吳菊萍，肖倩，王建國，王鶯

（南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 腫瘤研究所，廣東 廣州 510515）

外泌體是一種可參與細胞間信號傳導(dǎo)的細胞外囊泡[1-3]，具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，可作為藥物載體應(yīng)用于疾病研究[4]。目前研究多集中于動物細胞來源的外泌體[5]。然而其提取工藝復(fù)雜，成本高，收率低；同時含有與供體細胞一致的脂質(zhì)、核酸及蛋白等[6]，應(yīng)用過程存在安全性問題[7]。相比較植物來源的外泌體，其生物相容性和安全性更為可靠[8-9]。本研究從番茄中提取外泌體，對提取工藝進行摸索和優(yōu)化，旨在開發(fā)植物來源的外泌體作為藥物載體。

1 材料與方法

1.1 材料

市售番茄，MTT、OptiPrep 購于美國Sigma 公司，DiI 熒光染液購于上海碧云天生物公司，BCA 蛋白含量檢測試劑盒購于江蘇南京凱基生物，F(xiàn)AM 標記及未標記反義EBV-miR-BART7-3p 由上海吉瑪制藥公司合成，DOTAP ∶DOPE（陽離子脂質(zhì)體）購于美國Avanti 公司，miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于大連寶生生物技術(shù)有限公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒和探針購于日本TaKaRa 公司，動態(tài)光散射儀購于英國馬爾文公司，Avanti J-26XP 低溫高速離心機購于美國BECKMAN 公司，Hitachi CP100WX 低溫超高速離心機購于日本日立公司，TOPCONDS 150 透射電鏡、正置熒光顯微鏡購于日本尼康公司，電穿孔儀購于美國BIO-RAD 公司，Agilent Technologies Mx3005P 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀購于美國安捷倫科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人肺腺癌A549 細胞、人鼻咽癌HONE1（EBV+）細胞用含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基，人卵巢癌A2780 細胞用含10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基，常規(guī)置于37℃、含5%二氧化碳CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[10]。A549、A2780 細胞來源于南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所，HONE1（EBV+）細胞來源于香港大學(xué)。

1.2.2 外泌體提取分離工藝及其優(yōu)化 番茄人工去皮，榨取的新鮮番茄汁放入低溫高速離心機，4 000 r/min 離心20 min，去除大的殘渣；9 000 r/min 離心1 h，去除細小植物碎片，留存上清。上清11 000 r/min離心1.5 h，收集沉淀，并用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline,PBS）重懸。應(yīng)用蔗糖密度梯度離心法繼續(xù)分離純化[11]。配制8%、30%、45%及60%質(zhì)量分數(shù)的蔗糖溶液，在離心管中依次加入不同濃度蔗糖溶液，最后緩慢加入重懸液于8%蔗糖溶液[12-14]。36 000 r/min 離心1.5 h，合并收取上2 層條帶并加水稀釋，再進行離心除掉蔗糖，用PBS 重懸沉淀。鑒于第一步粗提過程外泌體損耗較多，對工藝適當優(yōu)化：番茄汁25 000 r/min 離心1 h，收集沉淀，用PBS 重懸；濃縮后應(yīng)用相同工藝，進行蔗糖密度梯度離心，收集目的條帶，凍干稱重。

1.2.3 外泌體純化及表征 應(yīng)用薄膜水化法進一步提取外泌體脂質(zhì)成分，具體步驟：渦旋混勻外泌體，加入體積比為2 ∶1 的甲醇-氯仿混合液，混勻后加入等量氯仿混勻，最后加入與氯仿等體積去離子水后混勻，于4 000 r/min 離心10 min 分為有機相和水相，收集有機相、懸干，形成脂質(zhì)薄膜；加入適量去離子水，浸泡過夜，超聲水浴10 min，即得到脂質(zhì)純化后外泌體[15-17]。采用BCA 蛋白含量檢測試劑盒測定外泌體蛋白濃度進行定量。應(yīng)用動態(tài)光散射（dynamic light scattering,DLS）儀和透射電子顯微鏡（transmission electron microscope,TEM）檢測薄膜水化法前后外泌體的粒徑、電位及形貌等。

1.2.4 外泌體MTT 細胞毒性實驗 應(yīng)用蛋白含量檢測試劑盒測定外泌體蛋白濃度并對其進行定量，分別用不同濃度的外泌體作用于A549、A2780 及HONE1（EBV+）細胞24 h，檢測其細胞毒性作用。將細胞按2 000 個/孔鋪于96 孔板，待細胞貼壁后加入濃度分別為1、2、3 及4μg/ml 的外泌體，共培養(yǎng)24 h 后，加入20μl 四甲基偶氮唑鹽5 mg/ml，37℃孵育4 h，加入150μl 二甲基亞砜，混勻后，酶標儀測定490 nm處各孔光密度（optical density,OD）值，計算不同濃度條件下細胞活度值，繪制抑制曲線。

1.2.5 外泌體負載模型藥物和目的基因 在2μg/ml 外泌體氯仿溶液中加入適量DiI 模型藥物，混勻后旋干，加入去離子水，浸泡過夜，超聲水浴10 min，即形成負載模型藥物DiI 的外泌體。薄膜水化法純化2μg/ml 外泌體，形成脂質(zhì)薄膜層后，加入電轉(zhuǎn)液浸泡過夜，超聲水浴，加FAM 標記的或無標記的反義EBV-miRBART7-3p[18-19]（10μl，20μmol/L），在400 V、125μF條件下進行電穿孔，于冰上孵育30 min，形成負載FAM標記反義EBV-miR-BART7-3p 的納米基因藥物[20-27]。 應(yīng)用紫外分光光度法，分別建立DiI 在549 nm 和FAM 標記的反義EBV-miR-BART7-3p 在490 nm 處的濃度-吸光度值標準曲線，測定相應(yīng)的OD 值確定外泌體負載模型藥物和目的基因濃度，經(jīng)檢測納米藥物分別含有0.2μg/ml DiI 和0.1μmol/L 目的基因。

1.2.6 納米藥物的細胞攝取實驗 以游離DiI 為對照，將負載DiI 的納米藥物分別與A549 和A2780 細胞共孵育4 h；按照其說明書制備DOTAP ∶DOPE 脂質(zhì)液，按質(zhì)量比1 ∶10 DNA 和脂質(zhì)體配比，加入與10μl（20μmol/L）目的基因相應(yīng)的脂質(zhì)體量，混勻后制備DOTAP ∶DOPE 攜帶目的基因藥物，將負載FAM 標記的反義EBV-miR-BART7-3p 納米基因藥物與HONE1（EBV+）共孵育4 h，4%多聚甲醛分別固定細胞，Hoechst 33342 染核，在熒光顯微鏡下觀察不同細胞對納米藥物的攝取情況。

1.2.7 基因沉默實驗 取對數(shù)生長期HONE1（EBV+）細胞接種于6 孔板中，待細胞貼壁，分別由外泌體和DOTAP ∶DOPE 負載反義EBV-miR-BART7-3p 瞬時轉(zhuǎn)染細胞，PBS 洗細胞3 次后，分別加入不同基因藥物與Opt-mem 培基，混勻，轉(zhuǎn)染48 h 后裂解細胞，提取總RNA，用探針法熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)檢測不同載體組基因沉默效果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均 數(shù)±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析，進一 步兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 番茄外泌體性能表征

蔗糖密度梯度離心后有3 層條帶，合并收集上層和中層產(chǎn)物，凍干后稱重，得番茄外泌體為1.31 g/kg。DLS 儀測定結(jié)果表明，純化前外泌體平均粒徑經(jīng)薄膜水化法純化后，粒徑變小。TEM 結(jié)果表明，外泌體呈典型的圓形或橢圓形杯狀脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，且純化后粒子形狀更加均一。見表1和圖1～3。

表1 外泌體純化前后性能表征 （±s）

表1 外泌體純化前后性能表征 （±s）

時間 粒徑/nm 分散系數(shù) 電位/mV純化前 153.447±3.456 0.347±0.051 0.052±0.033純化后 130.893±0.737 0.375±0.004 -0.307±0.346

圖1 蔗糖密度梯度法分離后外泌體條帶

圖2 純化前外泌體性能表征

圖3 純化后外泌體性能表征

2.2 細胞毒性

MTT 法結(jié)果表明，細胞存活率≥100%。說明外泌體未表現(xiàn)出細胞毒性，外泌體具有良好的生物相容性。見圖4。

2.3 細胞對納米藥物的攝取

圖4 BCA 定量標準曲線與外泌體細胞毒性實驗

以外泌體為載體分別包裹脂溶性模型藥物DiI 和FAM 標記的反義EBV-miR-BART7-3p，用游離DiI和DOTAP ∶DOPE 負載的目的基因作為對照組，考察其進入細胞的情況。外泌體攜帶模型藥物DiI 在A549 細胞和A2780 細胞的攝取情況表明，與游離DiI 相比，外泌體能成功攜帶模型藥物進入細胞。與DOTAP ∶DOPE 比較，外泌體攜帶的目的基因效果更好，說明外泌體是一種合適的基因載體，且無論是攜帶模型藥物還是目的基因，所制備的納米藥物均分布在細胞的胞漿。見圖5。

2.4 基因沉默實驗

應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體DOTAP ∶DOPE 包裹目的基因作為對照，考察外泌體攜帶目的基因的基因沉默效果?；虺聊Y(jié)果顯示，各組目的基因相對表達量以正常對照組結(jié)果為1，DOTAP ∶DOPE 組與外泌體組的基因相對表達量分別為（0.643±0.110）和（0.343±0.062）。3 組目的基因相對表達量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=179.100，P=0.000），進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，DOTAP ∶DOPE 組與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.837，P=0.000）；DOTAP ∶DOPE 組低于正常對照組。外泌體組與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=20.430，P=0.000）；外泌體組低于正常對照組。外泌體組與DOTAP ∶DOPE組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.631，P=0.000），外泌體組低于DOTAP ∶DOPE 組。相對于正常對照組，外泌體組和陽離子脂質(zhì)體組均能較好地沉默EBV-miRBART7-3p，且外泌體組瞬轉(zhuǎn)效率好于DOTAP ∶DOPE組?？梢姡淹饷隗w可經(jīng)過電穿孔方法成功將基因?qū)爰毎?，并影響其目的基因的表達。見圖6。

圖5 細胞對模型藥物和基因藥物的攝取 （×40）

圖6 3 組目的基因相對表達量比較 （±s）

3 討論

常用的合成類納米載體，如納米球、納米囊、脂質(zhì)體及膠束等因其具備小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)，在體內(nèi)能進行長效循環(huán)、可連接特異靶向分子等優(yōu)勢，已廣泛用于各種藥物的實驗性或臨床性遞送。雖然這些合成類納米載體有較好的效果，但因?qū)M織機體存在安全性低、生物相容性差及需要大規(guī)模合成等缺陷，限制其臨床應(yīng)用前景。因此，目前亟待開發(fā)更具安全性、良好生物相容性的新型納米載體。

外泌體可作為細胞間載體，攜帶生物分子在細胞間相互傳遞、交流信息等；另外，納米尺寸的外泌體也可作為載體攜帶藥物應(yīng)用于各種疾病的研究，具有廣闊的應(yīng)用潛力。本研究從天然可食用植物番茄中提取外泌體，對提取工藝進行摸索和優(yōu)化，旨在開發(fā)植物來源外泌體作為納米級藥物載體應(yīng)用于各類疾病的治療。

現(xiàn)有的外泌體分離方法主要包括多步差速離心、蔗糖密度梯度離心、試劑盒沉淀及免疫磁珠分選等。其中，試劑外泌體表面由類似于細胞膜的脂質(zhì)雙分子層組成，具有一定的疏水性，因此用外泌體提取試劑盒捆綁水分子，通過常規(guī)離心方法收集沉淀獲取外泌體。這種快速提取外泌體的方法雖然簡便快捷、樣本需求少及對設(shè)備要求低，但其分離的沉淀成分復(fù)雜，可能摻雜一些未知的疏水大分子物質(zhì)，獲得的外泌體純度并不高。相比較應(yīng)用多步差速離心和蔗糖密度梯度離心提取外泌體，成本更加低廉且可增加收率，特別是兩者結(jié)合的方法能進一步提高外泌體純度。本文應(yīng)用多步差速離心和蔗糖密度梯度離心法從食用植物番茄提取外泌體并進一步優(yōu)化工藝，減少粗提過程中外泌體的損耗，從而提高收率至1.31 g/kg。

本研究得到的外泌體相比較傳統(tǒng)納米載體系統(tǒng)，生物相容性好、利用度高且安全無毒，并能成功攜帶模型藥物和目的基因進一步應(yīng)用于各種疾病的藥物遞送系統(tǒng)研究。筆者初步進行以外泌體為載體攜帶模型藥物和目的基因，制備納米藥物，并考察不同細胞對以外泌體為載體的納米藥物攝取情況的研究，結(jié)果顯示不同細胞對所制備的納米藥物均有良好的攝取能力，說明外泌體作為藥物載體可行。

綜上所述，相比較模型藥物，外泌體攜帶目的基因進入細胞的能力更好，更加適宜作為基因載體，且以外泌體為載體的基因沉默效果優(yōu)于常用陽離子脂質(zhì)體DOTAP ∶DOPE。本研究僅開展體外細胞水平的考察，仍需體內(nèi)實驗進一步驗證。