姚艷艷，常麗榮，王曉輝，閆 欣，姜雙雙，李永青

（威海長青海洋科技股份有限公司，山東 榮成 264300）

海洋中蘊藏著豐富的生物資源，其中海藻種類豐富[1]，并富含多種多糖類物質(zhì)，如瓊膠、褐藻膠等。瓊膠及其水解產(chǎn)物瓊膠寡糖因具有延緩衰老[2-4]、抗病抑菌[5]、增強免疫[6-8]、抗病毒[9-10]、抗淀粉老化[11]等多種生物活性而成為近年來的研究熱點，在新藥物、新功能性食品、高端化妝品的研發(fā)領(lǐng)域都展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[12]。

瓊膠寡糖的制備方法主要有化學(xué)降解法和酶解法?；瘜W(xué)降解法操作簡單、生產(chǎn)成本較低，但能耗高、污染嚴(yán)重，因而未得到廣泛應(yīng)用。相比之下，酶解法具有特異性強、反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)過程易于控制、較為環(huán)保的特性，能夠?qū)崿F(xiàn)對瓊膠的高效降解，因而成為制備瓊膠寡糖較為常用的途徑。瓊膠酶被廣泛應(yīng)用于制備瓊膠寡糖和瓊膠低聚糖[13-14]、分子生物學(xué)研究[15]、海藻遺傳工程的工具酶等方面[16-18]。但現(xiàn)有工業(yè)化生產(chǎn)的瓊膠酶來源比較單一，且成本較高[19-20]，導(dǎo)致瓊膠酶的應(yīng)用研究與開發(fā)受到限制。

據(jù)報道，瓊膠酶菌株常見來源有海水、淡水、土壤、藻類等[21-22]。從海洋動物，如海兔屬（Aplysia）、鮑屬（Haliotis）、濱螺屬（Littorina striata）、冠海詹屬（Diadema antillarum）體內(nèi)分離得到瓊膠酶菌株的報道還較少[23]。本研究以鮑腸道內(nèi)篩選得到的產(chǎn)瓊膠酶弧菌（Vibrio）Y-AG3為研究對象，采用單因素試驗、Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗及Box-Behnken試驗對其產(chǎn)瓊膠酶發(fā)酵培養(yǎng)基組成進行優(yōu)化，最終得到產(chǎn)瓊膠酶較高的發(fā)酵培養(yǎng)基體系，為該菌株及其瓊膠酶的后期研究、開發(fā)、應(yīng)用提供實驗依據(jù)和基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

弧菌（Vibrio）Y-AG3：國家海產(chǎn)貝類工程技術(shù)研究中心，分離自皺紋盤鮑。

1.1.2 試劑

瓊脂粉、可溶性淀粉、氯化鈉、七水合硫酸鎂、葡萄糖、無水氯化鈣（均為分析純或生化試劑）：上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；酵母膏、酵母浸粉、蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；牛肉浸膏（生化試劑）：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；D-半乳糖（純度≥99.0%）：北京索萊寶生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基[19]：瓊脂粉20 g，NaCl 25 g，NaNO32 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02 g，CaCl20.2 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.5，121 ℃高壓滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基[24]：蛋白胨5 g，酵母粉1 g，磷酸鐵0.01 g，陳海水1 L，pH值7.6，121 ℃高壓滅菌20 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基[19]：瓊脂粉2 g，蛋白胨3 g，酵母膏8 g，NaCl 40 g，MgSO4·7H2O 6 g，CaCl22 g，蒸餾水1 L，pH值9.0，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

AL104分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；L535-1低速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋：上海森信實驗儀器有限公司；GNP-9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱、DHZ-1102大容量恒溫培養(yǎng)振蕩箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；HFsafe1200生物安全柜：上海力申科學(xué)儀器有限公司；UV2800S紫外分光光度計：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；STTIK高壓滅菌鍋：施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液制備

將保存的弧菌Y-AG3接種于活化培養(yǎng)基，30℃、180r/min條件培養(yǎng)24 h。從種子活化平板上挑取單菌落于100 mL種子培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)4～6 h，制得種子液。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)條件

按2%（V/V）的接種量將種子液接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為50 mL/250 mL，于30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)7.5 h，4 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液，用于測定瓊膠酶活力。

1.3.3 瓊膠酶活力測定[19]

D-半乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以D-半乳糖質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制D-半乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。D-半乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.792 1x+0.009 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4。

根據(jù)D-半乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算發(fā)酵液中還原糖的含量。瓊膠酶活力定義：每分鐘生成1 μg還原糖消耗的酶量定義為一個酶活力單位（U）。

1.3.4 弧菌Y-AG3產(chǎn)瓊膠酶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗

以液體發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，通過單因素試驗分別考察NaCl（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%）、MgSO4（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）、酵母膏（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）、瓊脂（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）、蛋白胨（0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%）、CaCl2（0.05%、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%、0.50%）等成分添加量對弧菌Y-AG3產(chǎn)瓊膠酶的影響，確定該菌株的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成。

1.3.5 弧菌Y-AG3產(chǎn)瓊膠酶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化響應(yīng)面試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，確定各因素的最佳配比。然后對6個單因素繼續(xù)進行Plackett-Burman試驗設(shè)計，進而篩選出對菌株產(chǎn)瓊膠酶影響顯著的3個因素。再對3個因素進行最陡爬坡試驗，確定最佳試驗區(qū)域。最后通過Box-Behnken試驗結(jié)果進行回歸方程及響應(yīng)面分析，得到最佳培養(yǎng)基組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 弧菌Y-AG3產(chǎn)瓊膠酶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 不同NaCl含量對弧菌Y-AG3產(chǎn)瓊膠酶的影響

不同NaCl含量對弧菌Y-AG3產(chǎn)瓊膠酶的影響見圖1。由圖1可知，當(dāng)NaCl含量＜2%之前，瓊膠酶活力隨著NaCl含量的增加逐漸升高；當(dāng)NaCl含量為2%時，瓊膠酶活力最高，為44.20 U/mL；當(dāng)NaCl含量＞2%之后，瓊膠酶活力逐漸降低。因此，選定最佳NaCl含量為2%。

圖1 不同NaCl含量對弧菌Y-AG3產(chǎn)瓊膠酶的影響Fig.1 Effect of different NaCl contents on agarase production by Vibrio Y-AG3

2.1.2 不同MgSO4含量對弧菌Y-AG3產(chǎn)瓊膠酶的影響

一定濃度的金屬Mg2+對瓊膠酶的合成具有促進作用[19]，但對不同菌株的作用濃度不同。不同MgSO4含量對弧菌Y-AG3產(chǎn)瓊膠酶的影響見圖2。由圖2可知，當(dāng)MgSO4含量＜0.4%之前，瓊膠酶活力隨著MgSO4含量的增加逐漸升高；當(dāng)MgSO4含量為0.4%時，瓊膠酶活力最高，為42.00 U/mL；當(dāng)MgSO4含量＞0.4%之后，瓊膠酶活力先降低，之后略有升高。因此，確定最佳MgSO4含量為0.4%。

圖2 不同MgSO4含量對弧菌Y-AG3產(chǎn)瓊膠酶的影響Fig.2 Effect of different MgSO4contents on agarase production by Vibrio Y-AG3

2.1.3 不同酵母膏含量對弧菌Y-AG3產(chǎn)瓊膠酶的影響

不同酵母膏含量對弧菌Y-AG3產(chǎn)瓊膠酶的影響見圖3。由圖3可知，當(dāng)酵母膏含量＜0.6%之前，瓊膠酶活力隨酵母膏含量的增加逐漸升高；當(dāng)酵母膏含量為0.6%時，瓊膠酶活力最高，為41.65 U/mL；當(dāng)酵母膏含量＞0.6%之后，瓊膠酶活力逐漸降低。因此，確定最佳酵母膏含量為0.6%。

圖3 不同酵母膏含量對弧菌Y-AG3產(chǎn)瓊膠酶的影響Fig.3 Effect of different yeast extract contents on agarase production by Vibrio Y-AG3

2.1.4 不同瓊脂含量對弧菌Y-AG3產(chǎn)瓊膠酶的影響

不同瓊脂含量對弧菌Y-AG3產(chǎn)瓊膠酶的影響見圖4。由圖4可知，當(dāng)瓊脂含量＜0.5%之前，瓊膠酶活力隨著瓊脂含量的增加逐漸升高；當(dāng)瓊脂含量為0.5%時，瓊膠酶活力最高，為42.46 U/mL；當(dāng)瓊脂含量＞0.5%之后，瓊膠酶活力降低。因此，確定最佳瓊脂含量為0.5%。

圖4 不同瓊脂含量對弧菌Y-AG3產(chǎn)瓊膠酶的影響Fig.4 Effect of different agar contents on agarase production by Vibrio Y-AG3

2.1.5 不同蛋白胨含量對弧菌Y-AG3產(chǎn)瓊膠酶的影響

圖5 不同蛋白胨含量對弧菌Y-AG3產(chǎn)瓊膠酶的影響Fig.5 Effect of different peptone contents on agarase production by Vibrio Y-AG3

不同蛋白胨含量對弧菌Y-AG3產(chǎn)瓊膠酶的影響見圖5。由圖5可知，當(dāng)?shù)鞍纂撕浚?.2%之前，瓊膠酶活力隨蛋白胨含量的增加逐漸升高；當(dāng)?shù)鞍纂撕窟_到0.2%時，瓊膠酶活力最高，為42.24 U/mL；當(dāng)?shù)鞍纂撕浚?.2%之后，瓊膠酶活力逐漸降低。因此，確定最佳蛋白胨含量為0.2%。

2.1.6 不同CaCl2含量對弧菌Y-AG3產(chǎn)瓊膠酶的影響

不同CaCl2含量對弧菌Y-AG3產(chǎn)瓊膠酶的影響見圖6。由圖6可知，當(dāng)CaCl2含量＜0.1%之前，瓊膠酶活力隨CaCl2含量的增加逐漸升高；當(dāng)CaCl2含量為0.1%時，瓊膠酶活力達到最高，為42.24 U/mL；當(dāng)CaCl2含量＞0.1%之后，瓊膠酶活力逐漸降低。因此，確定最佳CaCl2含量為0.1%。

圖6 不同CaCl2含量對弧菌Y-AG3產(chǎn)瓊膠酶的影響Fig.6 Effect of different CaCl2contents on agarase production by Vibrio Y-AG3

2.2 弧菌Y-AG3產(chǎn)瓊膠酶培養(yǎng)基優(yōu)化響應(yīng)面試驗

2.2.1 Plackett-Burman試驗結(jié)果

以瓊膠酶活力（Y）為響應(yīng)值，單因素試驗的最佳值為基礎(chǔ)進行Plackett-Burman試驗，因素與水平見表1，設(shè)計與結(jié)果見表2。

表1 Plackett-Burman試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman tests

利用Design-Expert 8.0.6軟件將表2的數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到回歸方程：Y=39.38+0.63X1+0.84X2+0.16X3+4.52X4-3.02X5+1.48X6，決定系數(shù)R2=0.970 3，校正決定系數(shù)R2adj=0.934 6，表明預(yù)測值與真實值具有較高相關(guān)性。變異系數(shù)（coefficientof variation，CV）值越低表明可靠性越高，本實驗?zāi)Ｐ椭蠧V值=3.94%，表明模型的可信度和精確度較好。對Plackett-Burman試驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表3。

表2 Plackett-Burman試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of Plackett-Burman tests

表3 Plackett-Burman試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of Plackett-Burman tests results

由表3可知，6個因素對響應(yīng)值影響的主次順序為瓊脂＞蛋白胨＞CaCl2＞MgSO4＞NaCl＞酵母膏。其中，瓊脂和蛋白胨影響極顯著（P＜0.01），CaCl2影響顯著（P＜0.05），因此，選定CaCl2（A）、瓊脂（B）、蛋白胨（C）3個因素進行最陡爬坡試驗。

2.2.2 最陡爬坡試驗結(jié)果

由Plackett-Burman試驗得到的回歸方程可以看出，CaCl2含量、瓊脂含量兩個因素對弧菌Y-AG3產(chǎn)瓊膠酶的影響是正向效應(yīng)，而蛋白胨含量是負向效應(yīng)。根據(jù)三個影響因素對響應(yīng)值的正負效應(yīng)，設(shè)計變化方向及區(qū)間進行最陡爬坡試驗，試驗設(shè)計及結(jié)果見表4。

由表4可知，當(dāng)CaCl2含量為0.10%、瓊脂含量為0.50%、蛋白胨含量為0.20%時，瓊膠酶活力達到最高值（51.31 U/mL）。因此，將第3組的因素含量作為Box-Behnken試驗設(shè)計中心點進行進一步優(yōu)化。

表4 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Design and results of steepest ascent tests

2.2.3 Box-Behnken試驗結(jié)果

Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平見表5，結(jié)果與分析見表6。

表5 Box-Behnken試驗因素與水平Table 5 Factors and levels of Box-Behnken tests

表6 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 6 Design and results of Box-behnken tests

采用Design Expert 8.0.6軟件對表6中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到二次回歸方程為Y=49.92-0.27A+1.97B-0.48C+0.89AB+0.78AC+0.11BC-3.72A2-3.14B2-6.00C2。對回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表7。

由表7可知，回歸模型的P值＜0.01，極顯著；失擬項的P值＞0.05，不顯著，說明模型可靠。決定系數(shù)R2=0.925 7，校正決定系數(shù)R2adj=0.830 1，表明回歸方程擬合度較好。CV值=4.34%，表明試驗結(jié)果可信。因此，該模型可以用于弧菌Y-AG3產(chǎn)瓊膠酶發(fā)酵培養(yǎng)基的預(yù)測。此外，一次項B和二次項B2對結(jié)果影響顯著（P＜0.05）；二次項A2、C2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），其他項對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。為求得模型的極大值，根據(jù)回歸方程求一階偏導(dǎo)，得到Y(jié)極大值即最高酶活力值為50.24 U/mL，此時對應(yīng)的培養(yǎng)基組分CaCl2、瓊脂、蛋白胨含量分別為0.10%、0.59%、0.20%。

表7 回歸模型的方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

2.3 最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的驗證

通過上述二次多項回歸模型，利用軟件Design-Expert 8.0.6優(yōu)化培養(yǎng)基組成，獲得最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基：NaCl 2%，CaCl20.1%，瓊脂0.59%，蛋白胨0.2%，MgSO40.4%，酵母膏0.6%。此優(yōu)化條件下酶活力預(yù)測值為50.24 U/mL。采用上述條件進行驗證試驗，最終測得瓊膠酶活力為51.60 U/mL，與預(yù)測值接近，說明優(yōu)化后的回歸方程對預(yù)測菌株的產(chǎn)酶活力具有可靠性。

3 結(jié)論

本研究采用響應(yīng)面設(shè)計的方法對弧菌Y-AG3產(chǎn)瓊膠酶的培養(yǎng)基組成進行優(yōu)化，結(jié)果表明，最優(yōu)培養(yǎng)基組成為NaCl 2%，CaCl20.1%，瓊脂0.59%，蛋白胨0.2%，MgSO40.4%，酵母膏0.6%。在此優(yōu)化條件下，瓊膠酶活力為51.60 U/mL，比優(yōu)化前（44.20 U/mL）提高了16.74%。該菌株可以作為一株具有潛在應(yīng)用價值的高效產(chǎn)瓊膠酶的新菌株進行培養(yǎng)，為實現(xiàn)瓊膠寡糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供新酶源微生物資源，為促進海洋資源的深加工利用發(fā)揮作用。