)算。采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用中位數(shù)（最小值，最大值）表示。對(duì)AUC0-∞（AUC 經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后）進(jìn)行獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，對(duì)MRT 和t1/2進(jìn)行Wilcoxon 符號(hào)秩和檢驗(yàn)。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6 大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究

與A 組比較，B 組AUC0-∞降低，CL、CLr增加，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；與A 組比較，C 組各藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)沒有顯著變化（P ＞0.05）。見表1。大鼠聯(lián)合給予比阿培南和甲氨蝶呤、呋塞米后的AUC0-∞見圖3。

表1 大鼠尾靜脈注射給藥后比阿培南藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（，n=5）

表1 大鼠尾靜脈注射給藥后比阿培南藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（，n=5）

注：與A 組比較，**P ＜0.01。t1/2：消除半衰期；MRT：平均駐留時(shí)間；AUC0-∞：血藥濃度-時(shí)間曲線下面積；V：表觀分布容積；CL：清除率；CLr：腎清除率

圖3 大鼠尾靜脈注射給予比阿培南和甲氨蝶呤、呋塞米后的比阿培南平均血藥濃度-時(shí)間曲線（n=5）

3 討論

臨床上抗菌藥物與其他藥物的聯(lián)合應(yīng)用越來越普遍，聯(lián)合用藥會(huì)產(chǎn)生一定的藥物相互作用，可能會(huì)導(dǎo)致抗菌藥物治療失敗、毒副作用發(fā)生或誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥[6-8]，藥代動(dòng)力學(xué)相互作用可發(fā)生在藥物吸收、分布、代謝和排泄各階段[9-11]。本研究首次考察了甲氨蝶呤和呋塞米對(duì)比阿培南在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)過程的影響，揭示可能存在的藥物相互作用。文獻(xiàn)報(bào)道，哌拉西林/他唑巴坦[12]、羥氨芐青霉素[13]、萬古霉素[14]與甲氨蝶呤聯(lián)用，會(huì)使甲氨蝶呤在體內(nèi)消除減慢，血藥濃度增加。而頭孢曲松、頭孢他啶[15]、環(huán)丙沙星[16]與甲氨蝶呤不存在藥代動(dòng)力學(xué)相互作用，但也有研究發(fā)現(xiàn)環(huán)丙沙星會(huì)引起甲氨蝶呤消除減慢[17-18]。呋塞米與頭孢噻啶、頭孢唑啉、頭孢地爾聯(lián)用時(shí)，會(huì)顯著減少頭孢噻啶和頭孢唑啉的腎清除[19]，但不影響頭孢地爾體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)過程[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，甲氨蝶呤使比阿培南在大鼠體內(nèi)的AUC0-∞降低，CL 和CLr增加差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.01）。呋塞米使比阿培南AUC0-∞增加，CL 和CLr減少，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05）。提示甲氨蝶呤和比阿培南存在藥代動(dòng)力學(xué)的相互作用，臨床上兩藥合用時(shí)需進(jìn)行劑量調(diào)整，而呋塞米和比阿培南不存在明顯的藥代動(dòng)力學(xué)相互作用，臨床上兩藥合用時(shí)無需進(jìn)行劑量調(diào)整。比阿培南給藥后約60%以原型經(jīng)腎臟排泄，甲氨蝶呤90%以原形經(jīng)腎臟排泄。因此，可以推測比阿培南與甲氨蝶呤的藥代動(dòng)力學(xué)相互作用靶點(diǎn)可能是在腎臟，今后我們將進(jìn)一步闡明兩藥相互作用的機(jī)制。