周 晶1， 王傳旗， 包賽很那， 王小川， 梁 莎， 苗彥軍

(1.中交和美環(huán)境生態(tài)建設(shè)有限公司， 湖北 武漢 430052； 2.西藏農(nóng)牧學(xué)院， 西藏 林芝 860000)

干旱是一個長期存在的全球性問題，受到廣泛關(guān)注[1]。有著“世界屋脊”和“地球第三極”之稱的西藏，由于喜馬拉雅山脈阻擋了來自印度洋暖濕氣流的進(jìn)入，加上全球氣候變暖以及青藏高原的隆升，西藏地區(qū)的干旱情況越來越嚴(yán)重，已成為嚴(yán)重限制西藏地區(qū)牧草產(chǎn)量及其品質(zhì)的關(guān)鍵因素。因此，抗旱性草種的開發(fā)利用成為西藏地區(qū)半人工草地及人工草地種植的關(guān)鍵。 垂穗披堿草(ElymusnutansGriseb.)為禾本科披堿草屬牧草，是西藏高寒草甸植被群落中具有代表性的禾本科草種之一[2]。其生態(tài)適應(yīng)性廣，具有保持水土、抗旱、耐寒等優(yōu)點[3]，在保護(hù)生態(tài)環(huán)境方面具有重要的意義。目前，垂穗披堿草已成為西藏地區(qū)栽培草地最適宜的草種之一，同時也是西藏地區(qū)鄉(xiāng)土禾草種質(zhì)資源重點開發(fā)利用的對象。嚴(yán)青等研究發(fā)現(xiàn)，在PEG濃度為5%時，垂穗披堿草相對萌發(fā)率呈下降趨勢[4]；盧素錦等研究認(rèn)為，隨著干旱脅迫天數(shù)的增加，葉綠素含量呈下降趨勢而丙二醛和可溶性糖含量都顯著增加[5]。本試驗以西藏申扎縣野生垂穗披堿草為研究對象，探討了不同干旱脅迫強度和連續(xù)干旱脅迫天數(shù)對其種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，以及可能的生理機制，研究結(jié)果將為西藏鄉(xiāng)土禾草種質(zhì)資源的開發(fā)利用和抗旱性鑒定提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料于2015年9月采自西藏那曲區(qū)申扎縣(30°56′N，88°45′E，海拔4 793 m)，陰坡、沙壤。

1.2 試驗方法

選取籽粒飽滿、大小均一、成熟的種子，用2%NaClO溶液浸種15 min，然后用超純水沖洗干凈備用[6]。

1.2.1溫度試驗設(shè)置

恒溫設(shè)置為10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃和30 ℃，變溫設(shè)置為10 ℃/20 、15 ℃/25 ℃、20 ℃/30 ℃、25 ℃/35 ℃。

1.2.2干旱試驗設(shè)置

配制0(ck)，0.05，0.10，0.15 g·mL-1和0.20 g·mL-1等質(zhì)量濃度的聚乙二醇(PEG-6000)溶液，用以模擬不同的干旱條件。依據(jù)Michel[7]的計算公式，與之相對應(yīng)的溶液水勢梯度大約為0、-0.10、-0.20、-0.40、-0.80 MPa。培養(yǎng)溫度為20 ℃/30 ℃。

表1 恒溫對種子萌發(fā)率、發(fā)芽勢的影響

項目溫度/℃1015202530萌發(fā)率/%9.00±1.22aA20.00±2.07aA55.00±2.61bA70.00±3.15cB64.00±3.42cB發(fā)芽勢/%5.00±0.73aA11.00±1.14aA26.00±2.5bA37.00±2.37cB25.00±2.61bA

注：同行中不同大寫字母表示0.01水平差異，不同小寫字母表示0.05水平差異。下同。

種子萌發(fā)試驗在PXZ光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行。每個塑料發(fā)芽盒放入25粒種子，每個溫度和干旱處理各4個重復(fù)。每天12 h/12 h(低溫/高溫)，12 h/12 h(光照/黑暗)。以胚根與種子本身等長作為種子發(fā)芽的標(biāo)志。每天觀察種子萌發(fā)情況，并及時清理發(fā)霉腐爛的種子。試驗周期為15 d。每隔2 d用萬分之一天平稱重1次，并使用超純水補充水分。

1.2.3苗期試驗設(shè)置

試驗采用盆栽育苗法。在西藏農(nóng)牧學(xué)院草業(yè)科學(xué)教學(xué)實習(xí)基地取大田土壤過篩，并拌入適量腐熟羊糞，放入105 ℃烘干箱內(nèi)烘3 h，待土壤冷卻后裝入塑料花盆中(20 cm×15 cm×25 cm)。盆底鋪墊雙層濾紙，每盆放入過篩的大田土3 kg并播種150粒種子。育苗階段在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，培養(yǎng)條件同干旱試驗設(shè)置，共種9盆。當(dāng)垂穗披堿草種子萌發(fā)率達(dá)到75%時，從人工氣候箱中移出，放置自然光照下培養(yǎng)。在垂穗披堿草2葉齡時對其進(jìn)行間苗，保證每盆100株幼苗；在垂穗披堿草幼苗5葉齡時開始進(jìn)行干旱脅迫。試驗前1 d對每盆材料進(jìn)行澆水處理，并以正常澆水1 d后的垂穗披堿草作為干旱脅迫對照(ck)。之后，每干旱脅迫7 d取樣1次，干旱脅迫21 d，共取3次。試驗取樣時間為09：00～10：00時，取相同葉位。

1.3 測定指標(biāo)

1.3.1種子萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)的測定

萌發(fā)率(%)=(最終正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽勢(%)=(第5天正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

萌發(fā)指數(shù)=∑(Gt/Dt)，式中：Gt指t日萌發(fā)數(shù)，Dt指相應(yīng)的天數(shù)[8]；

活力指數(shù)=萌發(fā)指數(shù)×平均根長[9]。

胚根和胚芽長的測定：從每個處理的塑料發(fā)芽盒內(nèi)隨機選取15株正常生長的幼苗，用直尺進(jìn)行胚根和胚芽長的測量，不夠15株的全部都測，取平均值[10]。每個萌發(fā)指標(biāo)3次重復(fù)，取平均值。

1.3.2幼苗葉片生理指標(biāo)的測定

生理指標(biāo)的測定參照高俊鳳[11]和張志良[12]的方法。

葉綠素含量測定采用丙酮浸提法；相對電導(dǎo)率測定采用電導(dǎo)儀法；丙二醛含量測定采用硫代巴比妥酸法；超氧化物歧化酶活性測定采用NBT還原法；過氧化物酶活性測定采用愈創(chuàng)木酚比色法；過氧化氫酶活性測定采用紫外吸收法；脯氨酸含量測定采用酸性茚三酮染色法。每個生理指標(biāo)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 耐旱性綜合評價

利用隸屬函數(shù)法對西藏野生垂穗披堿草耐旱性進(jìn)行綜合評價。隸屬函數(shù)公式：U(Xi) =(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin) ；當(dāng)性狀指標(biāo)與抗逆性為負(fù)相關(guān)時用公式：U(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)計算。其中，U(Xi)為隸屬函數(shù)值；Xi為處理水平某指標(biāo)測定值；Xmin和Xmax為相應(yīng)處理水平某一指標(biāo)的最小值和最大值。用隸屬函數(shù)公式分別計算垂穗披堿草各項指標(biāo)的具體隸屬函數(shù)值[13]。然后把材料各項指標(biāo)隸屬函數(shù)值累加求平均值，即得到該材料的隸屬度[14]。垂穗披堿草抗旱性強弱參照隸屬度的四級制劃分標(biāo)準(zhǔn)[7]。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用DPS 6.0統(tǒng)計分析軟件對所測數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，樣本間的差異顯著性用Tukey’HSD檢驗，圖表用WPS軟件制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對西藏野生垂穗披堿草種子萌發(fā)的影響

2.1.1恒溫對種子萌發(fā)的影響

由表1可知，溫度對垂穗披堿草種子萌發(fā)率具有極顯著影響(p<0.01)。整體上，垂穗披堿草種子萌發(fā)率隨著溫度的上升表現(xiàn)為先升后降的趨勢。25 ℃處理下，垂穗披堿草種子萌發(fā)率最高，在10 ℃處理下其種子萌發(fā)率最低。

與萌發(fā)率變化趨勢相似，垂穗披堿草種子發(fā)芽勢整體上隨溫度的升高而呈先升后降的趨勢(表1)。垂穗披堿草種子發(fā)芽勢在10 ℃處理下最低，在25 ℃處理下最高。15 ℃處理下，垂穗披堿草種子發(fā)芽勢較對照差異不顯著；20 ℃處理下，垂穗披堿草發(fā)芽勢較對照差異顯著(p<0.05)；25 ℃處理下，垂穗披堿草種子發(fā)芽勢較對照差異極顯著(p<0.01)。

表2 變溫對種子萌發(fā)率、發(fā)芽勢的影響

項目溫度/℃10/2015/2520/3025/35萌發(fā)率/%35.00±2.17aA65.00±4.05bA82.00±4.84cB60.00±3.36bA發(fā)芽勢/%19.00±2.43aA29.00±2.31aA49.00±3.67cB35.00±1.65bA

表3 干旱脅迫對種子萌發(fā)的影響

項目聚乙二醇PEG滲透勢/MPa0-0.10-0.20-0.40-0.80萌發(fā)率/%82.00±3.67aA66.00±5.84aA35.00±4.63bA16.00±4.76cB9.00±2.76cB萌發(fā)指數(shù)33.50±3.75aA25.75±1.56aA13.75±3.45bB7.75±1.69bB4.25±1.22bB活力指數(shù)160.80±11.65aA115.62±10.33aA57.48±9.02bA28.83±6.33cB9.86±1.90cB

2.1.2變溫對種子萌發(fā)的影響

變溫對垂穗披堿草種子萌發(fā)率、發(fā)芽勢具有極顯著的影響(p<0.01)(表2)。以20/30℃為界，垂穗披堿草種子萌發(fā)率和發(fā)芽勢隨著溫度的升高表現(xiàn)為先升后降的趨勢。20/30℃處理下，垂穗披堿草種子萌發(fā)率、發(fā)芽勢均達(dá)到了最高水平。

由表2可知，20 ℃/30 ℃處理下，垂穗披堿草種子萌發(fā)率水平最高。其中，15 ℃/25 ℃處理下垂穗披堿草較對照差異顯著(p<0.05)；在20 ℃/30 ℃處理下，垂穗披堿草較對照存在極顯著差異(p<0.01)。20 ℃/30 ℃處理下，垂穗披堿草發(fā)芽勢最高。15 ℃/25 ℃處理下，與對照相比，種子發(fā)芽勢差異不顯著；20 ℃/30 ℃處理下，垂穗披堿草發(fā)芽勢較對照差異極顯著(p<0.01)。

2.2 干旱脅迫對西藏野生垂穗披堿草種子萌發(fā)的影響

PEG滲透脅迫對垂穗披堿草種子萌發(fā)具有極顯著影響(p<0.01)(表3)。研究顯示，隨著PEG溶液濃度的升高，種子萌發(fā)率、萌發(fā)指數(shù)和活力指數(shù)呈下降趨勢。-0.20 MPa滲透勢下，種子萌發(fā)率、萌發(fā)指數(shù)和活力指數(shù)較對照下降顯著(p<0.05)。-0.80 MPa滲透勢下，垂穗披堿草種子萌發(fā)率、萌發(fā)指數(shù)和活力指數(shù)均達(dá)到最低水平。

表4 垂穗披堿草種子萌發(fā)期抗旱指標(biāo)隸屬函數(shù)值及隸屬度

萌發(fā)率萌發(fā)指數(shù)活力指數(shù)胚根長胚芽長隸屬度0.430.450.440.640.580.51

隨著PEG溶液濃度的升高，垂穗披堿草胚根和胚芽長呈下降趨勢(圖1)。系列PEG滲透勢處理下，種子胚根和胚芽長均無顯著下降。其中，垂穗披堿草胚根和胚芽長在-0.80 MPa滲透勢下最低，在對照培養(yǎng)條件下最高。

圖1 干旱脅迫對西藏垂穗披堿草根長和芽長的影響

采用隸屬函數(shù)法對西藏野生垂穗披堿草種子萌發(fā)率、萌發(fā)指數(shù)、活力指數(shù)、胚根長和胚芽長等指標(biāo)進(jìn)行了綜合評價，得出其隸屬度依次為0.43，0.45，0.44，0.64，0.58(表4)。垂穗披堿草種子萌發(fā)期抗旱隸屬度為0.51，在0.4～0.6之間。

2.3 干旱脅迫對西藏野生垂穗披堿草幼苗葉片生理指標(biāo)的影響

由表5可知，西藏垂穗披堿草幼苗葉片葉綠素a和葉綠素b含量隨著干旱脅迫天數(shù)的延長而持續(xù)下降。干旱脅迫到第14天時，與對照相比，幼苗葉片葉綠素a含量下降顯著(p<0.05)。當(dāng)干旱脅迫到第21天時，幼苗葉片葉綠素b含量較對照下降顯著(p<0.05)，且葉片葉綠素a和葉綠素b含量均降到了最低水平。

西藏垂穗披堿草幼苗葉片相對電導(dǎo)率隨著干旱脅迫天數(shù)的延長而呈不斷上升的趨勢(表5)。干旱脅迫第7天時，幼苗葉片相對電導(dǎo)率較對照上升顯著(p<0.05)。干旱脅迫至第14天時，幼苗葉片相對電導(dǎo)率較對照差異極顯著(p<0.01)。

干旱脅迫天數(shù)對西藏垂穗披堿草幼苗葉片丙二醛(MDA)和脯氨酸(Pro)含量具有極顯著的影響(p<0.01)(表5)。隨著干旱脅迫天數(shù)的增加，MDA、Pro含量呈先升后降的趨勢。當(dāng)干旱脅迫至第14天時，幼苗葉片MDA和Pro含量達(dá)到最高水平。干旱脅迫到第21天，葉片MDA和Pro含量出現(xiàn)了小幅度的下降。

表5 干旱脅迫天數(shù)對西藏垂穗披堿草幼苗葉片生理指標(biāo)的影響

項 目 干旱脅迫天數(shù)/d071421葉綠素a/(mg·L-1)11.42±1.22aA9.96±1.31aA5.32±0.62bA2.06±0.35bA葉綠素b/(mg·L-1)8.95±1.10aA6.23±1.06aA3.16±0.92aA1.21±0.27bA丙二醛/(mmol·g-1)5.53±1.72aA27.18±3.21bA36.96±5.07cB33.42±5.16cB超氧化物歧化酶/[U·(g·min)-1]22.64±6.36aA39.91±7.09aA62.74±7.89bA57.65±6.44bA過氧化物酶/[U·(g·min)-1]129.00±10.38aA210.33±16.24bA293.80±15.63bA277.80±15.25bA過氧化氫酶/[U·(g·min)-1]10.42±1.35aA20.14±3.86bA26.41±5.93bA23.71±4.82bA脯氨酸/(μg·g-1)9.8±3.54aA23.70±7.20bA68.50±6.76cB65.90±8.42cB相對電導(dǎo)率/(μS·cm-1)10.83±3.14aA25.10±5.33bA48.40±5.87cB51.30±4.69cB

表6 西藏垂穗披堿草苗期抗旱指標(biāo)隸屬函數(shù)值及隸屬度

葉綠素a葉綠素bMDASODCATPODPro相對電導(dǎo)率隸屬度0.4590.5690.6470.5750.5980.6100.5500.5700.553

與MDA和Pro變化趨勢相似，西藏垂穗披堿草幼苗葉片超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性均隨干旱脅迫天數(shù)的增加而呈先升后降的趨勢(表5)。其中，葉片SOD、POD、CAT活性分別在干旱脅迫至第14天、14天和第7天時，較對照出現(xiàn)了顯著的升高(p<0.05)。通過多項式回歸分析得出：干旱脅迫天數(shù)與垂穗披堿草幼苗葉片SOD活性的關(guān)系為：y=-5.59x2+40.74x-14.18(R2=0.94)；干旱脅迫天數(shù)與垂穗披堿草幼苗葉片POD活性的關(guān)系為：y=-24.33x2+174.65x-26.40(R2=0.97)；干旱脅迫天數(shù)與西藏垂穗披堿草幼苗葉片CAT活性的關(guān)系為：y=-3.15x2+20.39x-7.25(R2=0.99)。采用隸屬函數(shù)法對西藏野生垂穗披堿草葉綠素a、葉綠素b、MDA、SOD、POD、CAT、脯氨酸、相對電導(dǎo)率等指標(biāo)進(jìn)行了綜合評價，得出其隸屬度依次為0.459，0.569，0.647，0.575，0.598，0.610，0.550，0.570(表6)。西藏垂穗披堿草幼苗期抗旱隸屬度為0.553，在0.4～0.6之間。

3 結(jié)果討論

3.1 溫度對西藏野生垂穗披堿草種子萌發(fā)的影響

研究表明，低溫是限制種子萌發(fā)并形成幼苗的關(guān)鍵因子[15-16]。本試驗也證實了這一點，西藏垂穗披堿草在恒溫10 ℃和變溫10 ℃/20 ℃培養(yǎng)條件下其萌發(fā)率和發(fā)芽勢最低，分別為9.00%、35.00%和5.00%、19.00%，可能是低溫抑制了種子內(nèi)部的酶活性，進(jìn)而影響了種子的萌發(fā)[17]。恒溫25 ℃和變溫20 ℃/30 ℃處理下，西藏垂穗披堿草種子萌發(fā)率和發(fā)芽勢最高，分別為71.00%、82.00%和37.00%、49.00%，可能是該溫度提高了酶的活性，促進(jìn)了種子萌發(fā)。這與王傳旗等[18]關(guān)于西藏浪卡子縣野生垂穗披堿草種子萌發(fā)對水鹽脅迫的響應(yīng)研究結(jié)果相類似。此外，西藏垂穗披堿草種子萌發(fā)率、發(fā)芽勢在變溫20 ℃/30 ℃處理下比恒溫25 ℃處理下分別提高了11.00%和12.00%。說明變溫更有利于西藏垂穗披堿草種子萌發(fā)。這與葛慶征等[19]關(guān)于溫度對垂穗披堿草種子萌發(fā)的影響結(jié)果相似。

3.2 干旱脅迫對西藏野生垂穗披堿草種子萌發(fā)生理的影響

聚乙二醇(PEG-6000)是一種較理想的高分子滲透劑，可以最大限度的減少天氣、土壤和蒸騰等環(huán)境因素的影響[20]。本研究對西藏野生垂穗披堿草種子萌發(fā)率、萌發(fā)指數(shù)、活力指數(shù)及胚根和胚芽長度等5項指標(biāo)進(jìn)行綜合抗旱性分析表明，種子萌發(fā)率、萌發(fā)指數(shù)、活力指數(shù)及胚根、胚芽長等隨著PEG-6000溶液濃度的升高而呈下降趨勢。0～-0.10 MPa滲透勢下，西藏垂穗披堿草種子萌發(fā)率在65%以上；當(dāng)PEG滲透勢為-0.20 MPa時，種子萌發(fā)率則顯著下降(p<0.05)；當(dāng)PEG滲透勢為-0.80 MPa時，西藏垂穗披堿草萌發(fā)率不足10%，較對照差異極顯著(p<0.01)。垂穗披堿草胚根和胚芽長在-0.80 MPa的滲透勢下較對照下降顯著(p<0.05)。干旱脅迫抑制了西藏野生垂穗披堿草種子萌發(fā)。這一特性與王傳旗等[21]對賴草種子的水溫脅迫研究結(jié)論基本一致。

3.3 干旱脅迫對西藏野生垂穗披堿草幼苗葉片生理的影響

干旱脅迫會造成葉綠體的變形和片層結(jié)構(gòu)的破壞，使葉綠素含量減少[22]，本研究顯示，西藏垂穗披堿草幼苗葉片葉綠素a和葉綠素b含量隨著干旱脅迫天數(shù)的增加而下降，這與祁娟等[23]報道一致。MDA含量是鑒別植物細(xì)胞膜破壞程度的重要指標(biāo)之一。張小嬌等[24]研究表明，隨著干旱脅迫天數(shù)的延長垂穗披堿草MDA含量呈上升趨勢。本試驗也證實了這一點，西藏垂穗披堿草幼苗葉片MDA含量隨著干旱脅迫天數(shù)的增加而升高，當(dāng)干旱脅迫至第21天時則出現(xiàn)了下降的現(xiàn)象，可能是植物葉片枯萎所致。研究顯示，隨著干旱脅迫天數(shù)的增加垂穗披堿草幼苗葉片SOD、POD和CAT活性出現(xiàn)了不同程度的上升趨勢，在干旱脅迫至第14天時，SOD、POD、CAT活性明顯均達(dá)到峰值。說明這3種酶在清除自由基時形成互補，可以使垂穗披堿草在干旱逆境下免受傷害。西藏垂穗披堿草幼苗葉片脯氨酸含量隨著干旱脅迫天數(shù)的延續(xù)而增加。當(dāng)連續(xù)干旱脅迫至第7天時，葉片脯氨酸的含量顯著增加(p<0.05)。這與祁娟等[25]對披堿草與老芒麥苗期抗旱性綜合評價結(jié)論相類似。當(dāng)干旱脅迫至第21天時幼苗葉片脯氨酸出現(xiàn)了小幅度的下降現(xiàn)象?？赡苁撬置{迫到一定程度時，脯氨酸的積累就會慢慢減少或消失。西藏垂穗披堿草幼苗葉片相對電導(dǎo)率隨著干旱脅迫天數(shù)的增加而呈不斷上升的趨勢?？赡苁歉珊得{迫破壞了細(xì)胞膜的完整性，使細(xì)胞內(nèi)的一些可溶性物質(zhì)外滲[26]。這與靳軍英等[27]3種牧草對干旱脅迫的生理響應(yīng)及抗旱性評價研究結(jié)果相一致。

西藏野生垂穗披堿草適宜萌發(fā)溫度為恒溫25 ℃、30 ℃和變溫15 ℃/25 ℃、20 ℃/30 ℃，種子萌發(fā)率可達(dá)60%以上。垂穗披堿草種子萌發(fā)期和苗期抗旱隸屬度均在0.4～0.6之間，屬于Ⅱ級較抗。因此，西藏野生垂穗披堿草在西藏干旱和半干旱地區(qū)建植人工或半人工栽培草地具有較大的應(yīng)用潛力，可作為西藏鄉(xiāng)土禾草抗旱性育種的重要種質(zhì)資源開發(fā)利用。