張先楚，夏 敏，丁朋舉，劉 鉞，李 勇，程天才

（1.南陽師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，河南 南陽 473000；2.河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司，河南 南陽 473000）

生料發(fā)酵就是在發(fā)酵中原料不進(jìn)行高溫蒸煮的過程，微生物直接作用于底物原料進(jìn)行發(fā)酵。在淀粉質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的傳統(tǒng)工藝中，原料需先經(jīng)粉碎、蒸煮、糖化后再發(fā)酵蒸餾出乙醇，其工藝復(fù)雜，耗能大，成本高[1]。生料發(fā)酵與傳統(tǒng)發(fā)酵工藝相比，發(fā)酵條件溫和，節(jié)省了蒸煮過程帶來的能源消耗，從而能夠降低生產(chǎn)成本。近年來，大米產(chǎn)量分配不均衡和庫存的原因造成一些不能食用的陳化大米產(chǎn)生。另外，由于環(huán)境污染，還造成部分大米重金屬超標(biāo)而不能食用[2]。若能大批量用于乙醇生產(chǎn)，無疑是解決國內(nèi)陳化大米積壓和重金屬超標(biāo)大米處理的重要途徑。

大米發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的原理是利用其富含的淀粉，通過各種酶的作用，將淀粉分解為可發(fā)酵性糖，然后經(jīng)過酵母的發(fā)酵作用，將可發(fā)酵性糖轉(zhuǎn)化成乙醇，同其他的淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)乙醇的原理基本相同[3-4]。隨著酶工程的發(fā)展，我國的生料發(fā)酵研究應(yīng)用發(fā)展迅速。魯佰成等[5]通過大米-木薯混合發(fā)酵工藝的研究得出，大米-木薯發(fā)酵中大米的添加比例為25%時(shí)，發(fā)酵酒精度能達(dá)到15%vol以上。李媛媛等[6]探究了不同酵母的大米生料釀造特性后得出，不同酵母菌株的釀造特性差異較大，使用篩選出的酵母，出酒率（乙醇）高達(dá)41.31%。李聚森等[7]使用生料釀酒直投復(fù)合菌制劑，以生大米為原料，對(duì)發(fā)酵釀酒過程中的發(fā)酵特性指標(biāo)的變化規(guī)律進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，使用此方法，大米原料發(fā)酵徹底、利用率高，為解決擴(kuò)大生產(chǎn)中可能存在的問題提供了理論依據(jù)。

本試驗(yàn)以大米為原料，以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）1300為發(fā)酵菌株，生料發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。本研究主要對(duì)α-淀粉酶、糖化酶、酸性蛋白酶的用量以及原料顆粒度、料水比、酵母液接種量、氮源添加量對(duì)發(fā)酵的影響進(jìn)行探討，優(yōu)化大米生料發(fā)酵的工藝條件，提高發(fā)酵后的乙醇濃度，為大米淀粉質(zhì)原料生料發(fā)酵的高效、節(jié)能、降耗新工藝提供技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌株

大米（淀粉含量74.8%）：河南天冠集團(tuán)乙醇廠粉碎車間；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）1300：河南天冠集團(tuán)燃料乙醇廠培菌室。

1.1.2 化學(xué)試劑

氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉（均為分析純）：北京生東科技有限公司；α-淀粉酶（酶活2.0×103U/g）、糖化酶（酶活1.0×105U/g）、酸性蛋白酶（酶活5.0×104U/g）：肇東國科北方酶制劑有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

WF-20B萬能粉碎機(jī)：廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司；S49-600分樣篩：新鄉(xiāng)市高服機(jī)械股份有限公司；DK-S28型電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；ME3002E型電子天平：梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；Agilent 1200型液相色譜：安捷倫科技發(fā)展有限公司；SC202型恒溫培養(yǎng)箱：浙江省嘉興新睦電熱儀器廠；MLS-3020型全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋：北京艾飛博科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大米生料發(fā)酵產(chǎn)乙醇工藝流程及操作要點(diǎn)[9]

操作要點(diǎn)：

原料：以大米作為原料，經(jīng)篩選，去除雜物。

粉碎：使用萬能粉碎機(jī)對(duì)大米原料進(jìn)行粉碎，將大米原料粉碎至均勻的粉末狀后，使用分樣篩篩分出需要的顆粒度。

調(diào)漿：稱取一定量的大米粉，按照一定的比例加水配制成發(fā)酵液，調(diào)節(jié)pH值至4.3～4.6，另外添加硫酸銨作為氮源，添加青霉素作為抑菌劑，添加量為1.2 U/（mL醪液）。

加酶：添加α-淀粉酶、糖化酶、酸性蛋白酶對(duì)淀粉原料進(jìn)行酶解糖化。

釀酒酵母的活化[8]：取糖度為25°Bx的葡萄糖溶液于500 mL三角瓶中，100 ℃滅菌90 min，冷卻備用。將釀酒酵母1300接種于裝有10 mL 12°Bx麥芽汁液體的試管中，放入30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，然后全部轉(zhuǎn)接到三角瓶中的培養(yǎng)基里，添加0.1%尿素。置于30 ℃、160 r/min的恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)16 h。

接種：將培養(yǎng)好的酵母活化液接種至發(fā)酵液中。

發(fā)酵：混合均勻后置于恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，發(fā)酵溫度30 ℃，通氣培養(yǎng)6 h進(jìn)行菌種擴(kuò)培，隨后塞上發(fā)酵栓進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過程中間歇振蕩，發(fā)酵過程持續(xù)96 h后測(cè)定發(fā)酵液的乙醇含量和總糖含量。

1.3.2 分析檢測(cè)

總糖含量的測(cè)定：采用酸水解法[10]，水解后用DNS比色法測(cè)定還原糖的含量。

乙醇體積分?jǐn)?shù)的測(cè)定：采用高效液相色譜法[11]。色譜條件如下：采用安捷倫1200型色譜儀，流動(dòng)相：0.005 mol/L H2SO4；伯樂HPX-87H色譜柱（300 mm×7.8 mm），泵流速：0.6 mL/min，柱溫：65 ℃，示差折光檢測(cè)器（refractive index detector，RID）溫度：50 ℃；進(jìn)樣量15 μL，運(yùn)行時(shí)間30 min。

1.3.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取大米生料發(fā)酵過程中的關(guān)鍵因素原料顆粒度（10目、20目、30目、40目、50目）、料水比（1∶2.0、1∶2.5、1∶3.0、1∶3.5、1∶4.0（g∶mL））、淀粉酶添加量（0、5 U/g、10 U/g、15 U/g、20 U/g）、糖化酶添加量（50 U/g、100 U/g、150 U/g、200 U/g、250 U/g）、酸性蛋白酶添加量（10 U/g、20 U/g、30 U/g、40 U/g、50 U/g）、酵母活化液接種量（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）、硫酸銨添加量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察以上因素單獨(dú)變化時(shí)對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的影響。

1.3.4 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取4個(gè)對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響最大的因素顆粒度（A）、料水比（B）、酵母接種量（C）、硫酸銨用量（D）進(jìn)行4因素3水平的L9（34）正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation process optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 原料顆粒度對(duì)大米生料發(fā)酵的影響

分別取10目、20目、30目、40目、50目的大米粉，在料水比為1∶3.0（g∶mL），發(fā)酵pH值為4.5，α-淀粉酶添加量為10 U/g、糖化酶添加量為200 U/g、酸性蛋白酶添加量為30 U/g，酵母活化液添加量為0.8%，硫酸銨加入量為1.0%的條件下，發(fā)酵96 h后測(cè)定乙醇含量、總糖含量，比較不同的原料顆粒度對(duì)發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 不同的顆粒度對(duì)產(chǎn)乙醇的影響Fig.1 Effect of different granularity on ethanol production

由圖1可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)隨粉碎粒度在10～50目范圍內(nèi)的增大而升高，總糖含量隨粉碎粒度目數(shù)的增大而降低。物料粉碎越細(xì)，越有利于淀粉水解酶與物料的充分接觸和作用，反應(yīng)更加充分[12]。而且淀粉顆粒小，加入水后容易形成懸浮液，糖化酶和酵母會(huì)更加均勻的分布其中，有利于發(fā)酵的順利進(jìn)行[13]。但是淀粉顆粒粉碎到一定細(xì)度后，進(jìn)一步細(xì)化消耗的能源將會(huì)呈幾何級(jí)增長(zhǎng)，因此并不是顆粒越小越好。因此，選擇40目作為適宜的原料顆粒度。

2.2 料水比對(duì)大米生料發(fā)酵的影響

在大米粉顆粒度為40目，料水比分別為1∶2.0、1∶2.5、1∶3.0、1∶3.5、1∶4.0（g∶mL），發(fā)酵pH值為4.5，α-淀粉酶添加量為10 U/g、糖化酶添加量為200 U/g、酸性蛋白酶添加量為30 U/g，酵母活化液添加量為0.8%，硫酸銨加入量為1.0%的條件下，發(fā)酵96 h后測(cè)定乙醇含量、總糖含量，比較不同的料水比對(duì)發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同的料水比對(duì)產(chǎn)乙醇的影響Fig.2 Effect of different material to liquid on ethanol production

由圖2可知，隨著料水比在1∶2.0～1∶4.0（g∶mL）范圍內(nèi)的逐漸減小，乙醇體積分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)先增大后緩慢降低的變化趨勢(shì)，總糖含量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。這是因?yàn)楫?dāng)料水比比較低時(shí)，加水量較少，料液比較稠，物料流動(dòng)性差，酶和菌種不能與物料充分接觸反應(yīng)，原料不能徹底糖化和發(fā)酵，并且底物中較高的糖及乙醇含量會(huì)抑制酵母的生長(zhǎng)活動(dòng)，造成發(fā)酵結(jié)束后乙醇體積分?jǐn)?shù)較低[14-15]。隨著料水比的增大，料液逐漸變稀，料液比達(dá)到1∶3.5（g∶mL）時(shí)，乙醇含量達(dá)到最大。隨著料液比的進(jìn)一步增加，造成發(fā)酵液過稀，這時(shí)容易產(chǎn)生原料沉積，造成乙醇體積分?jǐn)?shù)降低。因此，選擇1∶3.0（g∶mL）作為適宜料水比。

2.3 α-淀粉酶添加量對(duì)大米生料發(fā)酵的影響

在大米粉顆粒度為40 目，料水比為1∶3.0（g∶mL），發(fā)酵pH值為4.5，α-淀粉酶添加量分別為0、5 U/g、10 U/g、15 U/g、20U/g，糖化酶添加量為200U/g，酸性蛋白酶添加量為30U/g，酵母活化液添加量為0.8%，硫酸銨加入量為1.0%的條件下，發(fā)酵96 h后測(cè)定乙醇含量、總糖含量，比較不同的α-淀粉酶用量對(duì)發(fā)酵的影響。

圖3 不同的α-淀粉酶添加量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響Fig.3 Effect of different α-amylase addition on ethanol production

由圖3可知，隨著α-淀粉酶添加量在0～10 U/g的范圍內(nèi)增加，乙醇體積分?jǐn)?shù)迅速提高。當(dāng)α-淀粉酶添加量達(dá)到10 U/g后，隨著添加量的增加，乙醇含量和總糖含量變化趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)棣?淀粉酶可隨機(jī)將淀粉原料酶解成糊精和部分麥芽糖以及葡萄糖，將淀粉液化。α-淀粉酶添加量達(dá)到10 U/g后，淀粉的液化程度已達(dá)到最大。因此，選擇10 U/g為適宜的α-淀粉酶添加量。

2.4 糖化酶添加量對(duì)大米生料發(fā)酵的影響

在大米粉顆粒度為40 目，料水比為1∶3.0（g∶mL），發(fā)酵pH值為4.5，α-淀粉酶添加量為10 U/g，糖化酶添加量分別為50 U/g、100 U/g、150 U/g、200 U/g、250 U/g，酸性蛋白酶添加量為30 U/g，酵母活化液添加量為0.8%，硫酸銨加入量為1.0%的條件下，發(fā)酵96 h后測(cè)定乙醇含量、總糖含量，比較不同的糖化酶添加量對(duì)發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 不同的糖化酶添加量對(duì)產(chǎn)乙醇的影響Fig.4 Effect of different saccharifying enzyme addition on ethanol production

由圖4可知，隨著糖化酶添加量在50～150 U/g范圍內(nèi)的增加，乙醇含量也逐漸增大，糖化酶添加量達(dá)到200 U/g后，隨著糖化酶用量的增加，乙醇含量的變化不大。通過添加適量的糖化酶，可使糖化和發(fā)酵的速度同步[16]。發(fā)酵醪中還原糖的含量始終處于較低水平，從而抑制雜菌生長(zhǎng)，提高發(fā)酵醪的乙醇含量[17]。合適的加酶量可以使發(fā)酵液的黏度下降增加，從而對(duì)發(fā)酵起到促進(jìn)作用，使得乙醇產(chǎn)率達(dá)到較高的水平。因此，選擇200 U/g作為適宜的糖化酶添加量。

2.5 酸性蛋白酶添加量對(duì)大米生料發(fā)酵的影響

在大米粉顆粒度為40 目，料水比為1∶3.0（g∶mL），發(fā)酵pH值為4.5，α-淀粉酶添加量為10 U/g，糖化酶添加量為200 U/g，酸性蛋白酶添加量為10 U/g、20 U/g、30 U/g、40 U/g、50 U/g，酵母活化液添加量為0.8%，硫酸銨加入量為1.0%的條件下，發(fā)酵96 h后測(cè)定乙醇含量、總糖含量，比較不同的酸性蛋白酶用量對(duì)發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 不同的酸性蛋白酶添加量對(duì)產(chǎn)乙醇的影響Fig.5 Effect of different acid protease addition on ethanol production

由圖5可知，隨著酸性蛋白酶添加量在10～50 U/g范圍內(nèi)的增加，對(duì)發(fā)酵有一定的促進(jìn)作用[18]。這是因?yàn)樵诎l(fā)酵過程中加入酸性蛋白酶，可讓大米粉中內(nèi)含的蛋白質(zhì)在酶的作用下分解為酵母可利用的氮源。當(dāng)酸性蛋白酶的添加量由10 U/g增加到30 U/g，發(fā)酵后的乙醇含量有明顯的增加。當(dāng)添加量＞30 U/g之后，發(fā)酵后的乙醇含量基本維持不變，對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響不再明顯。說明酸性蛋白酶的添加量達(dá)到30 U/g后，大米粉中的蛋白質(zhì)在酸性蛋白酶的作用下，已達(dá)到最大程度的分解。因此，選擇酸性蛋白酶的添加量為30 U/g。

2.6 酵母接種量對(duì)大米生料發(fā)酵的影響

在大米粉顆粒度為40目，料水比為1∶3.0（g∶mL），發(fā)酵pH值為4.5，α-淀粉酶添加量為10 U/g，糖化酶添加量為200 U/g，酸性蛋白酶添加量為30 U/g，酵母活化液接種量為0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%，硫酸銨加入量為1.0%的條件下，發(fā)酵96 h后測(cè)定乙醇含量、總糖含量，比較不同的酵母接種量對(duì)發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，隨著酵母接種量在0.4%～0.8%范圍內(nèi)的增加，乙醇含量增加，當(dāng)酵母接種量＞0.8%之后，隨著接種量的增加，乙醇含量呈現(xiàn)了下降的趨勢(shì)。這是因?yàn)?，生料工藝發(fā)酵過程還原糖的濃度始終處于較低水平，在此環(huán)境下，酵母一直處于激發(fā)狀態(tài)，活力較高，若酵母數(shù)量過少，可能出現(xiàn)染菌現(xiàn)象，且發(fā)酵不徹底，造成乙醇濃度較低[19]；若酵母數(shù)量過多，其生長(zhǎng)和繁殖所消耗的還原糖也越多，造成酵母因營(yíng)養(yǎng)不足而過早衰老，造成乙醇含量隨著酵母量的增加而降低[20]。因此，選擇0.8%為酵母液的適宜接種量。

圖6 不同的接種量對(duì)產(chǎn)乙醇的影響Fig.6 Effect of different inoculums on ethanol production

2.7 硫酸銨添加量對(duì)發(fā)酵的影響

在大米粉顆粒度為40目，料水比為1∶3.0（g∶mL），發(fā)酵pH值為4.5，α-淀粉酶添加量為10 U/g，糖化酶添加量為200 U/g，酸性蛋白酶添加量為30 U/g，酵母活化液添加量為0.8%，氮源硫酸銨加入量分別為0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%的條件下，發(fā)酵96 h后測(cè)定乙醇含量、總糖含量，比較不同的硫酸銨對(duì)發(fā)酵的影響。

圖7 不同的硫酸銨添加量對(duì)產(chǎn)乙醇的影響Fig.7 Effect of different (NH4)2SO4addition on ethanol production

由圖7可知，隨著硫酸銨添加量在0.4%～0.8%范圍內(nèi)的增加，乙醇含量呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)；當(dāng)硫酸銨添加量＞0.8%之后，隨著硫酸銨添加量的增加，乙醇含量又逐漸下降。這是因?yàn)椋习l(fā)酵工藝沒有蒸煮過程，含氮物質(zhì)往往以大分子蛋白質(zhì)的狀態(tài)存在，而酵母只能吸收氨基態(tài)氮，所以可能會(huì)出現(xiàn)氮源不足的情況，從而影響發(fā)酵[21-22]。但是當(dāng)硫酸銨的添加量過多，會(huì)造成酵母菌過早衰老自溶，縮短產(chǎn)物分泌期，造成乙醇含量降低[23]。因此，選擇硫酸銨的添加量為0.8%。

2.8 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，比較不同因素對(duì)發(fā)酵過程的影響程度，確定了單因素原料顆粒度（A）、料水比（B）、酵母接種量（C）、硫酸銨添加量（D）這四個(gè)對(duì)乙醇含量影響比較大的因素進(jìn)行4因素3水平的L9（34）正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2。

表2 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation process optimization

由表2可知，影響大米生料發(fā)酵的主次因素是顆粒度＞料水比＞硫酸銨添加量＞接種量。最佳發(fā)酵工藝組合為A3B2C3D1，即顆粒度為50 目，料水比為1∶3.0（g∶mL），接種量為1.0%，硫酸銨添加量為0.8%。在此最佳條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，乙醇含量平均值為10.89%。

通過正交分析，酵母接種量的極差最小。因此將酵母接種量作為誤差列進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表3方差分析可知，原料顆粒度和料水比對(duì)乙醇含量的影響顯著（P＜0.05），接種量與硫酸銨添加量對(duì)發(fā)酵結(jié)束后乙醇含量的影響不顯著（P＞0.05），這表明在各個(gè)因素所考察的范圍內(nèi)，原料顆粒度和料液比是一個(gè)重要因素。

3 結(jié)論

通過對(duì)大米生料發(fā)酵的結(jié)果進(jìn)行比較，并對(duì)影響發(fā)酵的因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)可知，大米生料發(fā)酵的最佳工藝條件為：原料顆粒度50目，料水比1∶3.0（g∶mL），α-淀粉酶添加量10 U/g，糖化酶添加量200 U/g，酸性蛋白酶添加量30 U/g，酵母液接種量1.0%，硫酸銨添加量0.8%。在此優(yōu)化工藝條件下，乙醇含量可達(dá)到10.89%。本試驗(yàn)優(yōu)化出的工藝是一種簡(jiǎn)便有效的大米生料發(fā)酵產(chǎn)乙醇的方法，優(yōu)化出的工藝可為大米的大規(guī)模生料發(fā)酵提供試驗(yàn)參考，并且對(duì)乙醇的工業(yè)化生產(chǎn)及發(fā)展有積極的促進(jìn)作用。