王翎力, 金京一, 謝玉忠，2, 鄭明花

(1.延邊大學(xué) 化學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，吉林 延吉 133002；2.東北師范大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，長春 130024)

0 引 言

2016年12月，教育部發(fā)布了《國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心管理辦法》。文件明確指出，國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心是培養(yǎng)學(xué)生實(shí)踐能力和創(chuàng)新精神的重要教學(xué)基地。它的建設(shè)與運(yùn)行要服務(wù)于國家創(chuàng)新驅(qū)動(dòng)發(fā)展戰(zhàn)略，其目的在于提升大學(xué)創(chuàng)新人才培養(yǎng)能力,要求實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心要不斷有計(jì)劃更新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目和內(nèi)容，注重將科學(xué)前沿成果及時(shí)轉(zhuǎn)化為實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目，并確保綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的適當(dāng)比例。2018年年初，教育部進(jìn)一步發(fā)布《化學(xué)類專業(yè)教學(xué)質(zhì)量國家標(biāo)準(zhǔn)》，對(duì)綜合實(shí)驗(yàn)做出了明確的界定，即實(shí)驗(yàn)內(nèi)容至少跨2個(gè)以上化學(xué)二級(jí)學(xué)科，實(shí)驗(yàn)過程務(wù)必使學(xué)生接受相對(duì)系統(tǒng)的訓(xùn)練[1-2]。這2個(gè)文件的相繼出臺(tái)，對(duì)高?；瘜W(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)提出了更高的要求。

化學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心通過多年的積極探索和廣泛的同行交流，在反復(fù)的實(shí)踐中逐漸形成了化學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目建設(shè)的一些經(jīng)驗(yàn)。學(xué)校的化學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目主要來源于結(jié)合教師科研課題的本科畢業(yè)論文，科研實(shí)踐及研究性實(shí)驗(yàn)、國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃3部分。其共同特點(diǎn)是立足于學(xué)科發(fā)展前沿，以跨年級(jí)小團(tuán)隊(duì)探索為主，實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)主要源于教師的科研項(xiàng)目，偶爾會(huì)涉及到昂貴的試劑和耗材。在科研成果向綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目的具體轉(zhuǎn)化過程中，實(shí)驗(yàn)主體發(fā)生了變化，由跨年級(jí)的合作團(tuán)隊(duì)變?yōu)楸究粕鷤€(gè)體；實(shí)驗(yàn)?zāi)康陌l(fā)生了變化，從探索性研究變?yōu)橄鄬?duì)系統(tǒng)性訓(xùn)練；實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)受到了限制，實(shí)驗(yàn)場所發(fā)生了變化，從科研實(shí)驗(yàn)室變?yōu)楸究平虒W(xué)實(shí)驗(yàn)室；相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)組織方式也會(huì)帶來巨大的變化。

文章結(jié)合“吡啶-噁唑類熒光探針”實(shí)驗(yàn)，從科研課題向本科綜合實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目轉(zhuǎn)移過程，促進(jìn)科教融合，以激發(fā)學(xué)生的創(chuàng)新思維和創(chuàng)新意識(shí)為導(dǎo)向，實(shí)現(xiàn)相對(duì)系統(tǒng)培養(yǎng)學(xué)生實(shí)驗(yàn)動(dòng)手能力和綜合素質(zhì)的目標(biāo)[3-6]。

1 實(shí)驗(yàn)題目

熒光技術(shù)已發(fā)展成為分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分析化學(xué)、環(huán)境檢測和臨床診斷的有力工具，也是目前化學(xué)學(xué)科的研究熱點(diǎn)之一。小分子熒光探針可以選擇性識(shí)別小分子、離子、酶等重要分析物種，其設(shè)計(jì)和使用涉及多學(xué)科，符合化學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)開設(shè)的基本要求。化學(xué)生物學(xué)科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)長期致力與小分子熒光探針的研究，有系列的成果產(chǎn)出。但是，由于大多數(shù)的小分子熒光探針原料不易獲得、合成相對(duì)耗時(shí)、實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的污染較大，不適于轉(zhuǎn)化為綜合實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目[7-13]。比如，團(tuán)隊(duì)成員開發(fā)的基于吡啶-噻唑結(jié)構(gòu)單元(圖1中PT)的小分子熒光探針，雖然結(jié)構(gòu)簡單、性能良好，但是在合成過程中不可避免使用勞倫斯試劑或五硫化二磷等試劑。在兩輪的“專業(yè)綜合實(shí)習(xí)”環(huán)節(jié)實(shí)踐中，師生反饋的問題集中在合成過程中的刺激性氣味，不適于作為綜合實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目在本科實(shí)驗(yàn)室推廣。為解決此問題，團(tuán)隊(duì)成員進(jìn)一步開發(fā)了吡啶-噁唑類熒光分子探針(圖1中PO)，以“吡啶-噁唑類金屬離子熒光探針”，解決了這個(gè)問題，并使之適于轉(zhuǎn)化為本科的化學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。

圖1 吡啶-噻唑類(PT)和吡啶-噁唑類(PO)熒光探針的分子結(jié)構(gòu)

2 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

(1)了解過渡金屬離子檢測的意義，了解熒光探針的研究進(jìn)展和研究意義，了解小分子熒光探針的主要設(shè)計(jì)原理。

(2)掌握噁唑環(huán)的構(gòu)建方法，學(xué)會(huì)利用1H NMR等波譜手段對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。

(3)掌握熒光探針的基本表征方法，學(xué)會(huì)利用Origin等軟件對(duì)相應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合推導(dǎo)出配位常數(shù)和檢測限。

(4)掌握利用以密度泛函方法(DFT)預(yù)測分子軌道，進(jìn)一步挖掘?qū)嶒?yàn)內(nèi)涵。

3 實(shí)驗(yàn)方案

(1)文獻(xiàn)準(zhǔn)備。實(shí)驗(yàn)前，學(xué)生需要提前學(xué)習(xí)教師提供的關(guān)于小分子熒光探針的綜述性文獻(xiàn)；在此基礎(chǔ)上，利用中國知網(wǎng)、SciFinder等文獻(xiàn)檢索平臺(tái)檢索以下方面的內(nèi)容：①噁唑類化合物的合成方法；②鋅離子的檢測意義及其熒光探針研究進(jìn)展；③汞離子的檢測意義及其熒光探針研究進(jìn)展。

(2)合成。本實(shí)驗(yàn)包括兩個(gè)吡啶-噁唑類化合物的合成，如圖2所示。其中，兩名同學(xué)各自分別合成5-苯基-2-(2-吡啶基)噁唑(PO-A)和4-苯基-2-(2-吡啶基)噁唑(PO-B)，并利用1H NMR譜圖表征中間體1和目標(biāo)產(chǎn)物PO的結(jié)構(gòu)。

a.NH2CH(R1)CH(R2)OH,t-BuOH,K2CO3,I2,70 ℃;b.DDQ,CH2Cl2,rt.

(3)光譜測試。測定測試PO的紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜，進(jìn)而考查多種金屬離子對(duì)PO分子熒光發(fā)射行為的影響，判斷熒光探針對(duì)金屬離子的選擇性。以Job法確定PO與特定金屬離子的配位比，在此基礎(chǔ)上，結(jié)合熒光滴定實(shí)驗(yàn)采集的數(shù)據(jù)，通過Origin軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合得到相應(yīng)的絡(luò)合常數(shù)和檢測限。

(4)理論計(jì)算。利用Gaussian程序包，以DFT方法預(yù)測PO的分子軌道，分析熒光產(chǎn)生的原因，進(jìn)一步討論P(yáng)O-A和PO-B兩個(gè)結(jié)構(gòu)高度類似的分子對(duì)不同金屬離子產(chǎn)生特定響應(yīng)的原因。

4 實(shí)驗(yàn)步驟

4.1 合成

化合物1的合成：10 mL叔丁醇中加入β-氨基乙醇(156.7 mg，1.16 mmol)和100 μL的2-吡啶甲醛(1.05 mmol)。室溫下攪拌溶解后，向體系中分批加入500 mg的碘和440 mg的碳酸鉀。加熱升溫，緩慢回流18 h后，加入亞硫酸鈉水溶液終止反應(yīng)。二氯甲烷萃取3次。有機(jī)相合并，飽和食鹽水洗滌1次后，無水硫酸鈉干燥。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀移除有機(jī)溶劑后，殘余物以乙酸乙酯為洗脫劑快速柱層析，得到化合物1。采集化合物1A和1B的1H NMR數(shù)據(jù)，與文獻(xiàn)對(duì)比，確認(rèn)結(jié)構(gòu)[14]。

化合物PO的合成：3 mL二氯甲烷中加入100 mg的化合物1(0.446 mmol)，攪拌至充分溶解后，加入125 mg的0.5 nm分子篩。室溫下，向體系中分批加入DDQ(6×30 mg)。攪拌24 h后，加入15 mL的10 %氫氧化鈉溶液停止反應(yīng)。二氯甲烷萃取3次。有機(jī)相合并，飽和食鹽水洗滌1次后，無水硫酸鈉干燥。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀移除有機(jī)溶劑后，殘余物以二氯甲烷為洗脫劑快速柱層析，得到化合物PO。采集化合物PO-A和PO-B的1H NMR數(shù)據(jù)，與文獻(xiàn)對(duì)比，確認(rèn)結(jié)構(gòu)[15]。

4.2 光譜測試

PO的吸收和熒光光譜：分別測定PO-A和PO-B在乙腈溶液的吸收(10.0 μM)和熒光光譜(1.0 μM)，如圖3。

圖3 吡啶-噁唑類探針PO-A(實(shí)線)和PO-B(虛線)在乙腈溶液的吸收(黑色線)和熒光光譜(紅色線)。其中，PO-A和PO-B的熒光光譜的激發(fā)波長分別為300 和330 nm。

多種金屬離子對(duì)PO熒光光譜的影響：測定探針PO(1.0 μM)在不同種類的金屬離子(10.0 eq)存在下的熒光光譜，如圖4。從圖4可以看出，只有Zn(II)離子能夠使PO-A的熒光發(fā)射波長從399 nm紅移至443 nm；只有Hg(II)離子能顯著降低PO-B在403 nm處的熒光發(fā)射信號(hào)。因此，初步判定PO-A是Zn(II)的比率型熒光探針，PO-B是Hg(II)的“開-關(guān)”型熒光探針。

(a)

(b)

圖4 金屬離子對(duì)PO-A(a)和PO-B(b)的熒光光譜的作用。紅色為探針PO的熒光光譜。

等摩爾系列法(Job法)：固定PO探針的濃度和待測金屬離子濃度的總濃度([PO]+[M])為10.0 μmol/L，分別測定濃度為0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 μmol/L情況下的體系的吸收光譜。以Job法做圖，可以確定PO-A和鋅離子的配位比為1∶1，PO-B和汞離子的配位比為1∶1[13]。

熒光滴定實(shí)驗(yàn)：固定PO探針的濃度為1.0 μmol/L，分別測定不同當(dāng)量的鋅離子對(duì)PO-A熒光的影響和不同當(dāng)量的汞離子對(duì)PO-B熒光的影響，得到圖5(a)和圖5(b)。

5 結(jié)果與討論

5.1 探針與特定金屬離子絡(luò)合常數(shù)的擬合

測試體系中存在探針PO與金屬離子的配位平衡。根據(jù)比爾定律，建立各個(gè)熒光發(fā)射峰的強(qiáng)度與對(duì)應(yīng)物種濃度間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。如，對(duì)于探針PO-A來說，體系在443 nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度F對(duì)應(yīng)于體系中與鋅離子配位的PO-A(PO-A-Zn)的濃度，該波長處的最大熒光發(fā)射強(qiáng)度Fmax對(duì)應(yīng)于體系中配合物PO-A-Zn的最大濃度?？鄢w系在未引入鋅離子時(shí)在443 nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度Fmin，可以推導(dǎo)出體系中未配位的PO-A的濃度(α)可以由(F-Fmin)/(Fmax-Fmin)來表示。PO-A與Zn(II)的絡(luò)合常數(shù)Kas可以由下式表示[10]:

(a)

(b)

圖5 (A)探針PO-A的鋅離子熒光滴定圖；(B)探針PO-B的汞離子熒光滴定圖。

Kas=[PO-A-Zn]/([PO-A][Zn(II)])=

(1-α)/α[Zn(II)]

(1)

以log[Zn(II)]為橫坐標(biāo)，以(F-Fmin)/(Fmax-Fmin)為縱坐標(biāo)，對(duì)熒光滴定數(shù)據(jù)進(jìn)一步處理，得到圖6(a)的星狀數(shù)據(jù)。按式(1)，用最小二乘法進(jìn)行擬合，得到PO-A與鋅離子的絡(luò)合常數(shù)為2.23×106(mol/L)-1，檢測限為0.8 μmol/L。

按照相似的方法，對(duì)PO-B與汞離子的熒光滴定實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，擬合得到PO-B與汞離子的絡(luò)合常數(shù)為0.548×106(mol/L)-1，檢測限為2.2 μmol/L。

5.2 理論計(jì)算

利用Gaussian 09程序包，以DFT方法計(jì)算探針PO的分子軌道。在計(jì)算結(jié)果中，分別找到PO分子的能量最高占據(jù)軌道(HOMO)和能量最低未占據(jù)軌道(LUMO)，得到圖7所示的結(jié)果。

對(duì)圖7所示的電子云密度圖進(jìn)行分析討論，可以得到以下推論：①兩個(gè)探針分子的HOMO軌道電子云主要集中在苯環(huán)和噁唑環(huán)，LUMO軌道電子云集中在吡啶環(huán)和噁唑環(huán)；②探針分子PO的結(jié)構(gòu)中，苯環(huán)可以認(rèn)為是給電子基團(tuán)(D)，噁唑環(huán)是橋(spacer)，吡啶是吸電子基團(tuán)(A)。這種D-π-A結(jié)構(gòu)是熒光分子的典型特征；③在光激發(fā)下，電子從HOMO到LUMO的躍遷時(shí)，電子云從HOMO軌道的富電子區(qū)域(苯環(huán))向LUMO軌道的富電子區(qū)域(吡啶環(huán))發(fā)生轉(zhuǎn)移。這種分子內(nèi)的電荷轉(zhuǎn)移機(jī)制(ICT)正是探針PO分子的熒光起源[16]。

(a)

(b)

圖7 探針分子PO-A和PO-B的HOMO和LUMO軌道的電子云密度圖。B3LYP/6-31G(d，p)水平上由Gaussian 09預(yù)測?；疑禾荚樱凰{(lán)色：氮原子；紅色：氧原子；出于圖像簡潔考慮，省略了氫原子。

學(xué)生可以進(jìn)一步思考，只是苯基在噁唑環(huán)上的取代位置不同，為什么PO-A是鋅離子的熒光探針，而PO-B是汞離子的熒光探針。

7 結(jié) 語

綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目以吡啶-噁唑類熒光探針的研究為主線，涵蓋了有機(jī)合成、儀器分析、計(jì)算化學(xué)等多個(gè)二級(jí)學(xué)科的相關(guān)內(nèi)容，比較全面地訓(xùn)練了本科生的化學(xué)實(shí)驗(yàn)操作技能，綜合性強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目系統(tǒng)性地整合了實(shí)驗(yàn)教學(xué)和理論研究的內(nèi)容，合理拓展了學(xué)生的理論研究能力，符合學(xué)生的研究能力的漸進(jìn)培養(yǎng)的思路。實(shí)驗(yàn)所需儀器是化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的必備儀器，試劑藥品來源廣泛。具有基礎(chǔ)化學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)芰Φ谋究粕梢韵鄬?duì)獨(dú)立自主完成全部實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，可操作性強(qiáng)。同時(shí),實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目設(shè)置了具有高度開放性的思考題，鼓勵(lì)學(xué)生進(jìn)一步探索和思考現(xiàn)象背后的本質(zhì)，有助于培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新思維?？蒲姓n題向本科綜合實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的轉(zhuǎn)移和固化過程中，需要考慮綜合性、系統(tǒng)性、可操作性、開放性4個(gè)基本要素，如此才能實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)培養(yǎng)學(xué)生實(shí)驗(yàn)動(dòng)手能力和綜合素質(zhì)的目標(biāo)，激發(fā)學(xué)生的創(chuàng)新思維和創(chuàng)新意識(shí)。