趙俊云，楊向竹，郭健

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 102488)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以全身關(guān)節(jié)滑膜異常增生及炎癥為主要表現(xiàn)的系統(tǒng)性自身免疫疾病[1]，其中滑膜異常增生主要與滑膜成纖維細(xì)胞的類腫瘤細(xì)胞的異常增殖及異常分泌表型有關(guān)，在RA發(fā)生發(fā)展中異?；罨幕こ衫w維細(xì)胞起著至關(guān)重要的作用，其通過分泌炎癥介質(zhì)進(jìn)一步導(dǎo)致滑膜炎癥和軟骨損傷，因此成為抗RA藥物的重要靶細(xì)胞之一[2]。臨床上RA治療多采用糖皮質(zhì)激素、非甾類抗炎藥、免疫抑制劑或靶向生物制劑等[3]，副作用和不良反應(yīng)多，或價格昂貴，難以長期使用。因此，高效、低副作用一直是抗RA藥物研究的主要問題。植物藥，如雷公藤、白芍、青藤等來源的活性成分已被應(yīng)用于RA治療的研究，顯示一定的療效，但也常伴隨毒副作用的出現(xiàn)[4]。丹皮酚是中藥牡丹(Paeonia suffruticosa)干燥根皮的主要活性成分,課題組前期工作顯示丹皮酚有較好的抗炎和抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性[5]。本研究旨在探討丹皮酚在體外對人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖與凋亡的影響，為丹皮酚及其衍生物用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

丹皮酚(Paeonol, PAE)購自國家食品藥品檢定所(no.100447-200701),純度98%； DMEM medium、Fetal Bovine Serum、0.25% Trypsin-EDTA購自Invitrogen; Annexin V-PI Apoptosis Detection Kit購自BD Biosciences；PureLinkTMRNA Mini Kit、TaqManTMGene Expression Master Mix購自Thermo Fisher Scientific；HPRT、Ki-67、Caspase-3 Taqman引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成；Anti-human Ki-67 antibody、Anti-human Caspase-3 antibody購自Cell Signal Technology；人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞株MH7A購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測細(xì)胞增殖

按常規(guī)方法[5]培養(yǎng)MH7A細(xì)胞，使用0.05%胰蛋白酶溶液消化3 min，終止消化后收集細(xì)胞，以每孔約4×104個細(xì)胞密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，除對照組外，丹皮酚各劑量組分別加入丹皮酚至終濃度為10-6M、5×10-6M、10-5M，每組設(shè)5復(fù)孔，等體積DMSO處理作為對照組，總體積均為200 μL。分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后加入終濃度為0.5 mg/mL的MTT，孵育4～6 h后，每孔吸棄上清液100 μL，每孔加入150 μL DMSO，避光混勻15 min，酶標(biāo)儀檢測OD570，計算抑制率。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

同上制備細(xì)胞懸液，以每孔約2×105個細(xì)胞密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，除對照組外，丹皮酚各劑量組分別加入丹皮酚至終濃度為10-6M、5×10-6M、10-5M，每組設(shè)3復(fù)孔，等體積DMSO處理作為對照組，培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌，以每毫升約5×106個細(xì)胞密度重懸于結(jié)合緩沖液，每100 μL細(xì)胞懸液加入5 μL Annexin V，避光孵育后，加入2 mL結(jié)合緩沖液，離心收集細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于200 μL結(jié)合緩沖液，加入5 μL PI溶液，孵育15 min，上機分析，計算凋亡細(xì)胞比例。

1.2.3 qRT-PCR檢測

同上接種細(xì)胞和分組給藥處理，培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞，按試劑盒說明提取mRNA，檢測濃度和純度，依次進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和real-time PCR。

1.2.4 Western blot檢測

同上接種細(xì)胞和分組給藥處理，培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞，加裂解液處理，離心提取總蛋白，定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，使用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)移電泳，5%封閉液處理1 h后，分別加入稀釋后的Anti-human Ki-67 antibody和Anti-human Caspase-3 antibody，孵育過夜，β-actin作為內(nèi)參抗體，洗膜后，加入稀釋后的二抗，孵育1 h，曝光顯影。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 丹皮酚對MH7A細(xì)胞增殖的影響

MTT實驗結(jié)果顯示，丹皮酚各劑量處理對MH7A細(xì)胞的增殖均有明顯抑制作用，見表1。

表1 丹皮酚抑制MH7A的增殖(%)

2.2 丹皮酚對MH7A細(xì)胞凋亡的影響

根據(jù)細(xì)胞增殖實驗結(jié)果，使用丹皮酚處理細(xì)胞72 h后，用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合雙染法測定凋亡信號，發(fā)現(xiàn)丹皮酚各劑量組凋亡細(xì)胞比例顯著增加(P<0.05或P<0.01)，見表2。

表2 丹皮酚促進(jìn)MH7A凋亡(%)

注：與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01

2.3 丹皮酚對Ki-67、Caspase-3 mRNA水平的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，各劑量丹皮酚處理細(xì)胞72 h后，Ki-67轉(zhuǎn)錄水平顯著降低(P<0.01)，高劑量組Caspase-3轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P<0.05)，見圖1。

2.4 丹皮酚對Ki-67、Caspase-3蛋白水平的影響

各劑量丹皮酚處理MH7A細(xì)胞72 h后，Ki-67蛋白水平顯著降低，Caspase-3蛋白水平顯著升高，見圖2。

注:CTRL：對照組；PAE-L：丹皮酚低劑量組；PAE-M：丹皮酚中劑量組；PAE-H：丹皮酚高劑量組；與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01圖1 Ki-67和Caspase-3 的mRNA水平

注:CTRL：對照組；PAE-L：丹皮酚低劑量組；PAE-M：丹皮酚中劑量組；PAE-H：丹皮酚高劑量組；與對照組比較，**P<0.01圖2 Ki67和Caspase-3 的蛋白水平

3 討論

RA患者關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞的增長和死亡失衡是造成滑膜增生和關(guān)節(jié)炎癥的主要原因[6]，因此,如何有效抑制滑膜成纖維細(xì)胞的增殖與促進(jìn)其凋亡是抗RA藥物研究的重要方向之一。由于RA滑膜成纖維細(xì)胞有類似于腫瘤細(xì)胞的某些表型，如能在氧化應(yīng)激條件下自主生存[7]，且RA患者關(guān)節(jié)的微環(huán)境也類似于低氧、低營養(yǎng)的腫瘤微環(huán)境，提示對腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡有影響的藥物可能對滑膜成纖維細(xì)胞的增殖和凋亡具有相似作用。

本研究中使用MTT法檢測到丹皮酚對MH7A的體外增殖有抑制作用，且抑制率與劑量及作用時長呈正相關(guān)，丹皮酚中劑量組作用72 h可達(dá)到接近50%的抑制率，這顯示丹皮酚具有長時間用藥的可能性，可根據(jù)情況調(diào)整為適當(dāng)劑量。使用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合雙染法檢測到丹皮酚各劑量組的凋亡細(xì)胞比例較對照組均顯著升高，且凋亡細(xì)胞比例隨著藥物濃度的增加而升高，推測丹皮酚可促進(jìn)MH7A發(fā)生凋亡。

為了進(jìn)一步明確丹皮酚抑制增殖與誘導(dǎo)凋亡的可能機制，對丹皮酚處理后的細(xì)胞進(jìn)行增殖標(biāo)記物Ki67和重要凋亡基因Caspase-3的表達(dá)情況觀察。Ki-67(Cell proliferation-associated nuclear antigen Ki67)是一種細(xì)胞增殖必需的核蛋白，被用作細(xì)胞增殖標(biāo)記物，常用于腫瘤分級鑒定[8]。本研究使用Ki-67作為主要指標(biāo)來表示MH7A的增殖狀態(tài)。Caspase-3蛋白是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase)家族中的一員，其外源性激活將觸發(fā)細(xì)胞凋亡途徑，在細(xì)胞凋亡中起主導(dǎo)作用[9]。本研究使用Caspase-3作為主要指標(biāo)來表示MH7A的凋亡水平。

本研究中使用qRT-PCR法檢測到丹皮酚處理72 h后，各劑量組Ki-67的mRNA水平均顯著降低，且高劑量組下降幅度最大，與MTT實驗結(jié)果基本一致。而Caspase-3的mRNA水平僅高劑量組有明顯升高，低中劑量組變化并不明顯，推測丹皮酚誘導(dǎo)MH7A凋亡可能存在著閾值效應(yīng)。使用Westernblot法檢測到丹皮酚處理72 h后，各劑量組均出現(xiàn)Ki-67蛋白水平顯著降低，Caspase-3蛋白水平顯著升高，其中Ki-67的組間差異與MTT實驗結(jié)果保持一致，Caspase-3的組間差異并不明顯，進(jìn)一步提示丹皮酚誘導(dǎo)MH7A凋亡的劑量閾值效應(yīng)?？傮w上看，丹皮酚在低劑量使用時即可達(dá)到抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的效果，這為長期維持用藥提供了可能性。

綜上，丹皮酚是有效的滑膜成纖維細(xì)胞體外生長的調(diào)節(jié)劑，結(jié)合其抗炎活性，有望用于RA的臨床治療，后續(xù)研究將以低毒性為目標(biāo)進(jìn)一步探討其衍生物的開發(fā)及適用劑型的研究。