毛 君，付 珺

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢市中心醫(yī)院 1.甲狀腺乳腺外科；2.胸外科，湖北 武漢430014)

乳腺癌(BC)是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤，是女性因癌癥致死的主要原因之一[1]。雖然BC在診斷儀器及標準化診斷方法上取得了很大進展，但BC細胞的遠端轉(zhuǎn)移仍是臨床診斷及治療的一大挑戰(zhàn)[2]。因此，研究乳腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的重要分子機制對BC的發(fā)生和發(fā)展具有重要意義。microRNAs(miRNAs)是一類約含17-25個核苷酸的具有調(diào)控功能的非編碼RNA大家族，成熟的miRNAs通過堿基互補配對的方式識別靶mRNA，并根據(jù)互補程度的不同指導沉默復合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯[3]。研究顯示，miR-33a參與多種生理病理過程，包括新陳代謝、細胞分化、腫瘤發(fā)生及發(fā)展等[4]。在肺癌[5]、乳腺癌[6]、胰腺癌[7]及骨肉瘤[8]中，miR-33a均被證明通過靶向多個致癌基因而充當抑癌因子的角色。而對于乳腺癌細胞，miR-33a的相關(guān)研究還未涉及詳盡的細胞增殖、遷移實驗，且其相關(guān)機制也亟待說明。本課題通過上調(diào)BC細胞MDA-MB-231中miR-33a-5p的表達，觀察其對細胞增殖和遷移能力的影響，并探討相關(guān)作用機制，旨在為BC的臨床診斷及治療奠定充分的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞株、主要試劑

人正常乳腺上皮細胞HBL-100及4種乳腺癌細胞MDA-MB-231、MCF-7、T-47D和BT-474均購自中國科學院細胞庫。DMEM及胎牛血清購自美國Gibco公司；青霉素、鏈霉素購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；增強miR-33a-5p表達的特異性序列miR-33a-5p mimics及其陰性對照(miR-NC)、S1PR1過表達慢病毒載體(pLV-S1PR1)及空質(zhì)粒(pLV-NC)以及含野生型(WT)和突變型(MUT)S1PR1 3′UTR序列的熒光素酶報告基因質(zhì)粒均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計并提供；總RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBRTMGreen PCR Master Mix購自美國Thermo Fisher Scientific公司；雙熒光素酶檢測試劑盒購自美國Promega公司；MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；全蛋白提取試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；增強型電化學發(fā)光(ECL)檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；兔抗S1PR1一抗以及辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗購自英國Abcam公司。

1.2 細胞的培養(yǎng)

人正常乳腺上皮細胞HBL-100及4種乳腺癌細胞MDA-MB-231、MCF-7、T-47D和BT-474經(jīng)復蘇后均接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 g/mL鏈霉素的DMEM中，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2的濕潤培養(yǎng)箱中；當細胞融合率達到85%左右時，0.25%胰酶消化處理，反復吹打呈單細胞懸液后進行傳代培養(yǎng)，待生長狀態(tài)良好時用于實驗。

1.3 qRT-PCR檢測人正常乳腺上皮細胞及乳腺癌細胞株中miR-33a-5p及S1PR1的水平

取處于對數(shù)生長期的5種細胞(HBL-100、MDA-MB-231、MCF-7、T-47D和BT-474)各約1.0×105個，同步化處理后接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h后收集細胞采用總RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，后取2 μg的RNA進行反轉(zhuǎn)錄為cDNA單鏈。取2 μl的cDNA進行PCR反應(yīng)：反應(yīng)體系為20 μl，包含2 μl的cDNA、10 μl的SYBR Green Mix、上下游引物各0.5 μl以及7 μl的滅菌水。反應(yīng)程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共35個循環(huán)。分別選擇U6和GAPDH為miR-33a-5p及S1PR1的內(nèi)參基因，所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成(見表1)。兩指標在不同細胞株中的相對表達水平采用2-ΔΔCT法進行計算，miR-33a-5p指標ΔΔCT=(CTmiR-33a-5p-CTU6)癌細胞-(CTmiR-33a-5p-CTU6)正常細胞；S1PR1指標ΔΔCT=(CTS1PR1-CTGAPDH)癌細胞-(CTS1PR1-CTGAPDH)正常細胞。實驗重復3次。并對miR-33a-5p及S1PR1在4種癌細胞株中的相對表達水平進行相關(guān)性分析。

表1 PCR引物序列

1.4 生物信息學和雙熒光素酶報告實驗分別預測、驗證miR-33a-5p與S1PR1的靶向關(guān)系

采用Targetscan在線分析軟件預測miR-33a-5p與S1PR1的靶向關(guān)系。同時采用雙熒光素酶報告實驗驗證該關(guān)系：取生長對數(shù)期的MDA-MB-231細胞，用胰酶消化處理，反復吹打成單細胞懸液，24孔板中每孔接種5.0×104個細胞，約200 μl；12 h后，分別向MDA-MB-231細胞中轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimics和miR-NC；24 h后，再將0.2 μg 含S1PR1-3′UTR-WT序列或S1PR1-3′UTR-MUT序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細胞中；繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，棄取舊培養(yǎng)基，添加新鮮的含10%胎牛血清的DMEM再培養(yǎng)24 h；細胞經(jīng)PBS洗滌3次，棄盡洗液，每孔加200 μL的細胞裂解液，振蕩15 min，在4℃、1000×g條件下離心5 min，吸取上清液加入到避光的24孔板中；按雙熒光素酶檢測試劑盒說明，在多功能酶標儀上檢測并計算相對熒光素酶的活性。實驗重復3次。

1.5 Western blot檢測miR-33a-5p表達調(diào)控對S1PR1表達的影響

根據(jù)上述結(jié)果，進一步在細胞水平上驗證miR-33a-5p的表達調(diào)控對S1PR1的表達是否有影響：MDA-MB-231細胞實驗分3組，即對照組(Control)、miR-33a-5p-NC組及miR-33a-5p mimics組，細胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細胞提取總蛋白，后進行濃度檢測；取20 μg蛋白和4 μl 2×SDS上樣緩沖液混合均勻，100℃變性10 min；上樣，10% SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上；用5%脫脂牛奶封閉1 h；PBS洗膜；PBS洗膜后分別加入兔一抗(S1PR1，1∶1000；GAPDH，1∶1500)在4℃下，孵育過夜；PBS洗膜；加入HRP標記的羊抗兔IgG二抗(1∶2500)室溫孵育0.5 h；PBS洗膜；用ECL化學發(fā)光進行顯色。實驗重復3次。以GAPDH為內(nèi)參蛋白，后采用Quantity One圖像處理軟件對灰度值進行半定量分析。

1.6 MTT檢測細胞增殖能力

分別取生長處于對數(shù)期的5組MDA-MB-231細胞(miR-NC組、miR-33a-5p mimics組、pLV-NC組、pLV-S1PR1組以及miR-33a-5p mimics+pLV-S1PR1組)進行同步化操作后，按照1.0×105/ml濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)置3個平行復孔。37℃，5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，棄盡培養(yǎng)基，每孔加入50 μl濃度為5 g/L的二苯基溴化四氮唑藍(MTT)繼續(xù)孵育4 h，后每孔加入200 μl的二甲基亞楓(DMSO)終止培養(yǎng)。然后應(yīng)用酶標儀測量每孔在490 nm處的吸光度(OD)并進行比較分析。

1.7 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

同上述1.6，此部分細胞實驗同樣分5組：miR-NC組、miR-33a-5p mimics組、pLV-NC組、pLV-S1PR1組以及miR-33a-5p mimics+pLV-S1PR1組。取生長處于對數(shù)期的各組細胞，同步化操作后將各組細胞制成細胞密度為1.0×106個/mL的細胞懸液加入到24孔板中，每組設(shè)置3個平行復孔，過夜培養(yǎng)至形成單層細胞；后用槍頭在單層細胞上輕輕畫一道橫線，用PBS洗去脫落的細胞，顯微鏡下拍照記錄初始(0 h)劃痕寬度，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，再次在顯微鏡下拍照記錄劃痕寬度并計算、比較劃痕愈合率。劃痕愈合率與細胞的遷移能力呈正相關(guān)，劃痕愈合率(%)=0 h的劃痕寬度-24 h的劃痕寬度)/0 h的劃痕寬度×100%。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 miR-33a-5p與S1PR1在乳腺癌細胞株中的表達及相關(guān)性

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示(圖1A)，與人正常乳腺上皮細胞HBL-100比較，miR-33a-5p在4種乳腺癌細胞株中的相對表達水平均顯著升高(P<0.01)，而S1PR1在4種癌細胞株中的相對表達水平均顯著降低(P<0.05；P<0.01)；選擇miR-33a-5p與S1PR1表達量變化最顯著的MDA-MB-231細胞為后期實驗的重點研究對象。相關(guān)性分析結(jié)果顯示(圖1B)，miR-33a-5p與S1PR1在4種癌細胞株中的表達呈顯著負相關(guān)(r=-0.994；P=0.006<0.01)，提示二者可能存在潛在的調(diào)控關(guān)系。

A：miR-33a-5p與S1PR1在4種乳腺癌細胞中的相對表達量，與正常HBL-100細胞組比較，*P<0.05，**P<0.01，##P<0.01；B：miR-33a-5p與S1PR1在4種乳腺癌細胞中的表達相關(guān)性分析，P<0.01。

圖1 miR-33a-5p與S1PR1在乳腺癌細胞株中的表達及相關(guān)性

2.2 miR-33a-5p與S1PR1靶向關(guān)系預測及驗證

生物信息學軟件TargetScan分析結(jié)果顯示(圖2A)，miR-33a-5p與S1PR1的3'UTR有一個保守的結(jié)合位點；雙熒光素酶報告實驗進一步確定了兩者的靶向關(guān)系關(guān)系，結(jié)果顯示，與miR-33a-5p-NC組比較，miR-33a-5p mimics顯著降低了野生型(WT)S1PR1質(zhì)粒熒光素酶的活性(P<0.01)；而miR-33a-5p mimics對突變型(MUT)S1PR1質(zhì)粒熒光素酶的活性無影響，提示S1PR1上確實存在miR-33a-5p的結(jié)合位點。進一步細胞實驗驗證結(jié)果顯示(圖2B)，與miR-33a-5p-NC組比較，miR-33a-5p mimics顯著降低了MDA-MB-231細胞中S1PR1蛋白的表達(P<0.01)，提示過表達miR-33a-5p能顯著降低MDA-MB-231細胞中S1PR1蛋白的表達。

A：miR-33a-5p與S1PR1靶向關(guān)系預測，與S1PR1-WT組比較，**P<0.01；B：Western blot驗證miR-33a-5p與S1PR1的靶向關(guān)系，與正常miR-33a-5p-NC組比較，**P<0.01。

圖2 miR-33a-5p與S1PR1靶向關(guān)系預測及驗證

2.3 miR-33a-5p與S1PR1對細胞增殖能力的影響

將miR-33a-5p mimics和pLV-S1PR1分別或聯(lián)合轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細胞后采用MTT法檢測各組細胞的增殖能力。如圖3所示，48 h時，與miR-NC組比較，miR-33a-5p mimics顯著抑制細胞增殖(P<0.01)；與pLV-NC組比較，pLV-S1PR1顯著促進了細胞增殖(P<0.01)；而與miR-33a-5p mimics和pLV-S1PR1組比較，miR-33a-5p mimics與pLV-S1PR1聯(lián)合轉(zhuǎn)染組細胞增殖能力分別顯著增加和降低(均P<0.01)。由此提示miR-33a-5p與S1PR1分別能抑制和促進細胞增殖，且miR-33a-5p對S1PR1的增殖促進作用產(chǎn)生一定的抑制影響。

與miR-NC組比較，**P<0.01；與miR-33a-5p-mimics組比較，&&P<0.01；與pLV-NC組比較，##P<0.01；與pLV-S1PR1組比較，$$P<0.01。

圖3 miR-33a-5p與S1PR1對細胞增殖能力的影響

2.4 miR-33a-5p與S1PR1對細胞增殖遷移的影響

將miR-33a-5p mimics和pLV-S1PR1分別或聯(lián)合轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細胞后采用劃痕法檢測各組細胞的遷移能力。如圖4所示，24 h后統(tǒng)計各組細胞劃痕愈合率，與miR-NC組比較，miR-33a-5p mimics組細胞劃痕愈合率顯著降低(P<0.01)；與pLV-NC組比較，pLV-S1PR1細胞劃痕愈合率顯著增加(P<0.01)；而與miR-33a-5p mimics和pLV-S1PR1組比較，miR-33a-5p mimics與pLV-S1PR1聯(lián)合轉(zhuǎn)染組細胞劃痕愈合率分別顯著增加和降低(均P<0.01)。由此提示miR-33a-5p與S1PR1分別能抑制和促進細胞遷移，且miR-33a-5p對S1PR1的遷移促進產(chǎn)生一定的抑制作用。

3 討論

近年來的研究表明，miRNAs的異常表達參與了腫瘤的進展；這些miRNAs通過抑制靶基因發(fā)揮

與miR-NC組比較，**P<0.01；與miR-33a-5p-mimics組比較，&&P<0.01；與pLV-NC組比較，##P<0.01；與pLV-S1PR1組比較，$$P<0.01。

圖4 miR-33a-5p與S1PR1對細胞遷移能力的影響

功能，在腫瘤細胞增殖、侵襲、血管內(nèi)灌注、存活、外滲和定植的協(xié)調(diào)中發(fā)揮重要作用[9]。因此，特異性miRNA及其參與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的靶點的鑒定，將為尋找新的腫瘤防治診斷和治療靶點提供重要線索。有趣的是，Blenkiron等人的微列陣分析結(jié)果顯示，miR-33a在人乳腺癌中經(jīng)常丟失[10]。Zhang等人的實驗結(jié)果顯示，與正常組織比較，miR-33a在人乳腺癌癌組織中呈顯著低表達；此外，在乳腺癌患者中發(fā)現(xiàn)miR-33a表達降低與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移增加之間存在相關(guān)性[11]。而本研究結(jié)果顯示，與正常乳腺上皮細胞比較，miR-33a在多種乳腺癌細胞株中呈顯著低表達；且體外實驗表明，過表達miR-33a能顯著降低乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖和遷移。因此，我們的研究確定miR-33a是乳腺癌轉(zhuǎn)移中的抑癌基因。

鞘氨醇1磷酸酯受體1(S1PR1)被報道參與調(diào)節(jié)癌癥的生長、侵襲、遷移和耐輻射等特性[12]。例如，Li等人顯示S1PR1可介導腎母細胞瘤細胞的遷移和侵襲[13]。Bao等人發(fā)現(xiàn)過表達S1PR1能夠促進人肝癌細胞的遷移和侵襲[14]。重要的是，Zhang等人也認定miR-148a直接靶向作用于S1PR1參與肝癌細胞侵襲的調(diào)控[15]。此外，在乳腺癌細胞中，Wu等發(fā)現(xiàn)miR-542同樣靶向作用于S1PR1進而介導細胞的增殖和侵襲[16]。這些結(jié)果支持了我們目前的發(fā)現(xiàn)，并提出miR-33a-5p通過下調(diào)S1PR1介導抑癌的潛在機制。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與正常乳腺上皮細胞比較，miR-33a-5p和S1PR1在多種乳腺癌細胞中分別呈顯著低表達和高表達，且二者在癌細胞株的表達存在顯著相關(guān)性。緊接著，我們預測了二者的靶向關(guān)系，提示S1PR1為miR-33a-5p的潛在作用靶標，熒光素酶報告基因同樣證明了這一預測結(jié)果，且進一步的Western blot實驗證明了miR-33a-5p對S1PR1的表達調(diào)控作用。此外，miR-33a-5p的過表達能抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖和遷移能力。這些結(jié)果暗示miR-33a-5p可能在如乳腺癌的遠端轉(zhuǎn)移中扮演重要角色。同樣，基于二者的靶向關(guān)系，我們進一步驗證了S1PR1過表達能提升乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖和遷移能力，且miR-33a-5p過表達能顯著減弱S1PR1對MDA-MB-231細胞增殖和遷移能力的促進作用；說明miR-33a-5p對S1PR1的靶向抑制是乳腺癌生物學特征發(fā)生改變的基礎(chǔ)。

綜上所述，我們的研究結(jié)果顯示miR-33a-5p是一種乳腺癌抑制基因，同時S1PR1為miR-33a-5p的重要靶基因且能被其顯著下調(diào)。我們的數(shù)據(jù)強調(diào)過表達miR-33a-5p和S1PR1分別顯著抑制、促進乳腺癌細胞的增殖和遷移；且miR-33a-5p能削弱S1PR1對癌細胞增殖和遷移的促進能力。因此，miR-33a-5p可能通過靶向S1PR1引起乳腺癌細胞遷移和增殖能力的改變，可作為乳腺癌細胞靶向分子治療的潛在靶點，也為后期進一步進行的詳盡機制研究奠定了理論基礎(chǔ)。