朱學偉，段偉那,2，陳明星*

(1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，吉林 長春130033；2.內蒙古醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院)

近一個世紀以來，變應性疾病的發(fā)病率增加，醫(yī)療支出加劇，給病患及社會帶來沉重負擔。包括細菌超抗原，病毒以及大氣污染等外界環(huán)境因素變化對變應性鼻炎的影響為我們提出新的問題與挑戰(zhàn)。病毒廣泛存在于呼吸道，中國10歲以上人口EB病毒(EBv)感染率高達86%以上，是研究呼吸道變態(tài)反應中不能忽視的外部因素[1]。近年來研究顯示，病毒感染不但與腫瘤有關而且與變應性鼻炎及哮喘密切相關，可能是促進變應性鼻炎發(fā)生發(fā)展的重要病因之一[2]。本研究擬通過制備LMP-1重組質粒，并滴鼻觀察其對變應性鼻炎鼠模型鼻黏膜組織Th2方向的免疫調節(jié)細胞因子IL-5以及IL-13影響。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物BALB/c小鼠常規(guī)飼養(yǎng)于吉林大學白求恩醫(yī)學部實驗動物中心，雌雄各20只，均為8-10周齡，體重在20-25 g， 12 h間斷照明。 LMP-1重組質粒及脂質體訂購于中國公共蛋白及質粒實驗室(Public Protein/Plasmid Library,China;PPL)。LMP-1插入片段大小為1 161 bp，Gene ID:378750。氫氧化鋁膠、卵清蛋白(ovalbumin，OVA) 均為美國Sigma公司產品。鼠IL-5抗體以及IL-13購置于加拿大Biowen公司。免疫組織化學染色試劑盒為加拿大Boisynthesis Blotechnology公司產品。

1.2 分組40只BALB/c鼠分為2組，每組 20只，分別為：AR模型組、質粒組。 兩組動物模型均經過3個階段，即第1階段腹腔注射基礎致敏，第2 階段滴鼻激發(fā)。第1階段腹腔注射，分別以20 μg OVA加鋁佐劑在于第0、7、14天進行。腹腔注射后，進行滴鼻激發(fā)，5% OVA滴鼻，每側10 μl，連續(xù)5天。第3階段AR模型組連續(xù)兩天給予20 μl空白脂質體滴鼻，質粒組連續(xù)兩天給予20 μl脂質體包裹的質粒(質粒和脂質體比例1∶2.5，濃度為0.25/μl)。給藥后進行癥狀觀察：第2次鼻內給予脂質體滴鼻后，觀察計數(shù)每個小鼠1 h內抓鼻及噴嚏次數(shù)，并用攝像機進行攝錄。

1.3 免疫組織化學方法

第2次鼻內給藥后1天，處死小鼠，獲取新鮮鼻甲，鼻中隔黏膜組織。鼻黏膜組織經10%的甲醛固定、脫鈣、包埋、切片，進行蘇木素一伊紅染色，觀察嗜酸性粒細胞浸潤情況。計數(shù)方法采用3個隨機200倍視野下的平均數(shù)進行計數(shù)。

獲得的鼻黏膜組織切片經10%的山羊血清封閉后，進行免疫組織化學染色分析。IL-5以及IL-13的免疫組織化學操作參照免疫組化試劑盒進行。結果分析采用圖像分析系統(tǒng)進行，結果計算5個200倍視野下的陽性細胞光密度值。以均數(shù)±標準差表示。染色細胞比例超過25%計為表達陽性。光密度值×陽性面積值/100=表達指數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學方法

實驗所得數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示。數(shù)據(jù)均進行正態(tài)性檢驗，統(tǒng)計學分析采用SPSS16.0軟件進行。兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗。P≤0.05被視為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

兩組40個小鼠經OVA滴鼻后均產生噴鼻及抓鼻的過敏性鼻炎的癥狀。HE染色結果顯示，LMP-1重組質粒組小鼠鼻黏膜組織產生大量的嗜酸性粒細胞聚集，與AR模型組對照比較結果具有統(tǒng)計學意義(P≤0.05)。免疫組化結果證實LMP-1重組質粒鼻內刺激變應性鼻炎鼠模型鼻黏膜上皮細胞中IL-5以及IL-13高表達，表達指數(shù)與AR模型組對照比較結果具有統(tǒng)計學意義(P≤0.05)。見表1。

表1 兩組動物模型嗜酸性粒細胞計數(shù)及IL-5以及IL-13表達指數(shù)結果比較

3 討論

病毒感染對呼吸道過敏性疾病的影響有兩個方面:“保護作用”和“增強作用”。兩個方面并不沖突而是在變應 性鼻炎不同階段的不同作用?！氨Ｗo作用”指許多研究表明個體早期病毒感染可以減少過敏發(fā)展的機會，這一觀點被衛(wèi)生假說 (“hygiene hypothesis”)所支持。其“增強作用”指包括鼻病 毒(rhinovirus)及EB病毒感染會放大氣道過敏的臨床癥狀。Contoli M等[3]發(fā)現(xiàn)變應性性鼻炎患者在鼻病毒RV-16病毒株的感染后,復制數(shù)量與鼻黏膜上皮細胞IL-4 mRNA水平增加具有相關性。鼻病毒通過對鼻黏膜上皮細胞TLR3表達的抑制及細胞信號IRF通路抑制，限制了機體對RV-16防御免疫反應的強度,增加鼻變態(tài)反應Th2方向的主要細胞 因子IL-4和IL-13水平。英國的Cakebread JA等[4]發(fā)現(xiàn)鼻病毒感染誘 導的炎癥可導致支氣管上皮細胞Th2炎性細胞因子IP-10， IL-8和 GM-CSF的釋放，進而放大變態(tài)反應強度。

可見，病毒感染對呼吸道病毒感染Th2方向的細胞因子及變態(tài)反應有明確的促進及增強作用。EB病毒及其特征蛋白 LMP-1促進細胞 HMGB1表達，而 HMGB1 促進嗜酸性粒細胞存活，是調控鼻變態(tài)反應的關鍵信號之前的研究顯示，EB病毒主要病毒基因LMP-1 DNA水平與鼻黏膜上皮細胞的促進變態(tài)反應的水平具有相關性。Th2方向的變態(tài)反應強度與鼻黏膜上皮細胞TSLP的表達水平也具有相關性[5]。鼻黏膜上皮細胞是啟動鼻變態(tài)反應的關鍵靶細胞，之前相關研究也證實，小核酸CpG通過滴鼻也會促進動物模型鼻變態(tài)反應的強度[6]?？傊?，本研究證實鼻黏膜上皮細胞EB病毒重要基因LMP-1感染可能參與鼻變態(tài)反應的誘導、增強作用，其機制可能是EB病毒LMP-1通過刺激釋放鼻黏膜上皮細胞表達的Th2方向的免疫細胞因子IL-5以及IL-13進行調節(jié)。