王傳旗， 付娟娟， 劉敏潔， 周青平， 苗彥軍

(1. 青海大學畜牧獸醫(yī)科學院， 青海 西寧 810016； 2. 西藏農(nóng)牧學院， 西藏 林芝 860000； 3. 西北農(nóng)林科技大學， 陜西 楊凌 712100； 4. 西南民族大學，四川 成都 610041)

隨著錳、鉛、銅、鋁等金屬礦產(chǎn)資源的開采和利用，我國在醫(yī)療、航天等領域得到了快速發(fā)展，但是帶來了當?shù)氐闹亟饘傥廴締栴}。金屬離子可對礦區(qū)周邊土壤、空氣、水體甚至植被產(chǎn)生污染，進而危害動物和人類的身體健康。因此，對重金屬污染的治理研究具有重要的現(xiàn)實意義。西藏中部礦產(chǎn)資源豐富，銅的儲量居全國第2位[1]。銅雖然是植物生長所必需的微量元素，但過量的銅會使植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的自由基和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)，抑制植物生長[2-3]。鋅也是植物生長所必需的微量元素，但土壤中Zn2+含量過多時，也會對植物產(chǎn)生毒害作用[4-5]。由于以往對西藏中部礦區(qū)的不合理開采，使得礦區(qū)周邊的土壤、水體和植被受到了不同程度的金屬污染，也給當?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境造成了較大的影響。在藏中礦區(qū)周邊的污染土壤中，銅和鋅常作為共存體對植物產(chǎn)生危害作用[6]。西藏地處高原，外來植物難以適應高原環(huán)境。因此，需要發(fā)掘鄉(xiāng)土植物對藏中污染的土壤和植被進行修復。

植物修復技術是通過植物根系將土壤中的重金屬元素吸收到植物的地上部分，然后將其收獲并將它們無害化處理[7-10]。該技術可避免當?shù)丨h(huán)境的二次污染，且成本較低，已成為我國重金屬污染修復的研究熱點[11-12]。有關牧草耐金屬脅迫的研究，國內(nèi)己有一些報道：趙玉紅等[13]研究認為銅對珠芽蓼(PolygonumviviparumL.)幼苗生長的抑制作用比鋅更顯著；宣毓龍等[14]研究表明低濃度的鋅有利于黑小麥(SecalecerealeL.)種子萌發(fā)；徐雅梅等[15]研究表明Mn2+，Pb2+脅迫對垂穗披堿草胚根及胚芽均具有抑制作用。鑒于藏中礦區(qū)土壤污染狀況，本試驗選擇當?shù)乜鼓嫘暂^強的垂穗披堿草為研究對象，測定了垂穗披堿草在Cu2+，Zn2+處理下的相關指標。試驗結果可為研究垂穗披堿草對重金屬脅迫的響應機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

野生垂穗披堿草種子采自西藏那曲市巴青縣地區(qū)(31°53′57″ N，93°10′44″ E，海拔4 675 m)，之后在西藏農(nóng)牧學院牧草試驗基地(29°40′26″ N，94°20′30″ E，海拔2 999 m)進行馴化選育。試驗材料為野生馴化品系。

1.2 試驗方法

1.2.1試驗設計 選取健康的種子，用70%的無水乙醇溶液消毒2 min，之后用超純水沖洗干凈，晾干備用[16]。重金屬離子濃度及范圍依據(jù)中華人民共和國國家土壤環(huán)境質量標準(GB15618-2008)進行設定。試驗使用的金屬離子：ZnSO4·7H2O和CuSO4·5H2O均為分析純。其溶液濃度分別為：Cu2+(20，40，80，160，300 mg·L-1)，Zn2+(200，300，500，700，900 mg·L-1)，以超純水為對照(CK)。

種子萌發(fā)在RXZ智能光照培養(yǎng)箱內(nèi)進行。培養(yǎng)皿內(nèi)鋪雙層濾紙，排25粒種子，4次重復，并分別加入配制好的Cu2+，Zn2+溶液8 mL[17]。發(fā)芽條件為20℃/30℃，12 h/12 h(低溫/高溫)，12 h/12 h(黑暗/光照)，光照強度4 000 Lx[18]。試驗周期為15 d，期間每隔2 d用萬分之一天平稱重并使用超純水補充水分，使溶液濃度保持不變[18]。以芽長超過種子本身長度的1/2作為發(fā)芽標準，每天統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)[15]。第5 d統(tǒng)計發(fā)芽勢。第15 d統(tǒng)計種子發(fā)芽率并測定芽長、根長及葉綠素、丙二醛含量和相對電導率值。

1.2.2測定指標方法 發(fā)芽率(Germination percentage)=(發(fā)芽種子數(shù)/100)×100%；發(fā)芽勢(Germination vigor)=(5 d內(nèi)種子發(fā)芽數(shù)/100)×100%；根長(Root length)和芽長(Bud length)的測定：從每個濃度的培養(yǎng)皿內(nèi)隨機取20 株幼苗，用直尺測量，取平均值[19]。葉綠素含量測定采用丙酮浸提法[20]，細胞質膜透性測定采用電導儀法，丙二醛含量測定采用硫代巴比妥酸法[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行分析。采用Tukey’s HSD檢驗，對各處理的差異進行比較(P<0.05)。使用線性回歸方程用來確定相關指標與金屬脅迫之間的關系。

2 結果與分析

2.1 Cu2+，Zn2+對種子萌發(fā)的影響

隨著Cu2+溶液濃度的升高，垂穗披堿草種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢表現(xiàn)為下降趨勢(表1)，且Cu2+溶液濃度越高，抑制作用越顯著。160 mg·L-1Cu2+處理下，種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢均顯著下降(P<0.05)。300 mg·L-1Cu2+處理下，種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢均受到了極顯著抑制(P<0.01)。

隨著Zn2+溶液濃度的升高，種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢表現(xiàn)為先升后降的趨勢(表2)。200 mg·L-1Zn2+處理下，種子發(fā)芽率高于對照組，但差異不顯著。500 mg·L-1Zn2+處理下，種子發(fā)芽率顯著下降(P<0.05)。700 mg·L﹣1Zn2+處理下，種子發(fā)芽勢下降顯著(P<0.05)。

Cu2+，Zn2+離子脅迫對垂穗披堿草根和芽的生長影響較大(圖1、圖2)。垂穗披堿草根長隨Cu2+，Zn2+溶液濃度的升高呈先升后降趨勢。20 mg·L-1Cu2+處理下，根長略高于對照組，之后隨著Cu2+溶液濃度的升高表現(xiàn)為下降趨勢。80 mg·L-1Cu2+處理組與對照組相比，根長和芽長均顯著下降(P<0.05)。

與Cu2+處理變化相似，垂穗披堿草種子在200 mg·L-1Zn2+處理下其根長高于對照，但差異不顯著，之后隨著Zn2+溶液濃度的升高而表現(xiàn)為下降趨勢。900 mg·L-1Zn2+處理下，垂穗披堿草芽長與對照組相比差異顯著(P<0.05)；Zn2+≥700 mg·L-1處理下的根長與對照組相比差異顯著(P<0.05)。

表1 Cu2+對種子萌發(fā)影響Table 1 Effects of Cu2+ on the seed germination

注：同行中，不同小寫字母差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母差異極顯著(P<0.01)。下同

Note:In the same row,different lowercase letters represent significant differences at the 0.05 level,different capital letters represent significant differences at the 0.01 level.The same as below

表2 Zn2+對種子萌發(fā)影響Table 2 Effects of Zn2+ on the seed germination

圖1 Cu2+對垂穗披堿草根長和芽長的影響Fig.1 Effects of Cu2+ on the root lengthand shoot length of Elymus nutans

圖2 Zn2+對垂穗披堿草根長和芽長的影響Fig.2 Effects of Zn2+ on the root length andshoot length of Elymus nutans

2.2 Cu2+，Zn2+對幼苗葉片生理指標的影響

隨著Cu2+，Zn2+溶液濃度的升高，幼苗葉片葉綠素a、葉綠素b含量不斷下降(表3、表4)。與對照組相比，80 mg·L-1Cu2+和500 mg·L-1Zn2+溶液濃度處理下垂穗披堿草幼苗葉片葉綠素a和葉綠素b含量下降顯著(P<0.05)。300 mg·L-1Cu2+和900 mg·L-1Zn2+處理下，葉綠素a和葉綠素b含量均達到了最低水平，較對照組分別降低了10.97 mg·L-1，7.95 mg·L-1和10.15 mg·L-1，7.61 mg·L-1。通過線性回歸分析可知，Cu2+溶液濃度與葉片葉綠素a和葉片葉綠素b含量的關系分別為y=—2.13x+13.81(R2=0.94)，y=—1.65x+11.43(R2=0.99)；Zn2+溶液濃度與葉片葉綠素a和葉片葉綠素b含量的關系分別為y=-1.18x+13.55(R2=0.92)，y=-1.01x+10.08(R2=0.95)。

垂穗披堿草幼苗葉片MDA含量隨著Cu2+，Zn2+溶液濃度的升高呈上升趨勢。通過線性回歸分析可知，Cu2+溶液濃度與葉片MDA含量的關系為y=6.05x-0.7(R2=0.95)；Zn2+溶液濃度與葉片MDA含量的關系為y=3.76x-1.84(R2=0.99)。

幼苗葉片相對電導率值隨著Cu2+，Zn2+溶液濃度的升高而增大。當Cu2+溶液濃度為80 mg·L-1和Zn2+溶液濃度為500 mg·L-1時，葉片相對電導率值與對照組相比差異顯著(P<0.05)；300 mg·L-1Cu2+和900 mg·L-1Zn2+處理下，幼苗葉片相對電導率值均達到了最高水平。通過線性回歸分析可知，Cu2+溶液濃度與葉片相對電導率的關系為y=5.89x+2.8(R2=0.98)；Zn2+溶液濃度與葉片相對電導率的關系為y=3.41x+3.14(R2=0.99)。

表3 Cu2+對幼苗葉片生理指標的影響Table 3 Effects of Cu2+ on Physiological Indexes of seedling Leaves

表4 Zn2+對幼苗葉片生理指標的影響Table 4 Effects of Zn2+ on Physiological Indexes of seedling Leaves

3 討論

研究表明，低濃度金屬溶液對牧草有促進作用而高濃度金屬溶液則對牧草有抑制作用[21-22]。本研究也證實了這一點，隨著Zn2+溶液濃度的升高，種子發(fā)芽率呈先升后降趨勢，其中200 mg·L-1的Zn2+溶液對垂穗披堿草種子發(fā)芽率具有促進作用?？赡苁且欢舛鹊腪nSO4刺激了種子內(nèi)部的酶系統(tǒng)，提高了種子的活力。這與于鳳鳴等[23]鋅對高羊茅(Festucaelata)種子萌發(fā)及生理指標的影響研究結果相似。當Zn2+溶液濃度高于300 mg·L-1時，垂穗披堿草種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢出現(xiàn)了下降趨勢，可能是ZnSO4使種子內(nèi)部酶活力下降甚至死亡從而降低了種子的萌發(fā)數(shù)。垂穗披堿草對Cu2+脅迫是比較敏感的。隨著Cu2+溶液濃度的升高，垂穗披堿草種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢均出現(xiàn)了不同程度的下降現(xiàn)象。可能是銅的富集作用使種子萌發(fā)所需物質和能量的供應受阻，從而降低了種子萌發(fā)率[24]。

20 mg·L-1Cu2+和200 mg·L-1Zn2+處理下的垂穗披堿草種子根長略長于對照組，但差異不顯著，表明輕度金屬脅迫下，垂穗披堿草將更多的生物量、養(yǎng)分等資源集中于根部生長。這是垂穗披堿草對外界金屬脅迫環(huán)境的適應性調節(jié)反應，對于其在適應輕度金屬污染的土壤環(huán)境具有重要意義。Cu2+，Zn2+脅迫抑制了垂穗披堿草芽的伸長，且隨著Cu2+，Zn2+脅迫的增強，抑制作用越大?？赡苁歉邼舛扰囵B(yǎng)液使大量Cu2+，Zn2+富集在垂穗披堿草根部，抑制了根的伸長，最終影響到整個植株的生長[25]。

葉綠素含量是反映植物和逆境關系的重要指標，且正常情況下與脅迫程度呈負相關[26-27]。本試驗中，幼苗葉片葉綠素a和b均隨Cu2+，Zn2+溶液濃度的升高而降低。這與多人研究結果相類似[28-29]。Cu2+，Zn2+金屬脅迫使幼苗葉片葉綠素含量下降的機理尚未明確，可能是金屬毒害離子抑制了葉綠體內(nèi)的酶活性，導致葉綠素含量下降；也可能是Cu2+，Zn2+離子毒害使葉片產(chǎn)生過多自由基直接導致葉綠素分子結構破壞[30]。

相對電導率和MDA含量是鑒別植物細胞膜破壞程度的重要指標。本研究表明，隨著Cu2+，Zn2+溶液濃度的升高，幼苗葉片的相對電導率和MDA含量持續(xù)上升?？赡苁且驗楦邼舛鹊腃u2+，Zn2+脅迫使細胞膜結構發(fā)生改變，導致細胞內(nèi)的一些可溶性物質外滲，增大了膜的滲透性[31]。

4 結論

Cu2+離子脅迫抑制了垂穗披堿草種子萌發(fā)，并對其根和芽的伸長產(chǎn)生抑制效應。低濃度的Zn2+脅迫對種子萌發(fā)具有促進作用，且在200 mg·L-1Zn2+處理下種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢及胚根長等均達到了最優(yōu)值；500 mg·L-1