劉 安，趙 華，張朝正

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室天津市微生物代謝與發(fā)酵過(guò)程控制技術(shù)工程中心，天津 300457）

尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）是一種既可侵染植物又可在土壤內(nèi)生存的兼性寄生真菌，是一種可引起植物枯萎病的世界性土傳真菌病害[1]。該菌侵染寄主維管束系統(tǒng)，并在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生毒素危害作物，造成作物萎蔫死亡，最終在死亡組織表面產(chǎn)生大量孢子，進(jìn)一步擴(kuò)散到其他部位或其他植株[2]。尖孢鐮刀菌可引起100多種植物發(fā)生枯萎病，給作物生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重的損失，國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的受害作物有棉花、甘蔗、香蕉、番茄、黃瓜、西瓜、大豆等[3-4]。因此，尋找合適的防治措施成為治理枯萎病的重中之重。

目前防治植物枯萎病的主要方法是化學(xué)防治、物理防治、生物防治和利用農(nóng)業(yè)措施（如作物嫁接[5-6]、合理輪作[7]和培育抗病品種等）。利用化學(xué)方法會(huì)產(chǎn)生大量農(nóng)藥殘留并造成環(huán)境嚴(yán)重污染；培育抗病品種周期長(zhǎng)，員工培訓(xùn)困難，資源耗費(fèi)高[8]。因此以生物防治為主導(dǎo)的綜合防治措施的研究，對(duì)植物枯萎病防治具有非常重要的意義。

用于植物枯萎病的生防菌株主要分為三大類：生防細(xì)菌、生防真菌和生防放線菌。生防細(xì)菌主要有假單胞菌（Pseudomonas）[9]和芽孢桿菌（Bacillus）[10]等；生防真菌主要有木霉（Trichodermaspp.）[11]等；生防放線菌主要有鏈霉菌（Streptomycetaceae）[12]等。其中貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）作為一種新型菌種，在2008年被確定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的后期異型體[13]。LIM S M等[14]篩選出一株對(duì)多種病原菌有較強(qiáng)的抑制作用的B.velezensisG341。孫平平等[15]篩選出一株對(duì)梨灰霉和青霉病菌具有很好拮抗作用的B.velezensis，其具有分布廣、易培養(yǎng)、生長(zhǎng)速度快、穩(wěn)定性好、易分離、難失活、無(wú)毒無(wú)害、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)。其代謝產(chǎn)物種類多、抗菌活性強(qiáng)、不易受外界環(huán)境影響。因此對(duì)菌株和其代謝產(chǎn)物的性質(zhì)及應(yīng)用的研究也越來(lái)越多。

B.velezensis可通過(guò)分泌多種酶（如角蛋白酶、β-葡聚糖酶[16]、纖維素酶、蛋白酶[17]等）進(jìn)行抑菌。對(duì)提高農(nóng)作物產(chǎn)量、保護(hù)生態(tài)環(huán)境和維持農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的平衡具有重要意義。與普通生防芽孢桿菌相似，B.velezensis的生防機(jī)制主要是競(jìng)爭(zhēng)作用、拮抗作用、溶菌作用和誘導(dǎo)植物抗性機(jī)制等[18]。作為生物防治菌株，B.velezensis具有分泌某些膠原蛋白類物質(zhì)的能力，這為生防菌株在植物根際定殖能力提供極其重要的基礎(chǔ)；在植物促進(jìn)生長(zhǎng)方面，B.velezensis除能分泌大量的細(xì)胞分裂素促進(jìn)植物生長(zhǎng)外，也能分泌一些揮發(fā)性化合物調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)素的穩(wěn)定性，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對(duì)植株生長(zhǎng)的促進(jìn)作用[19]。

前期工作中篩選到1株對(duì)尖孢鐮刀菌有較強(qiáng)拮抗作用的菌株，鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）[20]。本研究以貝萊斯芽孢桿菌P9為研究對(duì)象，利用有機(jī)溶劑萃取、酸沉淀法及薄層層析（thin layer chromatography，TLC）法對(duì)其抗菌物質(zhì)提取及化學(xué)成分分析，并考察其穩(wěn)定性，為菌株P(guān)9防治植物枯萎病的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）P9：天津科技大學(xué)工業(yè)發(fā)酵微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）：天津科技大學(xué)菌種保藏中心。

1.1.2 化學(xué)試劑

（NH4）2SO4（分析純）：天津子涵生物科技有限公司；冰乙酸、KH2PO4、MgSO4·7H2O（均為分析純）：天津市化學(xué)試劑一廠；K2HPO4、水合茚三酮（均為分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；CaCl2（分析純）、剛果紅（生物染料）：天津鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；羧甲基纖維素鈉（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；β-葡聚糖（分析純）：北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司；氯仿（分析純）：天津索羅門生物科技有限公司；乙酸乙酯（分析純）：天津一方科技有限公司；二氯甲烷（分析純）：北京華威銳科化工有限公司；幾丁質(zhì)（分析純）：天津泰進(jìn)科技有限公司；甲醇（分析純）：天津艾利安電子科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：酵母浸粉5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、氯化鈉10.0g/L，pH=7.0，固體時(shí)添加瓊脂20.0g/L，121℃滅菌20min。

淀粉培養(yǎng)基：可溶性淀粉10.0 g/L、牛肉膏3.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、NaCl 5.0 g/L、瓊脂20.0 g/L，pH=7.2，115 ℃滅菌20min。

β-葡聚糖酶選擇培養(yǎng)基：β-葡聚糖1.0g/L，剛果紅0.4g/L，蛋白胨10.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，CaCl20.4 g/L，瓊脂20.0 g/L，pH=7.0，121 ℃滅菌20 min。

羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose-Na，CMC-Na）培養(yǎng)基：CMC-Na10.0g/L、（NH4）2SO44.0g/L、酵母浸粉5.0g/L、K2HPO42.0 g/L、剛果紅0.4 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH=7.6，121 ℃滅菌20 min。

脫脂奶粉培養(yǎng)基：牛肉膏1.0 g/L、蛋白胨2.0 g/L、氯化鈉1.0 g/L、脫脂奶粉20.0 g/L、瓊脂20.0 g/L，pH=7.0，其中脫脂奶粉單獨(dú)溶解并在100 ℃水浴30 min滅菌，其余成分121 ℃滅菌20 min，混勻后倒平板。

幾丁質(zhì)培養(yǎng)基：膠狀幾丁質(zhì)15.0 g/L、酵母浸粉3.0 g/L、（NH4）2SO41.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.3 g/L、KH2PO41.4 g/L，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

H1815高速離心機(jī)：湘儀離心儀器有限公司；HPX-9162 MBE電熱恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Lab-1D-50真空冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SY.45-NJB牛津杯（Φ6 mm×8 mm×10 mm）：北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株產(chǎn)酶分析

將LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h的菌株P(guān)9接種于淀粉培養(yǎng)基、β-葡聚糖酶選擇培養(yǎng)基、CMC-Na培養(yǎng)基、脫脂奶粉培養(yǎng)基和幾丁質(zhì)培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基重復(fù)接種3次，30 ℃倒置培養(yǎng)4～5 d后觀察菌落周圍是否有透明圈出現(xiàn)。

1.3.2 抑菌物質(zhì)提取預(yù)處理

將菌株P(guān)9接種于LB培養(yǎng)基，30 ℃、160 r/min搖瓶培養(yǎng)72 h，收集發(fā)酵液于4 ℃、10 000 r/min離心15 min除去菌體，收集上清液備用。

1.3.3 有機(jī)溶劑萃取

采用有機(jī)溶劑萃取法提取抑菌物質(zhì)[21]，萃取劑分別選用氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷。取50 mL氯仿緩慢加入50 mL發(fā)酵上清液中，充分混勻后靜置，分別收集有機(jī)相和水相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀分別濃縮至5 mL，經(jīng)微生物濾膜（Φ=0.22 μm）過(guò)濾除菌體，分別選用對(duì)應(yīng)有機(jī)溶劑和水作為對(duì)照，采用牛津杯法[22]測(cè)定各組分對(duì)尖孢鐮刀菌的拮抗作用，使用卡尺選擇十字交叉法[23]測(cè)定抑菌圈直徑。采用相同的方法測(cè)定乙酸乙酯、二氯甲烷作為有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取時(shí)收集的各組分對(duì)尖孢鐮刀菌的拮抗作用。

1.3.4 酸沉淀法提取

采用酸沉淀法[24-25]提取抑菌物質(zhì)，取50 mL發(fā)酵上清液，使用6 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH=2.0，于4 ℃冰箱靜置過(guò)夜，4 ℃、12 000 r/min離心10 min收集沉淀。使用甲醇（pH=7）進(jìn)行抽提，4 ℃、12 000 r/min 條件下離心10 min，收集上清甲醇抽提液及沉淀，然后沉淀再次用甲醇進(jìn)行抽提、離心，重復(fù)上述步驟3次，合并所有甲醇提取液，用2 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH=7.0，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后真空冷凍干燥抽提物，然后加入甲醇溶解并再次冷凍干燥，獲得抑菌物質(zhì)粗提物。最后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）（pH=7.0）溶解，經(jīng)微生物濾膜（Φ=0.22 μm）過(guò)濾除菌體后，采用牛津杯法測(cè)定粗提物對(duì)尖孢鐮刀菌的拮抗作用。

1.3.5 酸沉淀實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

（1）酸沉淀法提取時(shí)pH值的優(yōu)化

取發(fā)酵上清液，用6 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH值分別為1.5、2.0、3.0、4.0、5.0，按照上述步驟進(jìn)行提取。將所得的抽提物用甲醇溶解并再次冷凍干燥，最后加入PBS溶液（pH=7.0）溶解，經(jīng)微生物濾膜（Φ=0.22 μm）過(guò)濾除菌體，采用牛津杯法測(cè)定粗提物對(duì)尖孢鐮刀菌的拮抗作用。

（2）溶解液配比的優(yōu)化

按照上述酸沉淀方法，分別取固體抽提物，按照表1中甲醇與PBS（pH=7.0）的配比，將所得的固體溶解并經(jīng)微生物濾膜（Φ=0.22 μm）過(guò)濾除菌體，采用牛津杯法測(cè)定粗提物對(duì)尖孢鐮刀菌的拮抗作用。

表1 甲醇與磷酸鹽溶液的體積比Table 1 Volume ratio of methanol to phosphate buffer

1.3.6 抑菌物質(zhì)分析

采用薄層層析（thin-layer chromatography，TLC）法分析抑菌物質(zhì)。

（1）取用a、b、c 三個(gè)薄層層析硅膠板，將具有拮抗活性的發(fā)酵液粗提物用甲醇溶解，在距離薄層層析硅膠板底部1 cm處進(jìn)行點(diǎn)樣。

（2）展開(kāi)劑的配制，展開(kāi)劑各成分配比為氯仿∶甲醇∶冰乙酸∶水=65∶30∶4∶4（V/V）。

（3）將展開(kāi)劑置入層析缸中，取b、c板放入層析缸中進(jìn)行展開(kāi)。

（4）待層析板c干燥后，放置于存有濃鹽酸的密封水解瓶中進(jìn)行原位酸水解（110 ℃，90 min）。

（5）均勻噴灑0.5%茚三酮溶液于a、b、c各板，于110 ℃烘箱加熱20 min，觀察顯色情況。

1.3.7 抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性分析

（1）溫度穩(wěn)定性分析

將抑菌物質(zhì)粗提液經(jīng)4 ℃、25 ℃、50 ℃、75 ℃、100 ℃、120 ℃處理30 min后，采用牛津杯法進(jìn)行抑菌活性的測(cè)定，觀察溫度對(duì)抑菌物質(zhì)粗提液穩(wěn)定性的影響。

（2）金屬離子穩(wěn)定性分析

分別向抑菌物質(zhì)粗提液中添加1 mol/L的Mg2+、Mn2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Ca2+，每1 mL抑菌物質(zhì)粗提液添加100 μL金屬離子溶液，選用不添加金屬離子的粗提液為對(duì)照。采用牛津杯法進(jìn)行抑菌活性的測(cè)定，觀察金屬離子對(duì)抑菌物質(zhì)粗提液穩(wěn)定性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株產(chǎn)酶分析

菌株P(guān)9在各培養(yǎng)基中產(chǎn)生透明圈的結(jié)果如圖1所示。

圖1 貝萊斯芽孢桿菌P9在不同培養(yǎng)基上的產(chǎn)酶分析Fig.1 Analysis of enzyme production of Bacillus velezensis P9 on different medium

由圖1可知，菌株P(guān)9在CMC-Na培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基、脫脂牛奶培養(yǎng)基及β-葡聚糖酶選擇培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)且均有透明圈產(chǎn)生，但在幾丁質(zhì)培養(yǎng)基上未生長(zhǎng)。結(jié)果表明，該菌株能分泌纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶及β-葡聚糖酶等酶，但不能分泌幾丁質(zhì)酶。并且從圖1可以看出，菌株在脫脂奶粉培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最旺盛，在淀粉培養(yǎng)基上次之，在β-葡聚糖酶選擇培養(yǎng)基及CMC-Na培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，表明菌株P(guān)9不適宜在后兩者培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。

2.2 抑菌物質(zhì)提取條件分析

2.2.1 有機(jī)溶劑萃取

分別選用氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷作為有機(jī)相提取抑菌物質(zhì)。取50 mL氯仿緩慢加入50 mL發(fā)酵上清液中，充分混勻后靜置，分別收集有機(jī)相和水相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀分別濃縮至5 mL，經(jīng)微生物濾膜（Φ=0.22 μm）過(guò)濾除菌體，分別選用對(duì)應(yīng)有機(jī)溶劑和水作為對(duì)照，采用牛津杯法測(cè)定各組分對(duì)尖孢鐮刀菌的拮抗作用，然后用相同的方法測(cè)定乙酸乙酯、二氯甲烷作為有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取時(shí)收集的各組分對(duì)尖孢鐮刀菌的拮抗作用，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同有機(jī)相萃取物質(zhì)的抑菌效果Fig.2 Antibacterial effect of extract extracted by different organic phases

由圖2可知，抑菌物質(zhì)可以通過(guò)萃取的方式從發(fā)酵上清液中提取出來(lái)，但是有抑菌效果的部分為有機(jī)相萃取液，對(duì)照組均無(wú)抑菌圈產(chǎn)生，其中使用氯仿作為萃取劑時(shí)所提取出的抑菌物質(zhì)最多，其抑菌圈直徑可達(dá)9.9 mm。

2.2.2 酸沉淀法提取

取50 mL發(fā)酵上清液，用6 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值至2.0，于4 ℃冰箱靜置過(guò)夜，4 ℃、12 000 r/min離心10 min收集沉淀，使用甲醇（pH=7）進(jìn)行抽提，重復(fù)上述步驟3次，合并所有甲醇提取液，用2 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH=7.0，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后真空冷凍干燥抽提物，然后加入甲醇溶解再次冷凍干燥，獲得抑菌物質(zhì)粗提物。最后用PBS（pH=7.0）溶解，經(jīng)微生物濾膜（Φ=0.22 μm）過(guò)濾除菌體后，采用牛津杯法測(cè)定粗提物對(duì)尖孢鐮刀菌的拮抗作用，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 酸沉淀法提取的抑菌物質(zhì)的抑菌效果Fig.3 Antibacterial effect of bacteriostatic substances extracted by acid precipitation

由圖3可知，使用酸沉淀的方法可以提取出發(fā)酵上清液中的抑菌物質(zhì)，通過(guò)測(cè)量，其抑菌圈直徑約為13.8 mm。同時(shí)對(duì)比上述提取方法可知，通過(guò)酸沉淀方法提取出的抑菌物質(zhì)最多，表現(xiàn)為抑菌試驗(yàn)中抑菌圈直徑最大，因此選擇酸沉淀法對(duì)貝萊斯芽孢桿菌P9發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)進(jìn)行提取。

2.3 酸沉淀法提取條件的優(yōu)化

2.3.1 pH值的優(yōu)化

圖4 不同pH值提取的抑菌物質(zhì)的抑菌效果Fig.4 Antibacterial effect of bacteriostatic substances extracted under different pH conditions

取發(fā)酵上清液，用6 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH值分別為1.5、2.0、3.0、4.0、5.0，按照1.3.4步驟進(jìn)行提取。將所得的真空冷凍干燥抽提物用PBS溶解，經(jīng)微生物濾膜（Φ=0.22 μm）過(guò)濾除菌體，采用牛津杯法測(cè)定各組分對(duì)尖孢鐮刀菌的拮抗作用。各pH值下提取的抑菌物質(zhì)的抑菌效果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，當(dāng)pH值＜2.0時(shí)，酸沉淀提取的抑菌物質(zhì)產(chǎn)生的抑菌圈直徑大小幾乎相同，當(dāng)pH值＞2.0時(shí)，抑菌圈直徑迅速縮小，由此可知，當(dāng)pH值＞2.0時(shí)，酸沉淀提取的抑菌物質(zhì)迅速減少，因此實(shí)驗(yàn)中采用酸沉淀法提取抑菌物質(zhì)時(shí)用6 mol/L的鹽酸調(diào)整pH值為2.0左右。

2.3.2 溶解液配比優(yōu)化

按照1.3.4的酸沉淀方法，提取固體抽提物兩份，按照表1中甲醇與PBS的配比，將所得的固體溶解并經(jīng)微生物濾膜（Φ=0.22 μm）過(guò)濾除菌體，采用牛津杯法測(cè)定各組分對(duì)尖孢鐮刀菌的拮抗作用。不同配比的溶解液得到的抑菌物質(zhì)的抑菌效果見(jiàn)圖5。

圖5 溶劑比對(duì)抑菌物質(zhì)的抑菌效果的影響Fig.5 Effect of solvent ratio on antibacterial effect of bacteriostatic substances

由于經(jīng)過(guò)濃縮成固體的抑菌物質(zhì)粗提物極易溶于甲醇，而只采用甲醇進(jìn)行溶解時(shí)，由于甲醇易揮發(fā)且抑制了抑菌物質(zhì)的活性，使得抑菌物質(zhì)并不能發(fā)揮到最好的抑菌效果，因此選擇添加PBS，目的是為抑菌物質(zhì)提供了緩沖環(huán)境，提高了抑菌活性。由圖5可知，隨著甲醇含量的減少，抑菌圈的直徑逐漸增加，表明更多的抑菌物質(zhì)發(fā)揮了作用，當(dāng)甲醇∶PBS=1∶3（V/V）時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到最大，為14.3 mm。因此，選用甲醇∶PBS=1∶3（V/V）。

2.4 薄層色譜法分析抑菌物質(zhì)

菌株P(guān)9的抑菌物質(zhì)粗提物的層析分析結(jié)果如圖6所示。

對(duì)a板采取只點(diǎn)樣不展開(kāi)的方法，對(duì)b、c板使用展開(kāi)劑進(jìn)行展開(kāi)，只對(duì)c板進(jìn)行原位酸水解，最后對(duì)a、b、c板均勻噴灑茚三酮溶液，置于110 ℃烘箱20 min后取出觀察。由圖6可知，對(duì)a板進(jìn)行分析，噴灑茚三酮后樣品顏色呈現(xiàn)藍(lán)紫色，表明所提取的抑菌物質(zhì)中含有氨基酸或短肽類物質(zhì)，結(jié)合抑菌物質(zhì)提取方法可知，抑菌物質(zhì)為脂肽類物質(zhì)[26]。對(duì)b板分析可得出，粗提物中至少存在5種以上的含肽類物質(zhì)，而將b、c板對(duì)比分析可得，c板上并未出現(xiàn)更多的條帶，初步判斷抑菌物質(zhì)不存在閉合的環(huán)狀肽[27]。

圖6 薄層色譜法分析抑菌物質(zhì)粗提物成分的結(jié)果Fig.6 Results of crude extracts of bacteriostatic substances by thin layer chromatography analysis

2.5 抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性分析

2.5.1 溫度穩(wěn)定性分析

改變菌株P(guān)9抑菌物質(zhì)粗提物的溫度處理?xiàng)l件，采用牛津杯法進(jìn)行抑菌活性的測(cè)定。得粗提物對(duì)溫度變化的穩(wěn)定性結(jié)果如圖7所示。

圖7 溫度對(duì)抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of temperature on the stability of bacteriostatic substances

由圖7可知，菌株P(guān)9發(fā)酵上清液提取的脂肽類粗提物受溫度變化影響較大，當(dāng)溫度為0～50 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，脂肽粗提物抑菌圈直徑保持相對(duì)穩(wěn)定；當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，脂肽類粗提物的穩(wěn)定性逐漸降低，但依然對(duì)病害菌有一定的抑制性。結(jié)果表明，該粗提物的溫度保持在25 ℃時(shí)活性最大，0～50 ℃穩(wěn)定性最好。

2.5.2 金屬離子穩(wěn)定性分析

分別向抑菌物質(zhì)粗提液中添加各種金屬離子，選用不添加金屬離子的粗提液為對(duì)照。采用牛津杯法進(jìn)行抑菌活性的測(cè)定。金屬離子對(duì)抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性的結(jié)果如圖8所示。

由圖8可知，所使用的金屬離子對(duì)拮抗物都有一定的影響，但影響都不大，與對(duì)照組相比，Cu2+和Mn2+對(duì)脂肽粗提物的穩(wěn)定性幾乎無(wú)影響，而Mg2+、Ca2+、Zn2+和Fe2+對(duì)其有一定的影響?？赡苁沁@些金屬離子會(huì)抑制脂肽類的抑菌物質(zhì)活性，導(dǎo)致抑菌效果有所降低，表現(xiàn)為抑菌圈直徑變小。

圖8 金屬離子對(duì)抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of metal ions on the stability of bacteriostatic substances

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)選用貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）P9為研究對(duì)象，通過(guò)接種P9于不同的產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果表明，貝萊斯芽孢桿菌P9具有分泌纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶的能力，但在CMC-Na培養(yǎng)基及β-葡聚糖酶選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)比較緩慢。對(duì)菌株P(guān)9的抑菌物質(zhì)進(jìn)行提取結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用酸沉淀提取出的抑菌物質(zhì)最多，表現(xiàn)為抑菌圈直徑最大；通過(guò)優(yōu)化酸沉淀時(shí)的pH值結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pH=2.0時(shí)酸沉淀的效果最好，其表現(xiàn)為抑菌圈直徑可達(dá)14.3 mm。而對(duì)沉淀進(jìn)行重懸時(shí)，用甲醇∶PBS=1∶3（V/V），可以使抑菌物質(zhì)活性最大化，表現(xiàn)為抑菌圈直徑最大。TLC法分析抑菌物質(zhì)粗提物時(shí)發(fā)現(xiàn)，提取出的抑菌物質(zhì)可能為脂肽類物質(zhì)。對(duì)抑菌物質(zhì)的穩(wěn)定性分析發(fā)現(xiàn)，抑菌物質(zhì)對(duì)溫度較為敏感，在溫度高于50 ℃后，抑菌效果逐漸下降；而受金屬離子的影響較小。因此，本實(shí)驗(yàn)將為致病性尖孢鐮刀菌的生物防治提供有利實(shí)驗(yàn)參考。