陳鴻泰 羅毅文 陳東風(fēng) 徐亮亮,3 劉亞梅* 王斌* 謝平金

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510240 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405 4.上海中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院/深圳市羅湖區(qū)中醫(yī)院，廣東 深圳 518000

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)作為一種多能干細(xì)胞，在通過一定條件下誘導(dǎo)向成骨、軟骨和脂肪等分化來修復(fù)受損的組織器官[1]。已有研究表明，骨折時BMSCs被周圍組織或循環(huán)中誘導(dǎo)并募集至骨折端對骨修復(fù)，BMSCs濃度總量增加可促進(jìn)骨折愈合[2-4]。骨折早期，部分BMSCs通過血液循環(huán)到達(dá)骨折部位，并快速地增殖并向骨/軟骨細(xì)胞分化[5]。然而，通過循環(huán)系統(tǒng)注射的BMSCs只有少部分到達(dá)受損部位[6]。高效促進(jìn)BMSCs向骨折部位定向歸巢，BMSCs趨化性研究是目前的熱點(diǎn)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎活血法方藥可促進(jìn)BMSCs的體外遷移，加快骨折修復(fù)過程。其中補(bǔ)腎組乙酸乙酯部位能有效促進(jìn)BMSCs增殖，而促進(jìn)BMSCs遷移的有效部位在活血組[7]。通過對活血組中藥即當(dāng)歸、紅花、沒藥、川牛膝的揮發(fā)油和乙醇回流提取物(簡稱醇提物)進(jìn)行深入研究，結(jié)果表明，紅花揮發(fā)油、川牛膝醇提物不僅促進(jìn)SD大鼠BMSCs增殖、遷移，還可動員干細(xì)胞巢內(nèi)的BMSCs進(jìn)入外周血。RNA測序結(jié)果表明，杯莧甾酮作為川牛膝醇提物的有效成分之一，可以促進(jìn)BMSCs的C-X-C型趨化因子受樣4(C-X-C chemokine receptor type4, CXCR4)-表達(dá)。本研究擬通過杯莧甾酮對大鼠BMSCs體外遷移能力及CXCR4表達(dá)的影響，揭示中醫(yī)活血法促進(jìn)BMSCs遷移、加快骨折修復(fù)的內(nèi)在分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動物 SPF 級

SD大鼠，雄性，4 周齡，體重80～90 g，共2只[廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK(粵)：2013-0034]。

1.2 主要試劑及儀器

胎牛血清(FBS)(美國 Hyclone 公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS)(美國 Hyclone 公司)，DMEM 低糖培養(yǎng)基(美國 Gibco 公司)，0.25 %胰蛋白酶(美國 Gibco 公司)，CXCR4抗體(Abcam公司)，山羊抗兔二抗(北京博奧森公司)，F(xiàn)ITC熒光試劑盒(北京博奧森公司)，吉姆薩染液(廣州瑞舒公司)，二甲基亞砜(DMSO)(美國 Sigma 公司)，CXCR4沉默質(zhì)粒(吉瑪公司)，SCW-HS-840型超凈工作臺(蘇州市長春電子儀器廠)，CKX31型倒置顯微鏡(日本OlymPus 公司)，B16UUCO2培養(yǎng)箱(德國 Heraues 公司)，25 cm2培養(yǎng)瓶(美國 Corning公司)，Transwell板(24孔、6 孔,聚酯透明膜,3.0 μm)(美國 Corning公司)。

1.3 BMSCs 的分離及培養(yǎng)[8]

頸椎脫臼處死大鼠，在超凈臺無菌下分離出股骨與脛骨，剪斷干骺端，置于雙抗DMEM培養(yǎng)基，用無血清DMEM培養(yǎng)基對骨髓腔進(jìn)行沖洗并收集沖洗液，離心8 min(1 000 r/min)后棄上清液；于4 mL完全培養(yǎng)基(含10 %FBS)混勻沉淀，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中(37 ℃)、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h培養(yǎng)后，換液。以后每2 d換液一次，至細(xì)胞融合度為80%～90%，消化細(xì)胞傳代并標(biāo)記為P1，傳代的細(xì)胞每3～4 d換液一次，傳代至P3。

1.4 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

取P3 BMSCs制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度(5×104個/mL)，接種于96孔板，5×103/孔，細(xì)胞貼壁后，培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分別加入牛膝杯莧甾酮按照5、10、20 μg/mL濃度梯度培養(yǎng)48 h，加入MTT 20 μL(5 mg/mL)，繼續(xù)在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，吸取上清液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)，150 μL振搖10 min，用酶標(biāo)儀測吸光度值(OD490 nm)。

1.5 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)

P3代細(xì)胞接種前無血清培養(yǎng)12 h后，消化細(xì)胞，用含F(xiàn)BS培養(yǎng)基(0.1%)調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個/mL，取200 μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后，下室加入750 μL含或不含杯莧甾酮(5、10、20 μg/mL)的FBS培養(yǎng)基(20%)，每組設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h后，取出小室，棄孔中培養(yǎng)液，PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗2遍，吉姆薩染液染色20 min，PBS洗2遍，在倒置顯微鏡(×400)下，隨機(jī)取5個視野，觀察計數(shù)細(xì)胞。

1.6 PCR法檢測CXCR4表達(dá)

采用Primer5 軟件，根據(jù)NCBI上下載的CXCR4 基因下載的序列設(shè)計引物和探針，核苷酸序列和擴(kuò)增片段長度，見表1。熒光定量PCR體系及反應(yīng)條件。P3代細(xì)胞消化后接種于12孔板中，分別給予濃度為5、10、20 μg/mL及0 μg/mL(空白對照組)的杯莧甾酮處理。處理后，裂解細(xì)胞，采用Trizol 法提取總RNA，PCR反應(yīng)采用一步法進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系體積為50 μL，包含1×suPerscrPt buffer，引物(各8 Pmol)，熒光探針(各4 Pmol)，5 μL RNA 模板。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：50 ℃ 15 min，94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s 共50個循環(huán)。RNA操作嚴(yán)格按照說明書步驟進(jìn)行。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.7 進(jìn)一步驗(yàn)證SDF-1/CXCR4 信號軸在杯莧甾酮干預(yù)BMSCs遷移中的作用

1.7.1Transwell 小室實(shí)驗(yàn)：運(yùn)用siRNA CXCR4的沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs，干預(yù)24 h(12 h)后，消化細(xì)胞，分為空白對照組、CXCR4沉默組、杯莧甾酮組、杯莧甾酮+CXCR4沉默組，進(jìn)行 Transwell 體外實(shí)驗(yàn)(方法同1.5)，其中杯莧甾酮組：含杯莧甾酮10 μg/mL的20%FBS培養(yǎng)基；CXCR4沉默組：單純予以siRNA CXCR4轉(zhuǎn)染BMSCs；杯莧甾酮+CXCR4沉默組：CXCR4沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs，同時予以含杯莧甾酮10 μg/mL的20%FBS培養(yǎng)基。余實(shí)驗(yàn)步驟同上1.6。CXCR4-Rat-365：sense：序列(5′-3′)GACUGGUACUUUGGGAAAUTT；antisense：序列(5′-3′)AUUUCCCAAAGUACCAGUCTT。

1.7.2免疫蛋白印跡法(Western blot)檢測CXCR4蛋白表達(dá)：運(yùn)用siRNA CXCR4的沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs，干預(yù)24 h后，消化細(xì)胞并接種于6孔板中，按空白對照組、CXCR4沉默組、杯莧甾酮組、杯莧甾酮+CXCR4沉默組分別處理。將各組細(xì)胞裂解，提取總蛋白，加入5×SDS溶液煮沸變性。用微量進(jìn)樣器吸取各組30 μL樣品蛋白加入濃縮膠樣品孔中并電泳20 min(100 V)，分離膠中電泳 40 min(200 V)，轉(zhuǎn)膜 70 min(350 mA)。膜室溫封閉 1 h；將膜取出放入GAPDH、CXCR4 一抗(1∶1000)中，4 ℃反應(yīng)過夜；PBST洗膜，5 min×4次；將膜轉(zhuǎn)入二抗(1∶30 000)中，37 ℃反應(yīng)1 h；PBST 洗膜，5 min×5次；用化學(xué)發(fā)光法顯影。Image J圖像處理軟件分析，結(jié)果以CXCR4/GAPDH比值表示。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度杯莧甾酮干預(yù)MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

結(jié)果顯示，杯莧甾酮10、20 μg/mL對BMSCs均有顯著的增殖作用，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且以10 μg/mL濃度的效果最佳(P<0.05)。見圖1。

圖1 不同濃度杯莧甾酮干預(yù)MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of MTT cell proliferation experiment with different concentrations of cyasterone注：與空白組比較，*P<0.05；與10μg/mL組比較，△P<0.05。

2.2 不同濃度杯莧甾酮促進(jìn)BMSCs體外遷移實(shí)驗(yàn)

結(jié)果顯示，與空白組對比，杯莧甾酮5、10、20 μg/mL均促進(jìn)細(xì)胞遷移(P<0.05)，且以10 μg/mL濃度的效果最佳(P<0.05)。見圖2、3。

圖2 不同濃度杯莧甾酮促進(jìn)BMSCs體外遷移結(jié)果Fig.2 Different concentrations of cyasterone to promote the migration of BMSCs in vitro注：與空白組比較，*P<0.05；與10 μg/mL組比較，*△P<0.05。

圖3 不同濃度杯莧甾酮干預(yù)后各組顯微鏡下細(xì)胞情況 A：空白對照組(×400)；B：杯莧甾酮5 μg/mL組(×400)；C：杯莧甾酮10 μg/mL組(×400)；D：杯莧甾酮20 μg/mL組(×400)。Fig.3 Cellular conditions of each group after intervention with different concentrations of cyasterone. A: Blank control group (×400); B: Cyasterone 5 μg/mL group (×400); C: Cyasterone 10 μg/mL group (×400); D: Cyasterone 20 μg/mL group (×400).

2.3 不同濃度杯莧甾酮干預(yù) CXCR4表達(dá)

PCR結(jié)果顯示，杯莧甾酮5、10、20 μg/mL均促進(jìn) CXCR4表達(dá)(P<0.05)，且呈濃度依賴性，以10 μg/mL濃度的效果最佳(P<0.05)，與 Transwell 結(jié)果相對吻合(見圖4)。

圖4 不同濃度杯莧甾酮干預(yù) CXCR4表達(dá)結(jié)果Fig.4 CXCR4 expression results under different concentrations of cyasterone intervention注：與空白組比較，*P<0.05；與10 μg/mL組比較，△P<0.05。

2.4 進(jìn)一步驗(yàn)證SDF-1/CXCR4 信號軸在杯莧甾酮干預(yù)BMSCs遷移中的作用

2.4.1各組Transwell 結(jié)果：與空白組對比，CXCR4沉默組抑制細(xì)胞遷移(P<0.05)；相反，杯莧甾酮組則促進(jìn)細(xì)胞遷移(P<0.05)。另外，CXCR4沉默+杯莧甾酮組則與空白組對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖5、6。

圖5 各組Transwell 結(jié)果Fig.5 Transwell results for each group注：與空白組比較，*P<0.05；與CXCR4沉默組比較，△P<0.05。

圖6 各組顯微鏡下細(xì)胞情況 A：空白對照組(×400)；B：CXCR4沉默組(×400)；C：杯莧甾酮組(×400)；D：CXCR4沉默組+杯莧甾酮組(×400)。Fig.6 Cell conditions of each group under microscope. A: Blank control group (×400); B: CXCR4 silencing group (×400); C: Cyasterone group (×400); D: CXCR4 silencing group + Cyasterone group (×400).

2.4.2各組干預(yù)后CXCR4蛋白表達(dá)：Western blot結(jié)果顯示，與空白組對比，CXCR4沉默組均抑制 CXCR4 蛋白表達(dá)(P<0.05)；相反，杯莧甾酮組則促進(jìn)CXCR4 蛋白表達(dá)(P<0.05)。另外，CXCR4沉默+杯莧甾酮組則與空白組對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖7。

圖7 各組中CXCR4表達(dá)凝膠電泳圖Fig.7 Electrophoresis of CXCR4 expression in each group

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“血不活則骨不能接”“瘀不去則骨不能接”，治療骨折“補(bǔ)腎是基礎(chǔ)，活血是關(guān)鍵”[9]；而“損傷一癥，專從血論”“活血祛瘀法”當(dāng)貫穿骨折治療的始終[10]?！案沃鹘?、腎主骨”，中醫(yī)治療骨折與大部分藥物選用歸肝、腎經(jīng)為主的中藥，取其活血化瘀、和血調(diào)營、補(bǔ)腎強(qiáng)筋的功效[11-12]。之前活血化瘀藥促進(jìn)骨折愈合機(jī)理主要在局部血液循環(huán)、成骨細(xì)胞活性和分化等方面研究[13-14]，而促進(jìn)BMSCs遷移歸巢的研究較少。近年來發(fā)現(xiàn)，具有活血止痛中藥的有效成分可促進(jìn)外源性骨髓BMSCs在體內(nèi)的遷移，不僅可使損傷部位的骨髓BMSCs數(shù)量增加，且局部的干細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)水平明顯增加[15]。這提示具有歸肝、腎二經(jīng)的活血化瘀中藥具有促進(jìn)BMSCs歸巢至骨折端，并促進(jìn)骨折愈合的作用。筆者的前期研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎活血法在促進(jìn)BMSCs遷移中具有重要作用，其相關(guān)機(jī)制與激活SDF-1/CXCR4信號軸有關(guān)[16-17]。

在骨折愈合的早期炎癥階段，血管和其它組織破壞導(dǎo)致組織和低氧，這個過程觸發(fā)炎癥聯(lián)級反應(yīng)[18]，誘導(dǎo)一些細(xì)胞因子(如IL-6)和趨化因子(如基質(zhì)細(xì)胞洐生因子，stromal cell-derived factor-1，SDF-1，又稱CXCL12)等分泌，促使BMSCs從骨膜和骨髓中釋放進(jìn)入血液中，迅速聚集到骨折部位，啟動骨再生過程[19]。SDF-1與其配體CXCR4具有高度親和力，是誘導(dǎo)干細(xì)胞趨化和歸巢相關(guān)分子中最重要的信號軸之一，在受傷的骨膜中升高，召募BMSCs到骨折位置，提高軟骨內(nèi)成骨[20-21]。Kitaori等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，骨折損傷時SDF-1可從骨膜中誘導(dǎo)出、與CXCR4結(jié)合，從而募集 BMSCs至損傷部位，促進(jìn)骨折修復(fù)。運(yùn)用移植的BMSCs聯(lián)合局部注射SDF-1能修復(fù)骨不連，并呈劑量依賴性[23]。SDF-1與受體CXCR4的結(jié)合在受抑制時骨折后軟骨、骨痂及骨礦化的量明顯影響較少[24]。川牛膝具有活血通經(jīng)、補(bǔ)益肝腎、祛瘀止痛、強(qiáng)筋健骨的功效，在治療骨折的常用活血化瘀中藥中使用頻率較高。以往大量的臨床和實(shí)驗(yàn)表明，杯莧甾酮作為川牛膝的提取、分離的化學(xué)成分之一，在治療骨質(zhì)疏松癥中具有抑制破骨分化和促進(jìn)成骨分化的雙向作用[25]。但其激發(fā)干細(xì)胞遷移，進(jìn)而促進(jìn)骨折修復(fù)尚未見研究報道。

本研究運(yùn)用MTT、Transwell體外遷移實(shí)驗(yàn)篩選杯莧甾酮動員BMSCs歸巢的最佳濃度為10 μg/mL。PCR結(jié)果顯示，杯莧甾酮5、10、20 μg/mL均促進(jìn)CXCR4表達(dá)(P<0.05)，且以10 μg/mL濃度的效果最佳(P<0.05)，與 Transwell 結(jié)果相對吻合。為進(jìn)一步證實(shí)杯莧甾酮是否通過上調(diào)CXCR4蛋白來促進(jìn)BMSCs體外遷移的作用，本實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用CXCR4沉默質(zhì)粒干預(yù) BMSCs，結(jié)果顯示，與空白組對比，CXCR4沉默組抑制細(xì)胞遷移(P<0.05)；相反，杯莧甾酮組則激發(fā)細(xì)胞遷移能力(P<0.05)，而CXCR4沉默+杯莧甾酮組則與空白組對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。另外，蛋白印跡結(jié)果顯示CXCR4表達(dá)結(jié)果與遷移結(jié)果一致。說明杯莧甾酮在促進(jìn)BMSCs體外遷移的作用機(jī)制主要是通過上調(diào)CXCR4這一靶點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)的，這可能與激活SDF-1/CXCR4 信號軸有關(guān)，但其內(nèi)在機(jī)制尚待進(jìn)一步探究。本研究結(jié)果為杯莧甾酮作為加快骨折愈合、縮短骨折愈合時間以及防止骨折延遲愈合及骨不連的輔助治療提供理論依據(jù)，間接闡明中醫(yī)活血法在骨折愈合中的治療作用。