董文科， 馬 祥， 張玉娟， 郭 睿， 張兆恒， 張 巖， 馬暉玲*

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院， 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室， 中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070； 2. 青藏高原優(yōu)良牧草種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院， 青海 西寧 810016)

低溫脅迫是一種常見的環(huán)境脅迫因子，是影響植物生長發(fā)育和地理分布最主要的因素之一[1]。植物在受到低溫脅迫時，其細(xì)胞膜系統(tǒng)遭到損傷，礦質(zhì)營養(yǎng)吸收受到影響，生物合成速率降低，光能吸收減少，許多生理代謝功能受阻，嚴(yán)重時可導(dǎo)致植株死亡[2-3]。草地早熟禾(Poapratensis)是優(yōu)良的禾本科牧草，也是城市草坪建植中主要使用的冷季型草坪草，廣泛用于草坪建設(shè)以及生態(tài)環(huán)境治理[4]。但低溫是影響草地早熟禾綠期和越冬的主要環(huán)境因素，若冬季溫度較低或春秋季受寒流侵襲，會出現(xiàn)無法越冬、春季返青慢和秋季早衰等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響草坪的美觀[5]。青海扁莖早熟禾(Poapratensisvar.ancepscv. Qinghai)是草地早熟禾的一個變種，是青藏高原分布最廣的優(yōu)質(zhì)牧草之一，其抗寒、耐旱，抗逆性強(qiáng)，在零下35℃的低溫下能安全越冬，適合在海拔3 000 m以上、年降雨量400 mm的高寒牧區(qū)種植[6]。青海扁莖早熟禾葉量多、草質(zhì)柔嫩、營養(yǎng)豐富、適口性好，是家畜的優(yōu)良飼草；其根系強(qiáng)壯發(fā)達(dá)、易形成草皮、固土能力強(qiáng)，在青藏高原高寒地區(qū)生態(tài)環(huán)境治理、水土保持中也發(fā)揮著重要作用[7]。目前，對于青海扁莖早熟禾低溫應(yīng)答機(jī)制的研究大多集中在生理生化方面，而植物對低溫等逆境脅迫的調(diào)節(jié)和適應(yīng)是一個綜合的反應(yīng)，涉及基因調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)、翻譯后修飾和代謝物反饋等多個生物學(xué)水平的系統(tǒng)調(diào)節(jié)。因此，更為深入的探究青海扁莖早熟禾對低溫脅迫的響應(yīng)機(jī)制，可以為后續(xù)的抗寒基因挖掘和草坪草分子育種工作提供有力支持。

糖是植物光合作用的主要產(chǎn)物，也是呼吸作用的底物，它為植物細(xì)胞的構(gòu)建和耗能提供碳骨架和能源，同時具有調(diào)控代謝、抵抗環(huán)境脅迫和影響生長發(fā)育等重要作用[8]。糖類的代謝是生物體代謝的中心，它連通了核酸代謝、蛋白質(zhì)代謝、脂類代謝及次生代謝等多個代謝途徑[9]。其中，糖酵解途徑是糖類代謝的一個重要過程，在高等植物中的主要作用是氧化蔗糖產(chǎn)生ATP、NADH和丙酮酸[10]。該途徑與植物響應(yīng)溫度、干旱和鹽堿等非生物脅迫相關(guān)[11]。在非生物脅迫下，植物體內(nèi)的果糖通過糖酵解途徑分解為丙酮酸時需要多種酶催化，這些酶不僅起到催化反應(yīng)和能量調(diào)節(jié)器的作用，而且還能作為信號傳導(dǎo)裝置響應(yīng)環(huán)境變化[12]。本實(shí)驗(yàn)室前期將抗寒性強(qiáng)的青海扁莖早熟禾和對低溫敏感的商用草地早熟禾‘巴潤’(Poapratensis′Baron′)進(jìn)行低溫處理后用轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法分析了這兩種早熟禾品種對低溫脅迫的分子響應(yīng)機(jī)制，并對這兩個品種特有的差異表達(dá)基因進(jìn)行富集分析發(fā)現(xiàn)，青海扁莖早熟禾在糖酵解/糖異生途徑富集較多，而草地早熟禾‘巴潤’在此途徑無差異表達(dá)基因富集。因此，本研究繼續(xù)以草地早熟禾‘巴潤’作為對照，對青海扁莖早熟禾糖酵解途徑相關(guān)物質(zhì)及調(diào)控基因與其抗寒性的關(guān)系進(jìn)行初步研究，旨在揭示青海扁莖早熟禾抗寒性與糖酵解途徑的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料青海扁莖早熟禾(PQ)由青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院提供；商用品種草地早熟禾‘巴潤’(PB)由北京克勞沃草業(yè)技術(shù)開發(fā)中心提供。

1.2 材料培養(yǎng)與處理

本試驗(yàn)于2018年9-11月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院培養(yǎng)室中進(jìn)行，選取顆粒飽滿、健康的早熟禾種子，經(jīng)20% NaClO消毒后，均勻播種在直徑25 cm、高20 cm的育苗缽中，基質(zhì)為營養(yǎng)土和蛭石的混合物(2:1)。在人工培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，晝夜溫度為(25±1)℃；時長為白天16 h，夜晚8 h；光照強(qiáng)度為500 μmol·(m2·s)-1；相對濕度60%～70%。待幼苗長至10 cm左右時進(jìn)行間苗，每盆留下長勢一致的30株幼苗進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

待幼苗長出4～5片真葉時進(jìn)行低溫處理。將每個材料長勢一致的幼苗放置在0℃的低溫光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫處理(除溫度外其他培養(yǎng)條件同處理前)，采集低溫脅迫處理0 h，1 h，3 h，6 h，12 h，24 h，48 h，72 h和 120 h后的葉片樣品，用于生理指標(biāo)和基因相對表達(dá)量的測定。試驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，同時設(shè)常溫對照(25±1)℃。

1.3 測定指標(biāo)及方法

細(xì)胞膜傷害率=[(ET-ECK)/(100-ECK)]×100%

式中，ET為低溫處理下樣品的相對電導(dǎo)率，ECK為常溫對照樣品的相對電導(dǎo)率。

1.3.2糖含量測定 可溶性糖含量采用蒽酮比色法[13]測定；蔗糖和果糖含量參照劉麗杰[15]的方法測定。

1.3.3丙酮酸含量測定 丙酮酸(Pyruvic acid,Pyr)的提取和測定參照孟德義[12]的方法。

1.3.4己糖激酶活性測定 己糖激酶(Hexokinase,HxK)粗酶液的提取和測定參照Schaffer等[16]的方法。

1.3.5磷酸果糖激酶活性測定 磷酸果糖激酶(Phosphofructokinase,PFK)粗酶液的提取和測定參照Mustroph[17]的方法。

1.3.6丙酮酸激酶活性測定 丙酮酸激酶(Pyruvatekinase,PK)粗酶液的提取和測定參照孟德義[12]的方法。

1.3.7總RNA的提取及糖酵解關(guān)鍵酶調(diào)控基因表達(dá)分析 采用TIANGEN公司的RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒提取葉片總RNA，采用Solarbio公司的PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，肌動蛋白基因Actin為內(nèi)參[18]，用LightCycler 96實(shí)時熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時熒光定量分析，試驗(yàn)設(shè)置3個重復(fù)。肌動蛋白基因(PpActin)、己糖激酶基因(PpHxK)、磷酸果糖激酶基因(PpPFK)和丙酮酸激酶基因(PpPK)的引物序列根據(jù)NCBI的同源序列進(jìn)行比對，用Premier 6.0設(shè)計基因特異性引物(表1)。實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL，采用兩步法擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min,然后95℃變性15 s，60℃退火30 s，40個循環(huán)。用2-ΔΔCt法[19]計算各基因的相對表達(dá)量。

當(dāng)選取合適的反應(yīng)級數(shù)n時,對lnk*與1/T進(jìn)行線性擬合,由直線的斜率和截距即可得到樣品動力學(xué)參數(shù)E和A,實(shí)現(xiàn)動力學(xué)求解。

表1 qRT-PCR引物序列信息Table 1 Primer sequence information of qRT-PCR

1.4 數(shù)據(jù)分析

SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用單因素ANOVA進(jìn)行分析處理，Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性方差分析；采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行繪圖與數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對相對電導(dǎo)率和細(xì)胞膜傷害率的影響

如圖1A所示，隨著低溫脅迫的持續(xù)，PQ和PB的相對電導(dǎo)率不斷上升，其中PB的相對電導(dǎo)率呈直線上升趨勢，在脅迫120 h時較常溫對照提高了3.53倍；PQ的相對電導(dǎo)率在整個低溫脅迫時期均顯著低于PB (P<0.05)，且呈先上升后趨于平緩最后再上升的趨勢，在120 h時與常溫對照相比，僅提高了1.39倍。低溫脅迫下，PQ和PB細(xì)胞膜傷害率的變化趨勢和相對電導(dǎo)率相似(圖1B)，在120 h時PQ的細(xì)胞膜傷害率最大為28.02%，而PB最大為73.95%，是PQ的2.64倍。

2.2 低溫脅迫對糖及丙酮酸含量的影響

2.2.1對可溶性糖含量的影響 如圖2A所示，隨著低溫脅迫的持續(xù)，PQ和PB的可溶性糖含量均呈先上升后下降的趨勢。PB在脅迫12 h時可溶性糖含量達(dá)到最大，較PB常溫對照處理提高了0.44倍，12 h后逐漸降低；而PQ的可溶性糖含量在48 h時達(dá)到最大，較PQ常溫對照處理提高了1.86倍，此后呈降低趨勢，但整體維持在一個較高水平?？傮w來看，在整個低溫處理過程中，PQ的可溶性糖含量均顯著高于PB (P<0.05)。

2.2.2對蔗糖含量的影響 如圖2B所示，低溫脅迫下，PQ的蔗糖含量呈持續(xù)上升趨勢，在72 h時達(dá)到最大，較PQ常溫對照處理提高了2.29倍，隨后呈下降趨勢，但下降幅度較??；PB的蔗糖含量在低溫脅迫下0～6 h時雖有提高，但提高幅度較??；6 h后PB的蔗糖含量顯著提高(P<0.05)，在24 h時達(dá)到最大值，較PB常溫對照處理提高了51.68%，隨后雖在72 h時有小幅度上升，但整體呈下降趨勢。同時，PB的蔗糖含量在整個低溫脅迫時期均顯著低于PQ (P<0.05)。

圖1 低溫脅迫對兩種早熟禾葉片相對電導(dǎo)率和細(xì)胞膜傷害率的影響Fig. 1 Effects of low temperature stress on relative conductivity and cell membrane injury rate of two bluegrass leaves注：同一脅迫時間下不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。下同Note：Different lowercase letters in same stress time indicate significant difference at 0.05 level. The same as below

2.2.3對果糖含量的影響 如圖2C所示，低溫脅迫下0 ～ 6 h時，PQ的果糖含量雖有上升，但上升幅度較?。? h后PQ的果糖含量顯著提高(P<0.05)，并隨著低溫脅迫的持續(xù)呈上升趨勢，在72 h時達(dá)到最大值，較PQ常溫對照處理提高了68.61%，隨后呈下降趨勢；PB的果糖含量隨著低溫脅迫的持續(xù)雖有所上升，但整體變化趨于平緩，在48 h時達(dá)到最大值，但僅較PB常溫對照處理提高了8.38%。在整個低溫處理過程中，PQ的果糖含量均顯著高于PB (P<0.05)。

2.2.4對蔗糖和果糖總和占可溶性糖比例的影響 對PQ和PB在低溫脅迫下蔗糖和果糖總和占可溶性糖比例進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)(圖2D)，低溫脅迫下0 ～ 3 h，PQ的蔗糖和果糖總和占可溶性糖比例呈下降趨勢，3 h后呈上升趨勢，并在12 h時達(dá)到第一個峰值，隨后呈先降后升再降的趨勢，在72 h時達(dá)到最大比例，為57.49%，較PQ常溫對照的比例提高了25.83%；低溫脅迫下，PB的蔗糖和果糖總和占可溶性糖比例在0 ～ 6 h時呈下降趨勢，在6 h時達(dá)到最低，并顯著低于PB常溫對照(P<0.05)；在6 ～ 24 h時呈上升趨勢，24～48 h又下降，48 h后又呈上升趨勢。總體來看，PB的蔗糖和果糖總和占可溶性糖的平均比例低于常溫對照，也低于PQ。

圖2 低溫脅迫對兩種早熟禾葉片糖含量的影響Fig.2 Effects of low temperature stress on sugar content of two bluegrass leaves

2.2.5對丙酮酸含量的影響 如圖3所示，低溫脅迫下0 ～ 6 h時，PQ的丙酮酸含量雖有上升但幅度較小，6 h后迅速上升，并在72 h時達(dá)到最大值，較PQ常溫對照處理提高了46.43%，而在120 h時丙酮酸含量呈迅速下降趨勢；與PQ相似，PB的丙酮酸含量在低溫脅迫下0 ～ 6 h時雖有上升但幅度較小，隨后上升幅度較大，在24 h時達(dá)到峰值，但僅較PB常溫對照處理提高了9.99%，此后呈下降趨勢。在整個低溫處理過程中，除0 ～ 1 h時PB的丙酮酸含量略高于PQ外，其余時間下均顯著低于PQ (P<0.05)。

圖3 低溫脅迫對兩種早熟禾葉片丙酮酸含量的影響Fig. 3 Effects of low temperature stress on pyruvic acid content of two bluegrass leaves

2.3 低溫脅迫對糖酵解途徑關(guān)鍵酶活性的影響

2.3.1對己糖激酶活性的影響 由圖4A可知，低溫脅迫下0 ～ 1 h時，PQ的己糖激酶活性迅速升高，并在3 h時達(dá)到第一個峰值，在3 ～ 6 h時又呈下降趨勢，6 h后又迅速升高，并在48 h時達(dá)最大值，較PQ常溫對照處理提高了48.98%，此后呈下降趨勢，但整體維持在一個較高水平；PB的己糖激酶活性隨脅迫時間的延長呈先升后降的趨勢，也在48 h時達(dá)最大值，較PB常溫對照處理提高了13.26%。總體來看，PQ的己糖激酶活性在整個脅迫過程中均顯著高于PB (P<0.05)。

2.3.2對磷酸果糖激酶活性的影響 由圖4B可知，PQ的磷酸果糖激酶活性在低溫脅迫下1 h內(nèi)迅速上升，并隨脅迫時間的延長持續(xù)上升，在120 h時達(dá)到最大值，此時較PQ常溫對照處理提高了58.74%；PB的磷酸果糖激酶活性在0 ～ 12 h時呈上升趨勢，并在12 h時達(dá)到最大，較PB常溫對照處理提高了15.22%，此后隨在72 h時有小幅上升，但整體呈下降趨勢。在整個低溫處理過程中，除0 h時PB的磷酸果糖激酶活性顯著高于PQ (P<0.05)外，其余均顯著低于PQ (P<0.05)。

2.3.3對丙酮酸激酶活性的影響 由圖4C可知，PQ的丙酮酸激酶活性在低溫脅迫下0 ～ 3 h時雖有上升，但上升幅度較小，3 h后顯著升高，并在48 h時達(dá)最大值，較PQ常溫對照處理提高了1.63倍，隨后呈逐漸下降趨勢；PB的丙酮酸激酶活性在低溫脅迫下0 ～ 1 h時呈下降趨勢，隨后呈先升后降的趨勢，在24 h時達(dá)到最大值，此時較PB常溫對照處理提高了56.52 %，此后在72 h時迅速下降，并且其活性顯著低于PQ常溫對照(P<0.05)。同時，PB的丙酮酸激酶活性在整個低溫脅迫時期均顯著低于PQ (P<0.05)。

2.4 低溫脅迫對糖酵解途徑關(guān)鍵酶調(diào)控基因表達(dá)的影響

2.4.1對PpHxK表達(dá)變化的影響 由圖5A可知，PQ的PpHxK相對表達(dá)量在低溫脅迫處理0 ～ 1 h時迅速上調(diào)，到達(dá)第一個峰值，1 ～ 3 h時呈下降趨勢，3 h時后又呈上調(diào)趨勢，在6 ～ 12 h時迅速上調(diào)，至48 h時達(dá)到第二個峰值，此時PQ的PpHxK相對表達(dá)量較常溫對照上調(diào)了2.53倍，此后呈逐漸下降趨勢，72 ～ 120 h時降幅較大；PB的PpHxK相對表達(dá)量在低溫脅迫下0 ～ 3 h時呈上升趨勢，3 ～ 6 h小幅下降，6 h后總體呈上升趨勢，在72 h時表達(dá)量最高，此時PB的PpHxK相對表達(dá)量僅較PB常溫對照提高了0.17倍?？傮w來看，PQ的PpHxK相對表達(dá)量在整個脅迫過程中均顯著高于PB (P<0.05)。

2.4.2對PpPFK表達(dá)變化的影響 由圖5B可知，PQ的PpPFK相對表達(dá)量在低溫脅迫開始時迅速上升，在3 h時到達(dá)第一個峰值，此時PpPFK相對表達(dá)量較常溫對照上調(diào)了1.85倍；3 ～ 6 h時有小幅度下降，6 h后又呈上升趨勢，在24 h時達(dá)到第二個峰值，此時PpPFK相對表達(dá)量較常溫對照上調(diào)了2.47倍；72 h時達(dá)到第三個峰值，PpPFK相對表達(dá)量較常溫對照上調(diào)了2.43倍，此后呈下降趨勢；PQ的PpPFK相對表達(dá)量隨脅迫的持續(xù)，呈先上升后下降的趨勢，在6 h時達(dá)最大值，僅較PB常溫對照上調(diào)了0.81倍，在120 h時達(dá)到最低，并顯著低于PB常溫對照(P<0.05)。而PQ的PpPFK相對表達(dá)量在整個脅迫過程中均顯著高于PB (P<0.05)。

2.4.3對PpPK表達(dá)變化的影響 由圖5C可知，隨著低溫脅迫的持續(xù)，PQ的PpPK相對表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢，在24 h時達(dá)到最大，此時PpPK相對表達(dá)量較PQ常溫對照上調(diào)了2.06倍；PB的PpPK相對表達(dá)量隨脅迫的持續(xù)呈先上升后下降再上升的趨勢，在48 h時達(dá)最大，其相對表達(dá)量較PB常溫對照僅上調(diào)了0.58倍。與PpHxK和PpPFK的相對表達(dá)量相似，PQ的PpPK相對表達(dá)量在整個脅迫過程中均顯著高于PB (P<0.05)。

圖4 低溫脅迫對兩種早熟禾葉片糖酵解途徑關(guān)鍵酶活性的影響Fig.4 Effects of low temperature stress on the activities of key enzymes in glycolysis pathway of two bluegrass leaves

圖5 低溫脅迫對兩種早熟禾葉片糖酵解途徑關(guān)鍵酶編碼基因表達(dá)的影響Fig.5 Effects of low temperature stress on the gene expression of key enzymes in glycolysis pathway of two bluegrass leaves

3 討論

低溫脅迫下，植物體內(nèi)可溶性碳水化合物的含量增加，在一定程度上可以緩解低溫對植物細(xì)胞的損傷?？扇苄蕴妓衔锓e累提高植物抗寒性的三個主要原因：一是通過糖類物質(zhì)的代謝與積累提高植物滲透調(diào)節(jié)能力，保持低溫脅迫下體內(nèi)良好的水分狀況；二是糖類物質(zhì)能夠有效保護(hù)生物膜及生物大分子物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性；三是糖類物質(zhì)的代謝與積累可以產(chǎn)生能源并為其他保護(hù)性物質(zhì)提供合成基礎(chǔ)[20]。在這些碳水化合物中可溶性糖含量與植物抗寒性關(guān)系最為密切，通?？扇苄蕴堑姆e累可以提高植物的抗寒性[21]。本研究中，低溫脅迫均會引起PQ(青海扁莖早熟禾)和PB(草地早熟禾‘巴潤’)可溶性糖含量的升高，但PQ在整個脅迫過程中的含量以及較常溫對照的上升幅度均高于PB，這也與PQ表現(xiàn)較強(qiáng)的抗寒性有直接關(guān)系。王淑杰等[22]對不同抗寒性的葡萄(Vitisvinifera)品種進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，抗寒性強(qiáng)的葡萄品種其可溶性糖含量均高于抗寒性弱的品種，但不同品種的可溶性糖含量隨溫度的降低均有上升，只是上升幅度存在差異，這與本研究結(jié)果相似。植物體內(nèi)可溶性糖種類較多，不同種類的可溶性糖都可以參與調(diào)節(jié)生物膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，但不同品種的植物在低溫脅迫下積累的可溶性糖種類也存在較大差異，如擬南芥(Arabidopsisthaliana)在低溫脅迫下積累較多的為棉子糖[23]；小麥(Triticumaestivum)和黑麥(Secalecereale)幼苗中的蔗糖和果糖含量在低溫脅迫下會迅速升高[24-25]；而水稻(Oryzasativa)中阿拉伯糖、蔗糖和果糖含量會得到顯著積累[26]。在本研究中，PQ和PB在低溫脅迫開始時蔗糖含量就有顯著升高，并且PQ的上升幅度顯著高于PB，說明在整個脅迫過程中蔗糖的積累主要影響這兩種早熟禾的抗寒性；而對于果糖，在低溫脅迫初期，PQ中的含量上升幅度較小，直至后期才顯著升高；在PB中的含量雖隨低溫脅迫的持續(xù)有所上升，但整體變化趨于平緩，說明果糖積累對PQ抗寒性的影響主要體現(xiàn)在后期，但對于PB的影響小于蔗糖。

糖酵解途徑是呼吸代謝和糖分分解的一個重要過程，植物在逆境條件下需要消耗大量的能量來提高抗性，而能量主要在糖酵解途徑產(chǎn)生，糖酵解途徑中己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶是三種最關(guān)鍵的不可逆酶[27]。己糖激酶催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖在己糖異構(gòu)酶的作用下生成6-磷酸果糖，隨后在磷酸果糖激酶作用下生成1,6-二磷酸果糖，最后在丙酮酸激酶作用下使磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸和ATP[28]。研究表明，低溫脅迫下糖酵解途徑中的這三種酶活性變化趨勢在不同植物中并不相同[29]。曹玉芳等[30]研究發(fā)現(xiàn)，青檀(Pteroceltistatarinowii)中磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶對低溫較為敏感，經(jīng)冷馴化后這兩種酶活性的提高可以增強(qiáng)青檀對低溫脅迫的適應(yīng)性。但李霞等[31]研究發(fā)現(xiàn)，隨溫度的降低，甜櫻桃(Prunusavium)糖酵解途徑速率呈減低趨勢。此外，Dioxon等[32]對馬鈴薯(Solanumtuberosum)塊莖中糖酵解途徑進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯塊莖中丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶在低溫貯藏條件下活性均顯著降低，其中磷酸果糖激酶有較高的低溫敏感性。而本研究發(fā)現(xiàn)，在低溫初期，PQ的己糖激酶和磷酸果糖激酶活性均顯著升高，而丙酮酸激酶活性在脅迫后期顯著升高，三種酶總體呈先上升后下降的趨勢；與PQ相同，PB的己糖激酶和磷酸果糖激酶活性雖也呈先升后降趨勢，但上升幅度均小于PQ；同時，PB的丙酮酸激酶活性在低溫脅迫初期較為敏感，呈下降趨勢，而后期隨低溫脅迫時間的延長又呈先升后降的趨勢，但其活性總體任低于PQ。糖酵解關(guān)鍵酶基因?qū)Φ蜏孛{迫的響應(yīng)存在時間上的特異性，這種響應(yīng)變化可能是植物對滲透脅迫期和滲透平衡恢復(fù)期分段適應(yīng)的表現(xiàn)。本研究對調(diào)控這三種關(guān)鍵酶的基因表達(dá)情況分析發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下兩種早熟禾的糖酵解關(guān)鍵酶基因的相對表達(dá)量均有提高，但不同時期表達(dá)量不同，而其中PQ中的相對表達(dá)量均顯著高于PB，也說明PQ的糖酵解代謝能力強(qiáng)于PB。

4 結(jié)論

本研究表明，低溫脅迫可以導(dǎo)致青海扁莖早熟禾和草地早熟禾‘巴潤’葉片相對電導(dǎo)率和細(xì)胞膜傷害率的增加，但青海扁莖早熟禾的細(xì)胞膜損傷程度顯著低于草地早熟禾‘巴潤’。同時，低溫脅迫均可引起兩種早熟禾體內(nèi)糖類代謝的變化，但整體來看，青海扁莖早熟禾中糖類及丙酮酸含量、糖酵解途徑關(guān)鍵酶活性以及糖酵解途徑關(guān)鍵酶基因的相對表達(dá)量均顯著高于草地早熟禾‘巴潤’。綜上所述，低溫環(huán)境下青海扁莖早熟禾能夠有效調(diào)控糖酵解代謝途徑來促進(jìn)糖類及其相關(guān)物質(zhì)的積累與分解，以調(diào)節(jié)植物因環(huán)境因素而引起的滲透勢變化，并為植物體提供能量和次級代謝產(chǎn)物的合成前體。因此，青海扁莖早熟禾體內(nèi)糖酵解代謝途徑與其耐寒性存在一定關(guān)系。