趙志鵬,李曉晨，李潤青，楊曉歡，趙秀英

(清華大學(xué)附屬北京清華長庚醫(yī)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，北京102218)

金黃色葡萄球菌(Sau)是自然界中分布最廣的細(xì)菌之一，可引起多種組織、器官感染，是重要的致病菌之一，但一般認(rèn)為Sau不是腹瀉的直接致病菌。在尋找腹瀉的病原學(xué)證據(jù)中，常規(guī)便培養(yǎng)僅限于沙門金屬、志賀菌屬的分離培養(yǎng)，Sau往往被忽視。本研究分析了本院近3年兒童糞便標(biāo)本中Sau的檢出情況，分別對(duì)比成人腹瀉糞便標(biāo)本檢出情況、并且對(duì)全部Sau菌進(jìn)行腸毒素(SEs)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兒科糞便標(biāo)本的Sau檢出率遠(yuǎn)高于成人，進(jìn)一步對(duì)兒科糞便標(biāo)本分離出的Sau進(jìn)行了SEs和ses檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)這些Sau具有高表達(dá)SEs和高攜帶ses的特點(diǎn)，因此兒童腹瀉病人中Sau應(yīng)該引起足夠重視。

1 材料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2015年1月到2018年8月來北京清華長庚醫(yī)院門、急診就診的腹瀉病人并且進(jìn)行糞便培養(yǎng)的病例總共2017例(其中成人1682例，兒童335例)，對(duì)兒童腹瀉病人糞便標(biāo)本中分離出的Sau進(jìn)行腸毒素研究。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)與鑒定

糞便標(biāo)本接種于血平板、SS平板或慶大平板(梅里埃)，可疑菌落使用全自動(dòng)微生物分析儀(梅里埃VITEK-Ⅱ Compact)進(jìn)行鑒定和藥敏。培養(yǎng)結(jié)果按照弧菌屬、單胞菌屬、沙門菌屬、志賀菌屬、難辨梭菌、金黃色葡萄球菌、其他菌屬進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)。

1.3 腸毒素檢測(cè)

使用酶聯(lián)免疫熒光法檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素(SEs)(梅里埃mini-VlDAS 免疫分析儀)。分離菌株接種于Thio液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h離心，取上清用于SEs檢測(cè)，按照試劑說明書所標(biāo)注，結(jié)果≥0.13判斷為陽性，<0.13判斷為陰性。

1.4 PCR法檢測(cè)毒素基因

PCR法檢測(cè)SEA-SEE五種最常見腸毒素的基因。94℃預(yù)處理5 min，94℃變性2 min,57℃退火2 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)[1]。引物序列見表1。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。

表1 腸毒素引物序列[1]

2 結(jié)果

2.1 兒童和成人檢出菌種分析

兒童腹瀉標(biāo)本335例，細(xì)菌培養(yǎng)檢出Sau 17例(5.07%)、沙門菌屬14例(3.58%)和假單胞菌菌屬5例(1.49%)。成人腹瀉標(biāo)本1682例，細(xì)菌培養(yǎng)檢出弧菌屬116例(6.90%)、單胞菌屬28例(1.66%)、沙門菌屬25例(1.49%)、志賀菌屬7例(0.42%)、難辨梭菌5例(0.30%)、金黃色葡萄球菌3例(0.18%)和其他21例(1.25%),如表2。

表2 兒童及成人 門急診腹瀉患者便培養(yǎng)結(jié)果

2.2 兒童腹瀉標(biāo)本Sau產(chǎn)腸毒素結(jié)果

17例兒童糞便標(biāo)本中分離的Sau有10例(58.85%)腸毒素檢測(cè)陽性，7例(41.18%)腸毒素檢測(cè)陰性，兒童腹瀉標(biāo)本Sau產(chǎn)腸毒素率為58.85%。

2.3 兒童腹瀉標(biāo)本Sau腸毒素基因檢測(cè)結(jié)果

17例兒童糞便標(biāo)本中分離的Sau樣本中10例攜帶腸毒素基因，其中一例同時(shí)攜帶sec和sed,一例同時(shí)攜帶seb和see，一例毒素陽性而基因檢測(cè)陰性，兩例毒素陰性而基因檢測(cè)陽性，腸毒素基因攜帶和腸毒素表達(dá)情況見表3。

表3 腸毒素基因和毒素表達(dá)檢測(cè)匯總表

3 討論

腸道菌群的復(fù)雜性決定了感染性腹瀉病人尋找病原學(xué)證據(jù)的困難性， Sau是環(huán)境中存在較為廣泛的細(xì)菌之一，Johns Hopkins School的一項(xiàng)研究顯示在抽檢的24間臥室的塵土中12間培養(yǎng)出了Sau(50%)，應(yīng)用定量PCR技術(shù)檢出率更高[2]。加利福尼亞51963份生牛奶樣本中Sau檢出率為25.3%[3]，在伊拉克食物處理者的鼻咽部30.1%能夠分離出Sau，其中38%為產(chǎn)腸毒素株[4]。在我國Sau產(chǎn)生腸毒素污染食物也較常見[5-7]，尤其牛奶及奶制品，中國黑龍江省400份兒生牛奶樣本中Sau檢出率高達(dá)83.5%[8],Sau與腹瀉的關(guān)系研究最受重視的兩個(gè)方面是抗生素相關(guān)性偽膜性腸炎和食物中毒性腹瀉，而門急診腹瀉病人Sau檢測(cè)一般不作為常規(guī)篩查項(xiàng)目。

本研究發(fā)現(xiàn)兒童腹瀉病人糞便標(biāo)本中檢出的病原譜與成人有顯著差異，成人以弧菌屬、單胞菌屬檢出率較高，而兒童則以 Sau檢出率最高。王芳健[9]分析山東地區(qū)嬰幼兒腹瀉病例Sau占全部檢出病原菌的5.1%，嚴(yán)銀燕[10]等對(duì)浙江省腹瀉兒童病原學(xué)分析指出Sau占全部檢出病原菌的23.4%。分析原因，成人和兒童的飲食譜存在差異，兒童有更多機(jī)會(huì)攝入奶、奶制品、蛋類、肉罐頭等，而這些食物是常見的易被Sau或其毒素污染的食物，本實(shí)驗(yàn)室觀察的17例Sau培養(yǎng)陽性的兒童有12人為3歲到4歲，此年齡段兒童正是攝入此類食品較多的年齡段，且此年齡段兒童從母體獲得的免疫力已經(jīng)降低，自身免疫力又未充分建立，這可能是此年齡段兒童Sau感染引起腹瀉高發(fā)的原因。環(huán)境中的Sau耐藥率與糞便分離Sau耐藥率一致也間接證明了糞便中的Sau來源于環(huán)境的可能性大。

Sau引起腹瀉的毒力因子為腸毒素(SEs)，將有明確致嘔吐作用的命名為腸毒素(SEs)，沒有或致嘔吐作用尚有待確證的命名為腸毒素樣毒力因子(SEls),目前發(fā)現(xiàn)的SEs和SEls有二十一種。本研究研究了SEa-SEe五種最常見的腸毒素，發(fā)現(xiàn)經(jīng)糞便培養(yǎng)出的sau產(chǎn)腸毒素率為58.85%，與汪永祿等[11]報(bào)道的產(chǎn)腸毒素率為50%接近。

綜上，嬰幼兒腹瀉患者中Sau培養(yǎng)陽性率高，且分離得到的菌株產(chǎn)腸毒素率高，因此對(duì)于嬰幼兒的腹瀉病例建議便培養(yǎng)時(shí)增加對(duì)Sau的篩查，直接檢測(cè)糞便中的腸毒素也是提高腹瀉患者病因精準(zhǔn)診斷的方法和保障。但本研究研究例數(shù)較少，而且缺乏環(huán)境(母親、輔食、居住環(huán)境)中Sau的研究，因此對(duì)sau的感染途徑尚需要進(jìn)一步研究和探討。